NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ VÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO Xanthomonas oryzae Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Dương Văn Hợp TS Phạm Thế Hải Hà Nội - 2014 MỞ ĐẦU 1.Lý chọn đề tài: Bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra, xuất phổ biến khu vực trồng lúa Việt Nam, đặc biệt tập trung khu vực đồng sông Cửu Long Bệnh gây hại vụ lúa hè thu nhiều vụ đông xuân thời tiết ẩm ướt, nhiều sương mù, độ ẩm không khí cao Bệnh xuất gây hại từ giai đoạn lúa đẻ nhánh đến đòng trổ chín.Bệnh bạc lúa gây thiệt hại nặng nề cho ngành nông nghiệp, làm giảm suất lúa 25 - 50 %, chí trắng(Số liệu thống kê cục bảo vệ thực vật).Một giải pháp quan trọng phòng trừ bệnh bạc lúa sử dụng dòng lúa mang gen kháng bệnh.Tuy nhiên, dòng lúa mang vài gen kháng đơn lẻ, nuôi trồng liên tục diện rộng dẫn đến tình trạng chủng Xoo có khả gây bệnh có gen kháng [18] Chính vậy, việc kiểm soát bệnh bạc lúa biện pháp sinh học thu hút ý nhiều nhà nghiên cứu [36] Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn Gram dương, biết đến nguồn sinh chấtkháng sinh chất có hoạt tính sinh học [6] Bộ sưu tập 3000 chủng xạ khuẩn đượcbảo quản Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi Sinh Công nghệ sinh học, ĐHQGHN hứa hẹn tiềm tìm chất có hoạt tính sinh học dùng cho việc khống chế tiêu diệt vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lúa Việt Nam Trong nghiên cứu này, tài trợ quỹ đề tài NAFOSTED, TS Phan Thị Phương Hoa cộng sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn lựa chọn 17 chủng có khả kháng tất 10 chủngXoo Trong đó, lựa chọn chủng VN08-A12 tác nhân kiểm soát sinh học bệnh bạc lúa Chủng VN08-A12 có nhiều ưu điểm bật thử nghiệm đồng ruộng thu kết đáng mừng Kết cho thấy chủng VN08-A12 không làm giảm chiều dài tổn thương lúa nhiễmXoo, mà làm giảm đáng kể tổn thất suất giống lúa bị nhiễm Xoo [23][24] Chính vậy, để phát triển chế phẩm khống chế sinh học để kiểm soát bệnh bạc lúa, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (VN08-A12) kháng bệnh bạc lúa Xanthomonas oryzae” Nhiệm vụ mục đích nghiên cứu - Phân loại chủng xạ khuẩn VN08 - A12 - Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu để khả sinh hoạt chất chủng xạ khuẩn cao - Tinh xác định cấu trúc hoạt chất kháng Xoo sinh chủng xạ khuẩn VN08 - A12 2 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Bệnh bạc lúa tác hại bệnh bạc lúa 1.1.1 Giới thiệu chung Bệnh bạc lúa - hay gọi bệnh cháy bìa lúa (Bacterial leaf blight disease) bệnh phổ biến nước trồng lúa Bệnh bạc lúa phát lần đầu vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản từ năm 1884 [45] Hiện nay, bệnh bạc xảy nhiều quốc gia, đặc biệt châu Á Ở nhiều nước châu Á, bệnh trở thành đại dịch lúa Bệnh làm giảm sản lượng mức độ khác nhau, tùy thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh cây, mức độ nhạy cảm giống lúa ảnh hưởng môi trường Ở số nước châu Á Đông Nam Á, bệnh bạc lúa thường làm giảm suất 10-20 %nhưng lên đến 50% [33][38] Ở Nhật Bản, thiệt hại suất ước tính 20-30% chí đến 50% Ở vùng nhiệt đới, bệnh phá hoại gây ảnh hưởng nặng tới hàng triệu lúa Ở Ấn Độ, thiệt hại sản lượng từ đến 60% Việc giảm sản lượng chủ yếu giảm số lượng trọng lượng hạt [43] Hình 1.Lúa bị nhiễm bệnh bạc vi khuẩnXoo (www.thaibinhseed.com.vn/benh-bac-la-lua) 1.1.2 Tác nhân gây bệnh bạc lúa Tác nhân gây bệnh bạc lúa vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) Vi khuẩn có tế bào hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 đến µm, chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh tế bào màng nhầy Đây loại vi khuẩn Gram âm không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng (hình 2) [9].Vi khuẩn chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn dẫn đến nhiễm trùng toàn thân lúa Ngoài vi khuẩn xâm nhập qua lỗ thùy khổng mép lá, đầu mút dễ dàng gây tổn thương dọc theo gân [39] 3 5µm Hình Khuẩn lạc tế bào vi khuẩn Xoo [9] Loại vi khuẩn nhà khoa học Nhật Bản, Hori Bokura đặt tên Bacillus oryzae từ năm 1911 đổi tên nhiều lần [49][50] 1.2 Các cách phòng trừ bệnh bạc lúa 1.2.1 Sử dụng thuốc hóa học Thuốc hóa học sử dụng để giết chết ức chế nhân lên tác nhân gây bệnh cách ngăn chặn đường trao đổi chất vi khuẩn Một số hóa chất sử dụng để kiểm soát bệnh bạc lúa Bordeaux có đường, hỗn hợp đồng xà phòng, thuốc diệt nấm đồng thủy ngân, dịch phun oxychloride Ở Ấn Độ, sử dụng bột Clo xử lý nước làm giảm bệnh [11] [54] Việc sử dụng thuốc hóa học mang lại hậu nặng nề môi trường Đồng thời, chưa có phương thức kiểm soát hóa chất mang lại hiệu cao khả tồn phát triển chủng kháng thuốc 1.2.2 Chọn giống lúa kháng bệnh Chọn giống lúa kháng bệnh phương pháp quan tâm Hiện nay, 23 gen kháng bệnh bạc lúa (Xa) công bố (bảng 1).Các đoạn mồi thiết kế để phát gen Xa giống lúa khác (bảng 2) Bảng Đặc điểm nguồn gốc gen Xa kháng bệnh bạc lúa[37] Tên gen Xa Tên gen Xa cũ Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện Xa1 Xa1 NST Kogyoku Xa1-h Xa-1h NST IR28, IR29, IR30 Xa2 Xa2 NST Rentai Emas2, tẻ tép Xa3 Xa-w NST11 Wase Aikoku3 Xa-4b NST11 Semora Mangga Xa-6 NST-5 Zenith Xa-9 NST-6 Sateng Tên gen Xa Tên gen Xa cũ Nhiễm sắc thể Giống, dòng lúa đại diện Xa4 Xa-4 NST11 TKM6, IR20, UR22 Xa5 Xa-5 NST DZ192,IR1545-339 Xa7 Xa-7 NST DV85, DZ78 Xa8 Xa-8 NST PI231129 Xa10 Xa-10 NST11 Cas 209 Xa11 Xa-11 Xa12 Xa-kg NST4 Kogyoku, Java14 Xa12-h Xa-kgh NST IR28, IR29, IR30 Xa13 Xa-13 NST BJ1, Chinsura Boro II Xa14 Xa-14 Tai chung Native Xa15 (t) Xa-nm (t) M41 Xa16 Xa-16 Tẻ tép Xa17 Xa-as(t) Xa18 Xa-18 Xa19 Xa19 Đột biến XM5 Xa20 Xa-20 Đột biến M6 Xa21 Xa-21 NST 11 IRBB21 Xa22 (t)b Xa-22 (t) NST 11 Zachanglong Xa23 (t)b Xa-23 (t) NST 11 WBB1 RP 9-3, IR8 NST Asominori IR24, Milyang 23 Bảng Trình tự đoạn mồi đặc hiệu để phát gen Xa lúa [15] Mồi Trình tự nucleotide MP1 5'-ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG-3' MP2 5'-dTG-CTA-TAA-AAG-GCA-TTC-GGG-3' RG556 F 5'-TAG-CTG-CTG-CCG-TGC-TGT-GC-3' RG556 R 5'-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC-ATC-3' P3 F 5'-CAG-CAA-TTC-ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3' P3 R 5'-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT-ATC-GGA-3' Xa21F 5'-ATA-GCA-ACT-GAT-TGC-TTT-GC-3' Xa 21 R 5'- CGA - TCG - GTA - TAA- CAG-CAA-AAC-3' RG136 F 5' - TCC-CAG-AAA-GCT - ACA-GC-3' RG136 R 5' - GCA-GAC-TCC-AGT=TTG-ACT-TC-3' Xa-gen Xa-4 Xa-5 Xa-7 Xa-21 Xa-13 Gen Xa21 lần phát giống lúa hoang dại Oryza longistaminata dược chuyển vàogiống lúa IR24 để tạo giống lúa kháng bệnh IRBB21 [30] Ở Ấn Độ Philippin, giống lúa chứng minh có khả kháng với hầu hết chủngXoo Tuy nhiên, số chủngXoo số vùng châu Á phát vượt qua gen kháng Xa21 giống lúa IRBB21 (hình 3) [18] 1.2.3 Khống chế sinh học Các thuốc hóa học chứng minh có hiệu việc kiểm soát bệnh bạc lúa không ứng dụng rộng biến đổi khó lường tác nhân gây bệnh Sự xuất quần thể kháng thuốc đặt mối đe dọa nghiêm trọng cho chiến lược kiểm soát hóa học lâu dài Đồng thời, chất hóa học thường độc hại người sử dụng, gây ảnh hưởng đến loài sinh vật khác, tích lũy qua thời gian dài gây ảnh hưởng trầm trọng lên hệ sinh thái Việc chọn tạo giống kháng bệnh áp dụng nhóm quần thể kháng lại gen kháng bệnh phát triển nhanh chóng Do đó, kiểm soát sinh học cho giải pháp sinh thái có hiệu cho việc ngăn ngừa bệnh bạc lúa [27] Islam Bora (1998) đưa biện pháp phòng trừ bệnh bạc việc sử dụng chủng vi khuẩn Rhizobacterial vào việc khử trùng hạt giống Kết cho thấy việc xử lý hạt giống tác dụng làm giảm ảnh hưởng bệnh bạc mà có tác dụng làm tăng suất lúa [17][29] 1.3 Xạ khuẩn 1.3.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC ADN cao 55% Trong số khoảng 1000 chi 5000 loài sinh vật nhân sơ công bố có khoảng 100 chi 1000 loài xạ khuẩn [12] Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, Actinomycetales, 10 bộ, 35 họ, 110 chi 1000 loài Xạ khuẩn phân bố chủ yếu đất đóng vai trò quan trọng chu trình tuần hoàn vật chất tự nhiên Chúng sử dụng axit humic chất hữu khó phân giải khác đất Trong đất xạ khuẩn chiếm từ 9% - 45% tổng số vi sinh vật, số lượng trung bình khoảng 106 - 108 tế bào/ g đất Số lượng xạ khuẩn đất không phụ thuộc vào loại đất mà phụ thuộc vào mức độ canh tác đất khả bao phủ thực vật Đất giàu chất dinh dưỡng hữu cơ, khoáng lớp đất bề mặt (đến 40 cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn Trong g đất canh tác có tới x 106 tế bào xạ khuẩn, đất vùng sa mạc, nóng, khô, độ ẩm thấp, nghèo chất dinh dưỡng, có số lượng xạ khuẩn thấp 10 - 100 lần, dao động khoảng 104 105 tế bào/ g đất Sự phân bố xạ khuẩn đất phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, thường có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu, khoảng pH 6,0 8,0 Xạ khuẩn nhiều lớp đất kiềm hay axit lớp đất kiềm Số lượng xạ khuẩn đất thay đổi theo thời gian năm [4] 6 A B Hình Khuẩn lạc số chủng xạ khuẩn (A) Actinoplanes brasiliensi (VTCC-A- 2908) (B) khuẩn lạc chủng Streptomyces lannensis (VTCC-A2780) C D Hình Cuống sinh bào tử số chủng xạ khuẩn (C) Nonomuraea roseoviolacea (VTCC - A- 2062) (D) Streptomyces malachitofuscus (VTCC - A - 2789) 1.3.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn Một đặc điểm quan trọng xạ khuẩn khả sinh chất kháng sinh Trong số 5500 chất kháng sinh có 4000 chất có nguồn gốc từ xạ khuẩn Đa số chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn có phổ kháng rộng, kìm hãm ức chế nhiều loại vi sinh vật khác [35] Rất nhiều chất kháng sinh sinh xạ khuẩn sử dụng rộng rãi thực tế như:Streptomycin, neomycin, gentamycin, tetracyclin, cloramphenicol, erythromycin, novobiocin, amphoterycin, daunorubixin… [40] [25][19][7][42][52] 1.3.3 Sử dụngxạ khuẩn khống chế sinh học Một phương pháp kiểm soát sinh học tập trung nghiên cứu sử dụng chủng xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn có khả thúc đẩy tăng trưởng thực vật cách tác động trực tiếp thải sắt, photpho hòa tan sản sinh hormone thực vật gián tiếp ức chế tác nhân gây bệnh cảm ứng chế kháng thực vật chống lại mầm bệnh [14][22] Một số chủng thuộc chi Streptomyces chứng minh hỗ trợ thực vật việc hấp thu chất dinh dưỡng mà cònkiểm soát tác nhân gây bệnh cho trồng [20].Ngoài ra, số chủng Streptomyces spp phân lập từ 21 mẫu đất Indonesia công bố có khả ức chế sinh trưởng vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis Gram âm Xanthomonas axonopodis [32] Các kết thử nghiệm chứng minh chủng P.fluorescens có vai trò quan trọng việc kiểm soát bệnh củ cải đường, lúa mạch thuốc Các nghiên cứu Ji cộng năm 2008 cho thấy chủng Lysobacter antibioticus 13-1 có khả ức chế phát triển nhiều loài nấm vi khuẩn gây bệnh thực vật, có Xoo [29] 1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn kiểm soát bệnh bạc lúa Tại Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, TS Phan Thị Phương Hoa cộng sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn lưu giữ Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật (VTCC) tìm 167 chủng lựa chọn với khả kháng cao hai chủng kiểm định Micrococcus luteus NBRC 13867 Escherichia coli NBRC 14237 [23] Các chủng xạ khuẩn tiếp tục sàng lọc khả kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 R10 PGS TS Phan Hữu Tôn (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội)và cộng phân lập Trong số 167 chủng xạ khuẩn này, 17 chủng xạ khuẩn có khả kháng 10 chủng Xoo Để nghiên cứu khả kháng đặc hiệu Xoo 17 chủng xạ khuẩn, chủng vi sinh vật Bacillus subtilis NBRC 3134, Saccharomycescerevisiae NBRC 10217, Azotobacter sp VTCC - B-106 Pseudomonas putida VTCC - B-657 sử dụng chủng VN06 - A -353, VN08 - A - 306, VN08 - A - 352, VTCC - A - 99, VN10 - A - 44 VN08 - A12 có tính đặc hiệu cao với Xoo, chúng ức chế loại vi sinh vật kiểm định Trong số đó, chủng VN08 - A12 sinh trưởng tốt không gây ức chế vi sinh vật có lợi Azotobacter sp (VTCC - B - 106) Pseudomonas putida (VTCC - B - 657) Những thử nghiệm đồng ruộng giống lúa Oryza sativa L SS1 Oryza sativa L KD18 cho thấy dịch nuôi cấy chủng VN08 - A12làm giảm đáng kể tổn thương Xoo gây lúa [23] Chính vậy, nghiên cứu này, tập trung nghiên cứu đặc điểm sinh học để phân loại phân tích hoạt chất kháng Xoo chủng VN08-A12 sinh 8 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.1.1 Các chủng Xoo 10 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lúa miền Bắc Việt Nam nhận từ PGS TS Phan Hữu Tôn cộng (trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội) 2.1.1.2 Các chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 phân lập năm 2008 lưu giữ Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật học (VTCC), Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội 2.1.1.3 Vi sinh vật kiểm định Sáuchủng vi sinh vật kiểm định sử dụng bảo quản VTCC bao gồm: - Pseudomonas putida (VTCC - B-657);Saccharomyces cerevisiae (VTCC - Y-62);Bacillus subtilis(VTCC-B-888); Azotobacter sp.(VTCC - B-106);Fusarium oxysporum (ATCC 7601);Staphylococcus aureus (ATCC - 29923) 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.1.2.1 Hóa chất 2.1.2.2 Dụng cụ thiết bị 2.1.2.3 Môi trƣờng nghiên cứu  Môi trƣờng nuôi cấy xạ khuẩn: + Môi trường 2M (g/l); Môi trường No 8(g/l); Môi trường 301 (g/l); Môi trường A-3M g/l); Môi trường A-16 (g/l); Môi trường SKS (g/l); Môi trường YS (g/l) Môi trƣờng thử hoạt tính kháng vi khuẩn: + Môi trường PSA (g/l); Môi trường YM (g/l; Môi trường thạch thường (g/l); Môi trường MullerHinton (g/l 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật 2.2.1.1 Phương pháp thỏi thạch 2.2.1.2 Phương pháp đục lỗ thạch 2.2.2 Phân loại đặc điểm hình thái 2.2.2.1 Hình thái khuẩn lạc 2.2.2.2 Hình thái chuỗi sinh bào tửvà bề mặt bào tử 2.2.3.Hóa phân loại 2.2.3.1 Phân tích thành phần axit amin thành tế bào 2.2.3.2 Phân tích thành phần menaquinone 2.2.3.3 Phân tích thành phần axit béo 2.2.3.4 Phân tích thành phần G+C AND 2.2.4 Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S – rADN 2.2.5 Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy xạ khuẩn 2.2.5.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 2.2.5.2 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 2.2.5.3 Lựa chọn thể tích nuôi cấy thích hợp 2.2.5.4 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 2.2.5.5 Lựa chọn cách cấy giống 2.2.6 Tinh hoạt chất kháng Xoo 2.2.6.1 Tách dịch chiết thô 2.2.6.2 Tinh silica gel 2.2.6.3 Tinh HPLC 2.2.7.Xác định khối lƣợng phân tử khối phổ (MS) CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 tiến hành thử hoạt tính kháng với 10 chủng Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) từ R1 đến R10 phương pháp thỏi thạch Kết đường kính vòng hoạt tính kháng Xoo thể bảng Bảng Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng VN08- Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d: mm) R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 10±1 14±1 18±1 12±4 8±1 14±2 8±1 5±1 8±1 10±1 A12 Kết bảng cho thấy chủng VN08 - A12 có khả kháng 10 chủng Xoo Trong đó, chủng có khả kháng mạnh R2, R3 R6 kháng yếu với R8 Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn VN08 - A12 STT Chủng Vi sinh vật kiểm đinh Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d: mm) Pseudomonas putida VTCC - B-657 - Fusarium oxysporum ATCC - 7601 - Staphylococcus aureus ATCC - 29923 - Saccharomyces cerevisiae VTCC - Y - 62 - 10 Bacillus subtilis VTCC - B - 888 - Kết cho thấychủng xạ khuẩn VN08 - A12 không ức chế vi sinh vật kiểm định Ngoài ra, chủng VN08 - A12 có khả tăng trưởng nhanh Vì vậy, chủng VN08 - A12 tiếp tục kiểm tra khả ức chế hai vi sinh vật có lợi Azotobacter sp (VTCC - B - 106) Pseudomonas putida (VTCC - B - 657) Kết thử hoạt tính cho thấy chủng VN08 - A12 không kháng hai loại vi khuẩn kiểm tra (Bảng 7) Như vậy, chủng VN08 - A12 có khả kháng đặc hiệu với vi khuẩn Xoo Bảng Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng xạ khuẩn Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D - d, mm) Azotobacter sp (VTCC - Pseudomonas putida B - 106) (VTCC - B - 657) - - VN08 - A12 3.2 Phân loại chủng VN08-A12 3.2.1 Phân loạibằng hình thái Sau ngày nuôi cấy đĩa thạch YS, chủng VN08-A12 tạo khuẩn lạc lồi, mép tạo viền có dạng sợi tia nhỏ, hệ sợi khí sinh có màu từ trắng đến nâu Hệ sợi chất có màu nâu nhạt (hình 7A) Đường kính khuẩn lạc 0,5- 2,5 mm, không tiết sắc tố vào môi trường Chuỗi bào tử chủng VN08-A12 có dạng thẳng, dài, thường có 20 bào tử chuỗi (hình 7B hình 8C).Khi quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM)bề mặt bào tử có dạng nhẵn (hình 8D) A B Hình Khuẩn lạc chuỗi bào tử chủng VN08-A12 11 D C 1µm (Ảnh SEM 15KVx 5,000) (Ảnh SEM 10KVx 30,000) Hình Chuỗi bào tử bào tử chủng VN08 - A12 3.2.2 Hóa phân loại 3.2.2.1 Thành phần axit amin thành tế bào Thành phần axit amin thành tế bào chủng VN08-A12 xác định sắc ký mỏng mô tả phần phương pháp 2.2.3.1 (hình 9).Kết so sánh với chất chuẩn cho thấy chủng VN08-A12 chứa LL- DAP (DAP:Diaminopimelic) LL - DAP Chủng VN08 -A12: LL - DAP Meso - DAP Hình Kết chạy sắc ký mỏng thành phần axit amin thành tế bào chủng VN08A12 (1) Chất chuẩn Meso -DAP LL - DAP (2) Mẫu VN08 - A12 12 3.2.2.2 Thành phần menaquinone Thành phần menaquinone chủng VN08-A12 phân tích theo phương pháp trình bày mục 2.2.3.2.Mẫu menaquinone sau phân tách sắc ký mỏng thu lại để phân tích LC-MS Hai đỉnh phút 14,019 15, 689 LC xác định tương ứng MK -9(H6) MK -9(H8) phân tích khối phổ kèm (hình 10) Kết phân tích diện tích hai đỉnh thể bảng 8, cho thấy thành phần menaquinone chủng VN08-A12 MK -9 (H6) 51,9% MK-9(H8) 48,1% MK - (H8) MK - (H6) Hình 10 Kết phân tích LC thành phần menaquinone chủng VN08-A12 Bảng : Kết phân tích thành phần menaquinone chủng VN08 - A12 Peak Thời Diện tích Chiều Phần trăm Phần trăm Loại menaquinone gian lƣu peak cao diện tích chiều cao VN08 -A12 peak peak (%) peak (%) 14,019 840142 44224 51,961 55,145 MK - (H6) 15,689 776728 35972 48,039 44,55 MK - 9(H8) 1616869 80196 100,00 100,000 Tổng 3.2.2.3.Thành phần axit béo Thành phần axit béo chủng VN08-A12 phân tích hệ thống sắc ký khí kết hợp với phần mềm MIDI theo phương pháp trình bày mục 2.2.3.3 Kết phân tích thể hình 11 bảng 9,cho thấy chủng VN08-A12 có thành phần axit béo gồm anteios-(anteios-C15:0), iso-(iso-C16:0) (n-C16:0) 13 Hình 11 Sắc ký đồ thành phần axit béo chủng VN08-A12 Bảng 9.Kết phân tích thành phần menaquinone chủng VN08-A12 Thời gian lƣu Tên peak Tỷ lệ phần trăm 6,974 14: iso 1,77 7,503 14: 0,77 8,478 15: iso 9,18 8,619 15: anteiso 19,25 9,064 15: 1,13 9,838 16: iso H 2,45 10,119 16: iso 16,02 10,441 16:1 cis 11,16 10,744 16: 10,09 11,472 16:0 methyl 5,41 11,661 17: anteiso 4,89 11,840 17: iso 4,19 12,003 17: anteiso 11,53 12,127 17: 0,75 12,438 17: 10 methyl 0,45 13,205 18: iso H 0,41 14 3.2.2.4 Thành phần G+C AND Thành phần GC chủng VN08-A12 phân tích phương pháp HPLC trình bày mục 2.2.3.4 Kết thể hình 12và bảng 10.Kết phân tích cho thấy thành phần GC ADN chủng VN08-A12 75% C G T A Hình 12 Sắc ký đồ thành phần GC chủng VN08-A12 Bảng 10 Kết phân tích thành phần GC chủng VN08-A12 Peak Thời gian Diện tích Chiều cao Phần trăm Phần trăm Thành lƣu peak peak diện tích chiều cao phần peak (%) peak (%) GC 2,299 1063153 162556 38,736 40,537 C 4,058 1019074 161599 37,130 40,298 G 6,302 327432 40445 11,930 10,086 T 6,841 334930 36411 12,203 9,080 A 2744589 401012 100,000 100,000 Tổng 3.2.3 Trình tự 16S rADN Kết Blast search GenBank cho thấy chủng VN08-A12 có trình tự 16S rADN hoàn toàn tương đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lệ 100% Cây phân loại chủng VN08A12 dựng phần mềm ClustalX2 ClustalW2 cho thấy chủng nghiên cứu nằm nhóm với nhóm chủng Streptomyces toxytricini (hình 13) Như vào kết phân tich hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa, hóa phân loại trình tự 16s rADN chủng VN08 - A12 cho thấy chủng VN08 - A12 thuộc chi Streptomyces toxytricini 15 Hình 13 Cây phân loại chủng VN08-A12 dựa trình tự gen 16S –rADN 3.3 Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng VN08-A12 3.3.1 Môi trường nuôi cấy thích hợp Để lựa chọn môi trường nuôi cấy chủng VN08-A12 để đạt hoạt tính kháng Xoo cao nhất, loại môi trường lựa chọn để thử nghiệm bao gồm 3M, 16M, 2M, 301, N8 SKS Kết trình bày hình 14 hình 29C.Kết cho thấy, môi trường SKS Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d:mm) môi trường tốt cho chủng VN08-A12 để sản sinh chất khángXoo 35 30 25 20 15 10 3M 16M 2M 301 N8 Môi trường nuôi cấy SKS Hình 14 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy khác đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08-A12 16 3.3.2 Thời gian nuôi cấy thích hợp Chủng VN08-A12 nuôi lắc môi trường SKS 30oC, dịch nuôi cấy thu thử hoạt tính kháng Xoo ngày khác Kết trình bày hình 15 hình 29B Kết cho thấy rằng, thời gian nuôi cấy ảnh hưởng đến sản sinh lượng chất kháng Xoo Khả Đường kính vòng kháng khuẩn (D:mm) ức chế Xoo (R2) đạt cao sau ngày nuôi cấy giảm dần tăng thời gian nuôi cấy 30 25 20 15 10 5 Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 15 Ảnh hưởng thời gian cấy khác đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08-A12 3.3.3 Thể tích nuôi cấy thích hợp Để xác định thể tích nuôi cấy thích hợp, chủng VN08-A12 nuôi cấy môi trường SKS với thể tích khác nhauở 30oC Sau ngày, dịch nuôi cấy thu để thử hoạt tính khángXoo Kết thể hình 16 hình 29A…Kết khẳng định oxy nhân Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d:mm) tố quan trọng ảnh hưởng khả sinh hoạt chất kháng Xoo chủng VN08-A12 30 25 20 15 10 25 50 75 100 125 Thể tích nuôi cấy (ml) 150 Hình 16 Ảnh hưởng thể tích môi trường nuôi cấy khác đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08-A12 (S.toxytricini) 17 3.3.4 Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp Chủng VN08-A12 nuôi môi trường SKS, nhiệt độ khác Dịch nuôi cấy sau ngày thử hoạt tính kháng Xoo Kết trình bày hình 17 hình 29D.Nhiệt độ nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sản sinh hoạt chất kháng Xoo Kết cho thấy chủng VN08-A12 nuôi nhiệt 30oC tốt Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d:mm) 35 30 25 20 15 10 25 30 35 Nhiệt độ nuôi cấy (o C) 40 Hình 17 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy khác đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08-A12 3.3.5.Cách cấy giống thích hợp Cách cấy giống thường ảnh hưởng lớn đến khả sinh chất có hoạt tính sinh học Chính vậy, khảo sát cách cấy giống khác để tìm phương pháp thu hoạt chất kháng Xoo cao nhất, bao gồm: giống cấp 24, 48, 76, 92 bào tử (1x108, 2x108, 3x108 4x108)bào tử Dịch nuôi cấy sau ngày thử hoạt tính kháng Xoo (R2) Kết trình bày hình 18 hình 29E hình 29F.Kết cho thấy rằngphương pháp cấy giống cấp tốt cấy bào tử Giống cấp thời điểm khác không ảnh hưởng đến khả sinh hoạt chất Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d:mm) 18 29 28 27 26 25 24 23 24 48 72 Giống cấp I ( Thời gian nuôi – giờ) 96 1x108 2x108 3x108 4x108 (1x108) (2x108) (3x108) (4x108) Bào tử Cách cấy giống Hình 18.Ảnh hưởng cách cấy giống đến sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo chủng VN08-A12 3.4 Tinh phân tích hoạt chất kháng Xoo chủng VN08-A12 3.4.1 Tinh hoạt chất kháng Xoo chủng VN08-A12 Dịch chiết thô chủng VN08 - A12 tách chiết 1/2 thể tích ethyl acetate mô tả mục 2.2.6.1 tóm tắt sơ đồ hình 19 Hoạt tính kháng Xoo dịch chiết thô kiểm tra phương pháp đục lỗ thạch khẳng định hoạt chất tách dung môi ethylacetate (hình 30A) Dịch chiết thô tiếp tục tinh cột silica gel, phân đoạn thu thử hoạt tính kháng Xoo (R2) trình bày mục 2.2.6.2 Hoạt tính phân đoạn thể bảng 11 hình 30B Các phân đoạn từ 4.1 trở có hoạt tính chứng tỏ hoạt chất kháng Xoo khỏi cột với nồng độ ethylacetate 80% Dịch nuôi cấy Dịch (1V) (Ly tâm) 1/2V Ethyl acetate Ly tâm Dịch (Dịch chiết thô) Hình 19 Quy trình tách dịch chiết thô chủng VN08 - A12 Bảng 11 Hoạt chất VN08-A12 thu từ phân đoạn tinh silica gel 19 Phân đoạn Nồng độ Thể tích Đƣờng kính mẫu chủng dung môi (ml) vòng kháng VN08 - A12 (D-d, mm) 1.1 Hexan 100% 20 - 1.2 Hexan 100% 20 - 2.1 80% Hexan: 20% ethyl acetate 20 - 2.2 80% Hexan: 20% ethyl acetate 20 - 20 - 3.1 50% Hexan: 50% ethyl acetate 3.2 50% Hexan: 50% ethyl acetate 20 - 4.1 20% Hexan: 80% ethyl acetate 20 15 4.2 20% Hexan: 80% ethyl acetate 20 10 5.1 0% Hexan: 100% ethyl acetate 20 5.2 0% Hexan: 100% ethyl acetate 20 5.3 50% Methanol: 50% ethyl acetate 20 Phân đoạn 4.1 có hoạt tính cao nên tiếp tục tinh phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký phản pha C18 Các phân đoạn (1 phút/phân đoạn) sau HPLC thu lại thử hoạt tính kháng Xoo (bảng 12 hình 20) Kết cho thấy phân đoạn 14 có hoạt tính cao nhất, tương ứng với phút 14 Vì vậy, chất phút 14 tinh (hình 21) Phổ hấp thụ hoạt chất thể hình 22 Bước sóng hấp thụ cực đại chất 360 nm DAD1 A, Sig=254,4 Ref=450,100 (20130228NT 2013-02-28 14-11-30\1AA-0201.D) 14.576 mAU 2000 1750 1500 13.467 1250 14.723 1000 17.636 17.799 17.246 17.397 16.651 16.064 16.221 15.735 15.311 15.425 14.939 15.170 14.156 13.857 12.992 13.183 12.836 250 12.401 11.945 500 14.024 13.568 750 12 13 14 15 16 Hình 20 Phổ HPLC hoạt chất chủng VN08-A12 17 20 DAD1 A, Sig=254,4 Ref=450,100 (2013086NT 2013-08-06 09-48-35\014-0401.D) 12.585 mAU 70 60 50 40 30 26.194 26.294 26.910 14.368 0.931 1.060 10 12.222 12.907 20 10 15 20 25 30 550 nm Hình 21 Phổ HPLC hoạt chất sau tinh *DAD1, 12.380 (449 mAU, - ) Ref=11.447 & 12.967 of 012-0201.D mAU 400 350 300 250 200 150 100 50 250 300 350 400 450 500 Hình 22 Phổ hấp thụ UV hoạt chất sau tinh 3.4.2 Phân tíchtrọng lƣợng phân tử Trọng lượng phân tử hoạt chất kháng Xoo tinh từ chủng VN08-A12 xác định phương pháp khối phổ (hình 23) Kết cho thấy hoạt chất có trọng lượng phân tử 778,43 Dựa phổ hấp phụ trọng lượng phân tử,chúng bước đầu tạm xác định hoạt chất factumycin với cấu trúc hóa học hình 24 21 801.438 [M+Na] + Hình 23 Kết quảphân tích khối phổ chủng VN08-A12 Hình 24 Cấu trúc hóa học factumycin[31] Factumycin phát lần vào năm 1982 mộtchất kháng sinh thuộc nhóm với aurodox, kirromycin, efrotomycin, mocimycin, heneicomycin [21] Factumycin có trọng lượng phân tử 778,97048 g/ mol công thức phân tử C44H62N2O10 (hình 25) Sự khác biệt factumycin với chất nhóm có mặt vòng tetrahydrofuran mở liên kết đôi với gốc ketone Thêm vào bước sóng hấp thụ factumycin 355 nm, dài so với chất kháng sinh khác nhóm (~322 nm) 22 Hình 25 Cấu trúc factumycin[46] Factumycin có khả kháng vi khuẩn Gram âm Gram dương [46][21] Năm 2011 Kyota Kimura cộng chứng minh môi trường lên men chủng Streptomyces spp K07-0034 có khả ức chế T3SS (hệ thống tiết típ 3) vi khuẩn Gram âm [31] Năm 2012,Thaker cộng phát factumycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces toxytricini (WAC 5292) có hoạt tính kháng số loại vi khuẩn Gram âm thường tìm thấy mầm bệnh đa kháng thuốc y tế như: Acinetobacter baumannii,Enterococcus faecalis, Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosavà Staphylococcus aureus [46].Trong thử nghiệm Kimura năm 2011, lây nhiễm chuột liều gây chết Citrobactor rodentium - loại vi khuẩn gây bệnh cho người tương tự Escherichia coli Kết quan sát cho thấy chuột uống audorox liều lượng 25 mg/ kg có khả sống sót sau bịnhiễm Citrobactor rodentium [31] Trong nghiên cứu in vivo tác dụng UK 69,753 glycoside factumycin chuột bị nhiễm Treponema hyodysenteriae, kết cho thấy không tìm thấy Treponema hyodysenteriae phân chuột thí nghiệm chí thời điểm 12 ngày sau thử nghiệm [28] Tuy nhiên, factumycin chưa sử dụng để kháng Xoo gây bệnh bạc lúa Những nghiên cứu chế tổng hợp factumycin Streptomycessp cho thấy cụm gen sinh tổng hợp factumycin có kích thước gần 76kb gồm 23 khung đọc mở: facAVI, facAV, facAIV, facAIII, facAII facAI (gen quy định PKS NRPS–PKS); facHIV, facHV facHI (Hypothetical protein) gene khác:facP, facRI, facT, facCII, facM, facD, facOI, facOII, facCI, facMII facB (hình 26) Trong facT gen quan trọng việc sinh tổng hợp factumycin [46] Trong nghiên cứu này, factumycin tìm thấy có dịch nuôi cấy chủng VN08-A12 Thử nghiệm kháng vi sinh vật cho thấy, dịch nuôi cấy chủng VN08-A12 có khả ức chế 23 sinh trưởng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli NBRC 14237 Xanthomonas oryzaepv.oryzae) vi khuẩn Gram dương (Micrococcus luteus NBRC 13867) Tuy nhiên, dịch nuôi cấy chủng VN08-A12 có chứa factumycin kháng vi sinh vật kiểm định khác Chúng giả thuyết factumycin sinh từ chủng VN08-A12 có phổ kháng vi sinh vật tương đối hẹp Điều giúp ích cho việc ứng dụng chế phẩm factumycin xử lý bệnh bạc lúa đồng ruộng không gây ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đất Hình 26 Cụm gen sinh tổng hợp factumycin (A) chủng WAC5292 (Streptomyces toxytricini) (B) Streptomycescattleya KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Bằng phương pháp hóa phân loại, hình thái học phân tích trình tự gen 16S rADN, chủng VN08-A12 xác định Streptomyces toxytricini - Điều kiện nuôi cấy tối ưuđể chủng VN08-A12 sinh hoạt chất kháng Xoo cao xác định sau:25 ml môi trường SKS bình định mức 250 ml ngày 30oC, cấy giống cấp tốt cấy bào tử - Hoạt chất kháng Xoo sinh chủng VN08-A12 tinh xác định factumycin 4.2 Kiến nghị Kết nghiên cứu cho thấy chủng VN08 -A12 (Streptomyces toxytricini) có tiềm ứng dụng kiểm soát sinh học bệnh bạc lúa Chính vậy, nghiên cứu tập trung vào việc cải biến di truyền chủng VN08-A12 để tăng khả sinh hoạt chất kháng Xoo phát triển chế phẩm kiểm soát bệnh bạc lúa Việt Nam [...]... thấy chủng VN08 - A12 không kháng cả hai loại vi khuẩn được kiểm tra này (Bảng 7) Như vậy, chủng VN08 - A12 có khả năng kháng rất đặc hiệu với vi khuẩn Xoo Bảng 7 Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng xạ khuẩn Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (D - d, mm) Azotobacter sp (VTCC - Pseudomonas putida B - 106) (VTCC - B - 657) - - VN08 - A12 3.2 Phân loại chủng VN08-A12 3.2.1 Phân... 3.1 Khả năng kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng xạ khuẩn VN08 - A12 được tiến hành thử hoạt tính kháng với 10 chủng Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) từ R1 đến R10 bằng phương pháp thỏi thạch Kết quả đường kính vòng hoạt tính kháng Xoo được thể hiện trong bảng 5 Bảng 5 Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 Chủng VN0 8- Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d: mm) R1 R2... 5 cho thấy chủng VN08 - A12 có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo Trong đó, chủng này có khả năng kháng mạnh đối với R2, R3 và R6 nhưng kháng yếu với R8 Bảng 6 Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 STT Chủng Vi sinh vật kiểm đinh Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d: mm) 1 Pseudomonas putida VTCC - B-657 - 2 Fusarium oxysporum ATCC - 7601 - 3 Staphylococcus aureus ATCC - 29923 - 4 Saccharomyces... cấy bằng bào tử - Hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi chủng VN08-A12 đã được tinh sạch và xác định là factumycin 4.2 Kiến nghị Kết quả trong nghiên cứu cho thấy chủng VN08 -A12 (Streptomyces toxytricini) có tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát sinh học bệnh bạc lá lúa Chính vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc cải biến di truyền chủng VN08-A12 để tăng khả năng sinh hoạt chất kháng Xoo và phát... VTCC - Y - 62 - 10 5 Bacillus subtilis VTCC - B - 888 - Kết quả cho thấychủng xạ khuẩn VN08 - A12 không ức chế vi sinh vật kiểm định nào Ngoài ra, chủng VN08 - A12 có khả năng tăng trưởng khá nhanh Vì vậy, chủng VN08 - A12 được tiếp tục kiểm tra khả năng ức chế đối với hai vi sinh vật có lợi Azotobacter sp (VTCC - B - 106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657) Kết quả thử hoạt tính cho thấy chủng. .. sinh tổng hợp factumycin [46] Trong nghiên cứu này, factumycin được tìm thấy có trong dịch nuôi cấy chủng VN08-A12 Thử nghiệm kháng vi sinh vật cho thấy, dịch nuôi cấy của chủng VN08-A12 có khả năng ức chế 23 sinh trưởng của cả vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli NBRC 14237 và Xanthomonas oryzaepv .oryzae) và vi khuẩn Gram dương (Micrococcus luteus NBRC 13867) Tuy nhiên, dịch nuôi cấy của chủng VN08-A12... không thể kháng được các vi sinh vật kiểm định khác Chúng tôi giả thuyết rằng factumycin sinh ra từ chủng VN08-A12 có một phổ kháng vi sinh vật tương đối hẹp Điều này sẽ giúp ích cho việc ứng dụng chế phẩm factumycin trong xử lý bệnh bạc lá lúa trên đồng ruộng trong khi không gây ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong đất Hình 26 Cụm gen sinh tổng hợp factumycin (A) chủng WAC5292 (Streptomyces toxytricini) ... search trên GenBank cho thấy chủng VN08-A12 có trình tự 16S rADN hoàn toàn tương đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lệ 100% Cây phân loại của chủng VN08A12 được dựng bằng phần mềm ClustalX2 và ClustalW2 cho thấy chủng nghiên cứu nằm trong cùng nhóm với nhóm chủng Streptomyces toxytricini (hình 13) Như vậy căn cứ vào các kết quả phân tich về hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa, hóa phân loại... thấy, môi trường SKS là Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d:mm) môi trường tốt nhất cho chủng VN08-A12 để sản sinh chất khángXoo 35 30 25 20 15 10 5 0 3M 16M 2M 301 N8 Môi trường nuôi cấy SKS Hình 14 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08-A12 16 3.3.2 Thời gian nuôi cấy thích hợp Chủng VN08-A12 được nuôi lắc trong môi trường SKS... hưởng của cách cấy giống đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08-A12 3.4 Tinh sạch và phân tích hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08-A12 3.4.1 Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08-A12 Dịch chiết thô của chủng VN08 - A12 được tách chiết bằng 1/2 thể tích ethyl acetate như đã mô tả trong mục 2.2.6.1 và tóm tắt ở sơ đồ hình 19 Hoạt tính kháng Xoo của dịch chiết thô được