Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và tách chiết kháng sinh dihydrochalcomycin từ xạ khuẩn streptomyces KCTC 0041BP

MỞ ĐẦU Từ xa xưa người ta biết sử dụng nấm để chữa trị chứng viêm, chữa trị vết thương cách áp rêu lên vết thương cho chóng khỏi, chí mẩu bánh mỳ mốc sử dụng để chữa trị vết thương chuyện xảy trước Alexander Flemming phát tác dụng kháng sinh Nhà vi khuẩn học người Anh - Alexander Flemming với Howara Walter Florey Ernst Boris Chaen mở kỷ nguyên cho ngành y học Công nghệ sản xuất kháng sinh ứng dụng điều trị bệnh - nhờ phát penicillin Tuy nhiên chiết penicillin tinh khiết thử nghiệm người Đến năm 1941, penicillin lên men quy mô công nghiệp để phục vụ điều trị cho thương binh chiến tranh Ngày người phát 10000 chất kháng sinh có khoảng 50 loại sử dụng rộng rãi Hiện nay, tình trạng lạm dụng kháng sinh nhiều nguyên nhân khác dẫn tới nguy vi khuẩn kháng thuốc ngày tăng Vì vậy, kèm với biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý việc nghiên cứu sản xuất kháng sinh có nhiều đặc tính ưu việt thực cần thiết Cùng với việc tạo kháng sinh đường tổng hợp bán tổng hợp việc tìm kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật giữ vị trí quan trọng Chi Streptomyces gồm nhiều xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc, đặc điểm kháng khuẩn Một số loài có khả kháng tế bào ung thư HIV Bởi mà nay, không Việt Nam mà nước giới phân lập nghiên cứu rộng rãi đặc biệt phù hợp với định hướng phát triển công nghiệp dược nước ta Trên sở đó, tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả sinh tổng hợp tách chiết kháng sinh Dihydrochalcomycin từ xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP” Mục tiêu nghiên cứu là: Nghiên cứu khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP Nghiên cứu tách chiết thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh Nghiên cứu quy trình lên men quy trình thu nhận kháng sinh thô Nghiên cứu phân tích sản phẩm kháng sinh Những điểm luận văn: + Đây nghiên cứu sinh tổng hợp Dihydrochalcomycin từ xạ khuẩn Việt Nam + Bước đầu nghiên cứu đặc điểm sinh học, khảo sát khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP từ xây dựng quy trình thu nhận kháng sinh thô Dihydrochalcomycin Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 KHÁNG SINH 1.1.1 Khái niệm kháng sinh Theo Waksman (1942), kháng sinh sản phẩm trao đổi chất tự nhiên vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật khác Tuy nhiên ngày để khái quát thuật ngữ này, người ta định nghĩa kháng sinh hợp chất nguồn gốc tự nhiên tổng hợp có tác dụng ức chế tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật gây bệnh, đồng thời tác dụng tác dụng yếu lên người, động vật thực vật đường cung cấp chung (Cao Văn Thu, 2000) Nồng độ thấp chất kháng sinh (CKS) có khả ức chế hoàn toàn sinh trưởng một vài chủng vi sinh vật xác định, gọi nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) Chất kháng sinh có giá trị nồng độ ức chế tối thiểu với vi sinh vật mà thấp có hoạt tính kháng sinh cao vi sinh vật (Hopwood, 2007) Các chất kháng sinh có phổ tác dụng khác nhau, ví dụ: cloramphenicol tetracyclin có tác dụng nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nên xếp vào loại kháng sinh có phổ tác dụng rộng, số kháng sinh khác có tác dụng loại vi khuẩn nên xếp vào loại có phổ tác dụng hẹp Có chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Gram (+), có loại ức chế vi khuẩn Gram (-), có loại ức chế nấm men, nấm mốc nên phổ kháng khuẩn chúng rộng hẹp khác Phổ kháng khuẩn xem tiêu để phân loại chất kháng sinh (Hopwood, 2007) Độ lớn giá trị hoạt tính kháng sinh ml dung dịch (đơn vị/ml) hay mg chế phẩm (đơn vị/mg) thường thể đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan thể tích môi trường xác định (µg/ml), có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định, thời gian xác định Đơn vị kháng sinh quốc tế UI, ví dụ UI penicillin = 0,6 µg, UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007) 1.1.2 Phân loại kháng sinh Việc phân loại nhằm khái quát cách có hệ thống danh mục chất kháng sinh việc tìm chất kháng sinh ngày nhiều Nhờ tiết kiệm thời gian nghiên cứu chất kháng sinh cấu trúc hoá học, chế tác dụng khả ứng dụng chữa bệnh Có thể phân loại kháng sinh dựa nhiều phương diện phổ tác dụng, chế tác dụng, nguồn gốc, đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học phương pháp khoa học nhất, đưa nhìn tổng quát nhóm kháng sinh Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh phân thành nhóm (Cao Văn Thu, 2000): 1) Các kháng sinh cacbonhydrat 2) Các lacton macrocyclic 3) Các kháng sinh quinon dẫn xuất 4) Các kháng sinh peptid axit amin 5) Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ 6) Các kháng sinh dị vòng chứa oxy 7) Các kháng sinh mạch vòng no 8) Các kháng sinh chứa nhân thơm 9) Các kháng sinh mạch thẳng 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh Các kháng sinh ức chế khả sinh trưởng vi sinh vật qua việc ức chế phản ứng sinh tổng hợp đường trao đổi chất tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào vị trí xác hay phân tử đích tế bào vi sinh vật mà tạo phản ứng trao đổi chất Các đích tác dụng đặc trưng cho nhóm kháng sinh, nhiên nhiều trường hợp người ta chưa biết xác hết Có mức tác dụng khác tế bào vi khuẩn nấm: thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tổng hợp gen (sao chép dịch mã ADN), tổng hợp protein phiên mã mARN, trao đổi chất hô hấp trao đổi chất trung gian (Kiều Hữu Ảnh, 2007) Bảng 1.1: Cơ chế tác dụng số kháng sinh Mức tác dụng Ví dụ kháng sinh 1) Ức chế tổng hợp thành tế bào - Transpeptid hóa β-lactam (penicillin) - Tổng hợp murein Vancomycin, phosphomycin 2) Ức chế trình trao đổi chất màng tế bào - Thay đổi cấu trúc Polymicin, amphotericin - Thay đổi chức Gramicidin, sideromycin 3) Ức chế tổng hợp ADN - Phân chia Actinomycin, antracyclin - Dịch mã Anzamycin (rifamicin) 4) Ức chế tổng hợp protein - Ribosome Aminoglycosid - Liên kết t-RNA Erythromycin, chlorocid - Kéo dài Tetracyclin, axit fuzidic 5) Ức chế trình trao đổi chất hô hấp Antimycin, oligomycin 6) Ức chế trình trao đổi chất folat Sulfamid 1.1.4 Các nghiên cứu gần kháng sinh 1.1.4.1 Trên giới Năm 1999 kháng sinh liposomal HA-1-92 đời, tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces CDRIL - 312; tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng chất độc chuột, kháng sinh có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh (Jyoti Harindran cs, 1999) Năm 2002 Ấn Độ nhà khoa học phân lập chủng Streptomyces sp 201 có khả sinh chất kháng sinh z - methylheptyl isonicotinate, chất kháng sinh có khả kháng nhiều loại nấm gây bệnh Fusarium oxysporum, Fusarium solani, (Gojen cs 2002) Tại Nhật năm 2003, yatakemycin tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP - A0356 phương pháp sắc ký cột Chất kháng sinh có khả kìm hãm phát triển nấm Aspergillus Candida albicans Chất có khả chống lại tế bào ung thư có giá trị MIC 0,01 - 0,3 mg/ml (Đỗ Thu Hà, 2004) Tại Hàn Quốc năm 2007, người ta phân lập loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh chất kháng sinh laidlomycin, chất tiêu diệt tụ cầu kháng methicillin cầu khuẩn kháng vancomycin (Yoo cs, 2007) Việc sử dụng chất kháng sinh trồng trọt nhằm mục đích chống bệnh nấm gây rau trồng; chống bệnh vi khuẩn gây ra; diệt côn trùng cỏ dại; kiềm chế bệnh thực vật sinh từ đất So với thuốc hóa học, dùng chất kháng sinh bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, có khả ức chế vi sinh vật kháng thuốc hóa học Chất kháng sinh dịch lên men chất kháng sinh dùng xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên hạt, diệt bệnh phận nằm đất khử trùng đất (Đỗ Thu Hà, 2004) 1.1.4.2 Tại Việt Nam Ở Việt Nam, năm 1950 kháng chiến chống Pháp, giáo sư Đặng Văn Ngữ nuôi cấy Penicillium chrysogenum dung dịch chiết môi trường nuôi cấy để điều trị vết thương cho thương binh Năm 1968, môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) thành lập đào tạo cán chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công nghiệp kháng sinh năm 1970 đơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh thành lập Sau Việt Nam nhiều đối tác nước Liên Xô (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác giúp sản xuất điều chế kháng sinh xong không thành công nhiều nguyên nhân Năm 1985 - 1990 chương trình nghiên cứu Nhà nước 64C Bộ Y tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh oxytetracyclin tetracyclin kết đạt không cao công nghệ lẫn hiệu suất Từ năm 2000 đến nay, nước ta có số nhóm tham gia nghiên cứu kháng sinh thu số kết như: nghiên cứu quy trình lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 (Nguyễn Phương Nhuệ, 2010); nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế Doxorubicin tạo từ xạ khuẩn làm nguyên liệu điều chế thuốc điều trị ung thư hệ bạch huyết (Tạ Thị Thu Thủy, 2010) Ở Việt Nam sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản phân lập số chủng xạ khuẩn có khả chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn (Lê Như Kiểu cs, 2008) Fusarium oxysporum gây bệnh thối rễ thực vật (Bùi Việt Hà, 2006) Tuy nhiên việc sử dụng chất kháng sinh lĩnh vực bảo vệ thực vật nước ta mức độ thấp tập quán canh tác quen dùng số hóa chất bảo vệ thực vật định 1.2 XẠ KHUẨN 1.2.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên (Biền Văn Minh, 2000) Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trình hình thành đất tạo độ phì nhiêu cho đất, chúng đảm nhiệm nhiều chức khác việc làm màu mỡ đất Xạ khuẩn tham gia tích cực vào trình chuyển hóa phân giải nhiều hợp chất hữu phức tạp bền vững cellulose, chất mùn kitin, keratin Hầu hết xạ khuẩn thuộc giống Actiomyces có khả hình thành chất kháng sinh như: streptomycin, oramycin, terramycin,… Đây đặc điểm quan trọng xạ khuẩn nên sử dụng rộng rãi y học, thú y bảo vệ thực vật Trong trình trao đổi chất, xạ khuẩn sinh chất hữu loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), số axit hữu axit lactic, axit acetic; axit amin axit glutamic, metionin, tryptophan, lizin Xạ khuẩn dùng rộng rãi ngành công nghiệp lên men, chế tạo sản phẩm lên men ứng dụng men xạ khuẩn sinh nhiều proteinase, amylase, cellulase, kitinase,… Một số khác có khả tạo thành chất kích thích sinh trưởng thực vật Tuy nhiên bên cạnh xạ khuẩn có ích, số xạ khuẩn lại sinh chất độc kìm hãm sinh trưởng, phát triển trồng phát triển hệ vi sinh vật có ích đất, số khác lại nguyên nhân gây số bệnh khó chữa người gia súc Các bệnh gọi tên chung Actinomycosis 1.2.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Trước vị trí phân loại xạ khuẩn câu hỏi gây nhiều tranh luận nhà vi sinh vật học, có đặc điểm vừa giống vi khuẩn, vừa giống nấm Tuy nhiên đến xạ khuẩn chứng minh vi khuẩn * Khuẩn lạc (Lê Xuân Phƣơng, 2008) Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy thuộc loài điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc thường chắc, xù xì, có dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có lớp: lớp có sợi bện chặt, lớp tương đối xốp, lớp cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng ,… tuỳ thuộc vào loài điều kiện ngoại cảnh Kích thước hình dạng khuẩn lạc thay đổi tuỳ loài tuỳ vào điều kiện nuôi cấy thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm,… Đường kính khuẩn lạc chừng 0,52 mm có khuẩn lạc đạt tới đường kính cm lớn * Bào tử: Bào tử hình thành cuống sinh bào tử với phương pháp phân đoạn hay cắt khúc, thường có hình trụ, oval, hình cầu, với bề mặt nhẵn, xù xì, có gai,… (Nguyễn Lân Dũng cs, 2002) Nếu môi trường giàu dinh dưỡng trình hình thành bào tử bị kìm hãm Ngoài độ ẩm, nhiệt độ ảnh hưởng tới hình thành bào tử (Đỗ Thu Hà, 2004) Hình dạng kích thước cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử tính chất quan trọng phân loại xạ khuẩn * Khuẩn ty: Trên môi trường đặc, hệ sợi xạ khuẩn phát triển thành loại: loại cắm sâu vào môi trường gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất) với chức chủ yếu dinh dưỡng Một loại phát triển bề mặt môi trường gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh) với chức chủ yếu sinh sản Nhiều loại có hệ sợi chất có loại (như chi Sporichthya) lại có hệ sợi khí sinh Khi HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng cs, 1978) Hệ sợi xạ khuẩn giống hệ sợi nấm sợi phân nhánh vách ngăn Sợi xạ khuẩn mảnh sợi nấm mốc (hệ sợi chất: 0,3 - 0,8 µm; hệ sợi khí sinh: 1,14 µm) Xạ khuẩn phát triển theo phương pháp mọc chồi phân nhánh (khoảng 30 µm phân nhánh) Độ dài sợi xạ khuẩn giai đoạn phát triển khoảng 11 µm/h chất nhân tế bào xạ khuẩn xếp đặn theo chiều dài sợi (Waskman, 1961) Do đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi trương lên, sau - xuất trình tổng hợp ARN, nhân, gen cần thiết từ genom tiến hành tổng hợp protein, sợi hình thành phát triển Khuẩn ty lớp có chức sinh học khác Các sản phẩm trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ,… tích luỹ sinh khối tế bào xạ khuẩn hay tiết môi trường (A) (B) Hình 1.1 Hình dạng khuẩn lạc (A) dạng khuẩn ty xạ khuẩn (B) (Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01-02.htm) 10 Phụ lục Bảng 1: Kết khả ức chế số vi sinh vật kiểm định xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Vi sinh vật kiểm định D (mm) Độ lệch chuẩn s B subtilis 19,50 0,15 B cereus 21,33 0,12 B pumilus 14,67 0,21 E coli 12,66 0,18 Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn s: độ lệch chuẩn Bảng 2: Khả sinh trưởng chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP số môi trường Môi trƣờng Sinh khối (mg/ml) s Trong đó: ISP1 ISP2 ISP4 ISP8 ISP9 3,3 5,9 4,0 4,5 3,7 0,23 0,21 0,37 0,31 0,28 s: độ lệch chuẩn Bảng 3: Kết ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng Nhiệt độ (°C) 18 22 25 28 30 35 45 Sinh khối - 3,6 4,8 5,9 5,0 4,0 - - 0,38 0,26 0,38 0,31 0,25 - (mg/ml) s Trong đó: s: độ lệch chuẩn 70 Bảng 4: Kết ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả sinh trưởng Thời gian (giờ) 24 48 72 96 120 144 168 Sinh khối 2,4 3,5 5,4 6,1 5,9 5,8 5,5 - 0,25 0,36 0,21 0,34 0,23 0,29 0,32 (mg/ml) s Trong đó: s: độ lệch chuẩn Bảng 5: Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng pH 10 Sinh khối 0 3,3 5,6 6,0 5,8 5,0 2,3 - - 0,32 0,35 0,27 0,29 0,33 0,22 (mg/ml) s Trong đó: s: độ lệch chuẩn Bảng 6: Kết ảnh hưởng nồng độ đường tới khả sinh trưởng Nồng độ đƣờng glucose (%) 0,2 0,4 0,6 1,4 1,8 Sinh khối (mg/ml) 2,3 3,0 4,3 5,4 5,6 5,9 s 0,23 0,34 0,26 0,29 0,32 0,31 Trong đó: s: độ lệch chuẩn 71 Bảng 7: Hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP số môi trường STT Tên môi trƣờng ( D , mm) s A-4 21,6 0,26 A-4H 22,4 0,32 A9 21,2 0,39 R2YE 24,8 0,21 Gause-1 19,6 0,41 Gause-2 19,2 0,35 Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn s: độ lệch chuẩn Bảng 8: Kết ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh kháng sinh Nhiệt độ 20°C 22°C 24°C 26°C 28°C 30°C 32°C D (mm) 17,53 18,46 19,56 22,13 24,27 23,18 20,35 s 0,13 0,25 0,21 0,15 0,17 0,10 0,29 Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn s: độ lệch chuẩn 72 Bảng 9: Kết ảnh hưởng yếu tố thời gian đến khả sinh kháng sinh Thời gian 48 72 120 168 192 D (mm) 11,00 26,57 26,50 24,50 s 0,30 0,45 0,24 0,22 Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn s: độ lệch chuẩn Bảng 10: Kết ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh kháng sinh pH ban đầu 6,0 6,5 7,0 7,5 D (mm) 16,50 21,33 26,15 18,33 s 0,25 0,19 0,17 0,30 Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn s: độ lệch chuẩn Bảng 11: Kết ảnh hưởng độ thông khí đến khả sinh kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP Tốc độ lắc (vòng/phút) 50 100 150 200 250 D (mm) 12,47 14,50 22,78 23,10 23,14 s 0,12 0,21 0,24 0,32 0,27 Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn s: độ lệch chuẩn 73 Bảng 12: Kết ảnh hưởng nồng độ muối MgCl2 tới khả sinh kháng sinh MgCl2 (%) 0,5 1,5 2,5 D (mm) 17,8 19,7 23,7 22,5 21,0 18,6 16,3 s 0,23 0,31 0,25 0,27 0,35 0,40 0,33 Trong đó: D : đường kính trung bình vòng vô khuẩn s: độ lệch chuẩn 74 Phụ lục 2: Các loại môi trƣờng phân lập, nuôi cấy phân loại vi sinh vật 2.1 Môi trƣờng R2YE (g/l): Sucrose: 103 Glucose: 10 Axit casamino: 0,1 Cao nấm men: L-proline (20%): 1500 µl TES buffer (5,73%): 10 ml NaOH 2N: 250 µl Trace element solution - dd vi lượng: 200 µl R solution: 100 ml + Trace element solution (g/l): - ZnCl2: 0,04 g - FeCl2.6H2O: 0,2 g - CuCl2.2H2O: 0,01 g - MnCl2.4H2O: 0,01 g - Na2B4O7.10 H2O: 0,01 g - (NH4)6MO7O24.4 H2O: 0,01 g 75 + R - solution (500 ml) - K2SO4: 1,25 g - MgCl2.6 H2O: 50,6 g - KH2PO4: 0,25 g - CaCl2.2 H2O: 1,8 g 2.2 Môi trƣờng 79: Thành phần (g/l): Glucose 10 Peptone 10 Casein thủy phân Cao nấm men NaCl K2HPO4 0,2 Nước cất 1000 ml pH 7,0 - 7,4 2.3 Môi trƣờng A-4: Thành phần (g/l): Glucose 15 Bột đậu tương 15 NaCl CaCO3 Nước cất 1000 ml pH 7,0 76 2.4 Môi trƣờng A4-H: Thành phần (g/l): Glucose 10 Bột đậu tương 15 NaCl CaCO3 Nước cất 1000 ml pH 7,0 2.5 Môi trƣờng LB (Luria-Bertani) (LB Broth, Miller): Thành phần (g/l): Trypton 10 Cao nấm men NaCl 10 NaOH 5N 200 µl Agar 20 Nước cất 1000 ml 77 2.6 Môi trƣờng ISP1 (Trypton - Cao nấm men): phân loại xạ khuẩn Thành phần (g/l): Trypton Cao nấm men Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH - 7,2 2.7 Môi trƣờng ISP (cao nấm men - cao malt - thạch): phân loại xạ khuẩn Thành phần (g/l): Cao nấm men Cao malt 10 Dextrose Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH 7,3 2.8 Môi trƣờng ISP3 (thạch - đại mạch): phân loại xạ khuẩn Thành phần (g/l): Bột đại mạch 20 Dung dịch khoáng A ml Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH - 7,2 78 Dung dịch khoáng A (%): FeSO4.H2O 0,1 MnCl2.4H2O 0,1 ZnSO4.7H2O 0,1 Nước cất 100 ml 2.9 Môi trƣờng ISP4 (tinh bột - khoáng): phân loại xạ khuẩn Thành phần (g/l): Tinh bột tan 10 K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl (NH4)2SO4 CaCO3 Dung dịch muối vệt ml Agar 18 Nước cất 1000 ml pH 7,0 - 7,4 79 2.10 Môi trƣờng ISP5 (Glyxerin - asparagine): phân loại xạ khuẩn Thành phần (g/l): L-asparagin Glyxerin 10 K2HPO4 Dung dịch muối vệt ml Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH - 7,4 2.11 Môi trƣờng ISP6 (pepton - cao nấm men - xitrat sắt): Thành phần (g/l): Pepton 15 Cao nấm men Amonium xitrat sắt 0,5 K2HPO4 Na2S2O3 0,08 Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH - 7,2 80 2.12 Môi trƣờng ISP7 dùng để quan sát sắc tố melanin Thành phần (g/l): Glycerol 15 L-tyrosine 0,5 L-asparagine K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,5 NaCl 0,5 FeSO4.7H2O 0,01 Dung dịch muối vệt ml Agar 20 Nước cất 1000 ml pH 7,2 - 7,4 Dung dịch muối vệt (g/l): FeSO4.7H2O 0,1 MnCl2.4H2O 0,1 ZnSO4.7H2O 0,1 Nước cất 100 ml 81 2.13 Môi trƣờng ISP9: dùng để xác định khả sử dụng nguồn đường 2.13.1 Các nguồn đường D-glucose Maltose Cellobiose Raffinose Trehalose Myo-inositol D-Mannose L-rhamnose Lactose 10 Xylose 2.13.2 Các nguồn muối vi lượng: Pha dung dịch đặc (stock) sau bổ sung vào môi trường theo tỷ lệ ml stock / lít môi trường Thành phần (g/l): CuSO4.5H2O 0,64 FeSO4.7H2O 0,11 MnCl2.4H2O 0,79 ZnSO4.7H2O 0,15 Nước cất 100 ml 82 2.13.3 Muối khoáng ISP Thành phần (g/l) (NH4)2SO4 2,64 KH2PO4 2,38 K2HPO4 5,65 MgSO4.7H2O Muối vi lượng 1ml Agar 15 Nước cất 1000 ml pH 6,8 - * Chú ý: Các nguồn đường bổ sung cho môi trường ISP9 khử trùng theo phương pháp Paster, tức khử trùng 65°C 15 phút khử trùng lặp lại sau 24 48 với nhiệt độ thời gian lần 2.14 Môi trƣờng Bennett: thử số đặc tính sinh lý xạ khuẩn Thành phần (g/l): Cao thịt Glucose 10 Cao men Axit casamino Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH 7,3 - 7,5 83 2.15 Môi trƣờng Gause 1: nuôi cấy xạ khuẩn Thành phần (g/l): Tinh bột tan 20 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,5 KNO3 0,5 FeSO4.7H2O 0,01 NaCl 0,5 Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH 7,2 -7,4 2.16 Môi trƣờng Gause 2: nuôi cấy xạ khuẩn Thành phần (g/l): Pepton Cao thịt 0,5 NaCl Glucose 10 Agar 18 - 20 Nước cất 1000 ml pH - 7,2 84 ... tiêu nghiên cứu là: Nghiên cứu khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0 041BP Nghiên cứu tách chiết thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu. .. phẩm kháng sinh Những điểm luận văn: + Đây nghiên cứu sinh tổng hợp Dihydrochalcomycin từ xạ khuẩn Việt Nam + Bước đầu nghiên cứu đặc điểm sinh học, khảo sát khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces. .. điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0 041BP Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng sinh kháng sinh Nghiên cứu quy trình lên men quy trình thu nhận kháng sinh thô Nghiên cứu