Nghiên cứu phân lập chủng và khảo sát nguồn gen lúa khánh bệnh bạc lá lúa (xanthomonas oryzae pv oryzae)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VÀ KHẢO SÁT NGUỒN GEN LÚA KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA (XANTHOMONAS ORYZAE PV.ORYZAE) Hà Nội – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VÀ KHẢO SÁT NGUỒN GEN LÚA KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA (XANTHOMONAS ORYZAE PV.ORYZAE) Ngƣời thực : Đàm Thanh Nga MSV : 637251 Lớp : K63CNSHC Khóa : K63 Ngành : Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn : GS.TS Phan Hữu Tôn Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn đề tài “Nghiên cứu phân lập chủng khảo sát nguồn gen lúa kháng bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae pv oryzae) công trình nghiên cứu tơi thời gian qua Mọi số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn khóa luận đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, Ngày tháng năm 2023 Sinh Viên Đàm Thanh Nga i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực tập khóa luận tốt nghiệp vừa qua, với đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu phân lập chủng khảo sát nguồn gen lúa kháng bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae pv oryzae), nhận đƣợc quan tâm, ủng hộ nhƣ giúp đỡ nhiều cá nhân, tập thể để tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này: Trƣớc hết, tơi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo trƣờng Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học trang bị cho kiến thức định hƣớng đắn học tập tu dƣỡng đạo đức, tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo GS.TS Phan Hữu Tôn ln tận tình bảo, hƣớng dẫn, chia sẻ động viên suốt thời gian học tập, nghiên cứu để thực hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến KS Phan Thanh Tùng cán công tác làm việc Trung tâm Bảo tồn Phát triển nguồn gen trồng giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho q trình thực tập Cuối cùng, xin gửi lịng biết ơn sâu sắc tới thành viên gia đình ngƣời bạn ln ln động viên, hỗ trợ, ủng hộ nhiều suốt trình học tập thực đề tài Hà Nội, Ngày tháng năm 2023 Sinh Viên Đàm Thanh Nga ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan lúa 2.1.1 Giới thiệu chung 2.1.2 Nguồn gốc hình thành phát triển lúa 2.1.3 Phân loại 2.1.4 Các giai đoạn phát triển lúa 2.1.5 Tình hình sản xuất, tiêu thụ lúa gạo giới Việt Nam 2.2 Bệnh bạc lúa 2.2.1 Tác hại bệnh bạc lúa gây 2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh lúa 10 2.2.3 Triệu chứng bệnh 10 2.2.4 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh 11 2.2.5 Những nghiên cứu cách chẩn đoán bệnh bạc 12 2.2.6 Biện pháp phòng trừ bệnh bạc lúa 13 2.3 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) 14 iii 2.3.1 Vị trí phân loại 14 2.3.2 Đặc điểm hình thái đặc điểm hóa sinh 14 2.3.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Xoo giới 15 2.4 Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn Xoo Việt Nam 16 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Phƣơng pháp trồng 19 3.4.2 Phƣơng pháp phân lập lây nhiễm nhân tạo 20 3.5 Đánh giá đặc điểm nông sinh học đo suất 22 3.6 Sử dụng PCR để xác định xác vi khuẩn xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) 23 3.7 Xác định đa dạng di truyền DNA mẫu vi khuẩn Xoo pháp rep PCR IS-PCR 25 3.8 Cách thức phân tích số liệu 26 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Nuôi cấy phân lập mẫu vi khuẩn thu thập 28 4.1.1 Kết nuôi cấy mẫu vi khuẩn môi trƣờng Wakimoto 28 4.1.2 Kết sử dụng thị phân tử xác định xác vi khuẩn Xoo 29 4.1.3 Kết phân lập chủng vi khuẩn phƣơng pháp sử dụng thị phân tử rep PCR IS – PCR 30 4.2 Kết đánh giá đặc điểm nông sinh học mẫu giống nghiên cứu 35 4.3 Kết đánh giá khả kháng bệnh giống lúa triển vọng với chủng vi khuẩn thu thập phân lập đƣợc 39 iv 4.4 Đánh giá khả kháng bệnh bạc lúa giống lúa triển vọng với chủng vi khuẩn Xoo 42 PHẦN KẾT LUẬN VÀ NGHIÊN CỨU 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật CV%: Sai số thí nghiệm DNA: Deoxyribonucleic Acid FAO: Food and Agriculture Organization IRRI: International Rice Research Institute NSH: Nông sinh học PCR: Polymerase Chain Reaction QCVN: Quy chuẩn Việt Nam TCN: Trƣớc công nguyên Xoo : Xanthomonas oryzae pv oryzae vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại theo chiều dài hạt Bảng 2.2 Phân loại theo dạng hạt gạo Bảng 3.1 Danh sách địa điểm mẫu bệnh thu 18 Bảng 3.2 Danh sách nguồn gốc chủng vi khuẩn đƣợc lấy từ Viện lƣơng thực thực phẩm tỉnh Hải Dƣơng 19 Bảng 4.1 Số vạch nhân lên rep-PCR IS – PCR 33 Bảng 4.2 Thời gian sinh trƣởng mẫu, giống lúa nghiên cứu 35 Bảng 4.3 Chiều dài cây, chiều dài chiều rộng đòng 36 Bảng 4.4 Các yêu tố cấu thành nên suất 38 Bảng 4.5 Đánh giá kết lây nhiễm giống lúa triển vọng 41 vii DANH MỤC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Cây lúa Oryza sativar L Hình 2.2 Sơ đồ phát triển lúa Hình 2.3 Sản lƣợng sản xuất gạo giới tháng 01/2022 Hình 2.4 Khối lƣợng, giá trị giá gạo xuất tháng 01/2022 Hình 2.5 Triệu chứng bệnh bạc lúa 11 Hình 2.6 Hình thái Xanthomonas oryzae 14 Hình 4.1 Các mẫu vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 28 Hình 4.2 Xác định Xoo PCR với mồi XOR 29 Hình 4.3 Ảnh điện di sản phẩm rep – PCR mồi đơn ERIC2F (6 vạch) 31 Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm IS – PCR mồi đơn J3F (7 vạch) 32 Hình 4.5 Lây nhiễm bệnh bạc lúa 39 Hình 4.6 Kết lây nhiễm 40 Biểu đồ 4.1 Cây phân loại mồi đơn ERIC2F mồi đơn J3F theo chƣơng trình NTSYSpc2.1 34 viii Khi có đƣợc thống kê trên, sử dụng phần mềm chuyên dụng NTSYSpc2.1 Đồng thời xây dựng đƣợc phân loại biểu diễn quan hệ mặt di truyền mẫu vi khuẩn (Biểu đồ 4.1) Biểu đồ 4.1 Cây phân loại mồi đơn ERIC2F mồi đơn J3F theo chƣơng trình NTSYSpc2.1 Phần mềm NTSYSpc2.1 đƣợc xây dựng dựa cơng thức tính hệ số tƣơng quan mặt di truyền M Nei Li, 1979 Phần mềm cho phép xác định đƣợc hệ số tƣơng đồng di truyền có ý nghĩa r = 0,92 đề tài chọn hệ số tƣơng đồng di truyền 0,92 để phân loại mẫu vi khuẩn Xoo vào nhóm chủng khác Nhƣ vậy, phƣơng pháp rep – PCR IS – PCR, từ mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc chủng lấy Viện lƣơng thực thực phẩm tỉnh Hải Dƣơng, phân đƣợc chủng khác hệ số tƣơng đồng có ý nghĩa mặt di truyền r = 0,92 Các nhóm là: - Nhóm 1: mẫu Xoo1 Nhóm 5: mẫu Xoo5 34 - Nhóm 2: mẫu Xoo4 Nhóm 6: mẫu isolXoo2 - Nhóm 3: mẫu isolXoo1 Xoo2 Nhóm 7: mẫu isolXoo3 -Nhóm 4: mẫu Xoo3 4.2 Kết đánh giá đặc điểm nông sinh học mẫu giống nghiên cứu  Thời gian sinh trƣởng mẫu, giống lúa nghiên cứu Bảng 4.2 Thời gian sinh trƣởng mẫu, giống lúa nghiên cứu STT Tên giống TG từ gieo TG từ trỗ đến Tổng thời gian đến trỗ chín hồn tồn sinh trƣởng (ngày) (ngày) (ngày) XF10-2 99 31 130 129F15 85 37 122 Khẩu Lếch 95 33 128 11113 86 34 120 11079 80 30 110 98F16 88 37 125 X10-1 93 36 129 1090F10 75 31 106 11261 77 38 115 10 11273 89 39 128 11 T-88 86 30 116 12 285-F20 96 31 127 Nhận xét: Thời gian trỗ thời gian tính từ lúc hạt nảy mầm đến lúc trỗ 80% so với tổng số lúa Lúa mà trỗ sớm quá, làm ảnh hƣởng đến trình thụ phấn bơng lúa, dễ dẫn đến mùa (thƣờng yếu tố nhiệt độ thấp) Lúa trỗ muộn có khả bị bệnh Dựa vào bảng 4.2, ta thấy dịng XF10-2 có thời gian trỗ dài 99 ngày, dịng 1090F10 có thời gian trỗ ngắn 75 35 ngày Tất dịng có thời gian trỗ dƣới 100 ngày dịng có thời gian trỗ khác Thời gian chín lúa ảnh hƣởng đến lịch thời vụ nơng dân, lúa chín q sớm xuất bệnh vàng chín sớm, khơng gây thiệt hại nghiêm trọng nhƣng làm ảnh hƣởng đến suất lúa Thời gian chín muộn gây tình trạng nhƣ chuột phá hoại lúa, gặt muộn Theo bảng số liệu 4.2, thời gian chín khoảng 30 – 39 ngày Thời gian chín lâu 11273 thời gian chín ngắn 11079 T88 Từ bảng kết cho thấy tổng thời gian sinh trƣởng mẫu giống lúa trồng kéo dài từ 106 ngày đến 130 ngày Trong thời gian sinh trƣởng dài giống XF10-2, thời gian sinh trƣởng ngắn 1090F10  Chiều dài cây, chiều dài chiều rộng đòng Bảng 4.3 Chiều dài cây, chiều dài chiều rộng đòng STT Tên giống Chiều cao (cm) Chiều dài đòng (cm) Chiều rộng đòng (cm) X±S(x) CV (%) X±S(x) CV (%) X±S(x) CV (%) XF10-2 131,6±2,41 1,83 28,6±2,30 8,05 1,54±0,16 9,30 129F15 125,4±3,58 2,85 32,8±2,59 7,89 1,52±0,13 8,56 Khẩu lếch 139,2±2,78 1,99 38,8±3,11 8,03 1,46±0,15 9,14 11113 152,2±3,11 2,05 38,2±2,39 6,25 1,74±0,11 6,55 11079 145,4±3,21 2,21 40,4±2,41 5,96 1,68±0,13 7,76 98F16 148,6±4,51 3,03 39,2±3,27 8,34 1,66±0,11 6,87 X10-1 146,6±4,22 2,88 38,2±2,86 7,50 1,9±0,16 8,32 1090F10 147,8±3,35 2,26 34,4±3,05 8,87 1,68±0,15 8,83 11261 144,8±4,32 2,99 39,8±3,11 7,83 1,72±0,13 7,58 10 11273 130,6±5,13 3,93 37,6±2,30 6,12 1,62±0,2 10,23 11 T-88 148,6±3,44 2,31 31,6±2,30 7,29 1,7±0,13 8,05 12 285-F20 149,4±5,41 3,62 32,6±2,07 6,36 1,76±0,16 8,78 36 Nhận xét: Chiều cao có liên quan đến độ cứng khả đứng cây, tỷ lệ hạt rơm, tính cảm ứng với phân đạm Thân lúa cao làm đổ ngã, gây cản trở đến trình vận chuyển sản phẩm quang hợp hạt làm cho hạt bị lép dẫn đến giảm suất lúa Mặc dù, vùng trũng thấp, hay ngập úng lúa cao lại lợi Số liệu bảng 4.3 cho thấy, chiều cao trung bình 100cm Dịng 285-F20 có chiều trung bình cao 149,4cm Trong dịng thấp 129F15 với chiều cao thân 125,4 Chiều dài, chiều rộng đòng làm ảnh hƣởng đến khả quang hợp, làm ảnh hƣởng trực tiếp tới suất bơng lúa liên quan đến việc sản xuất hữu cung cấp cho lúa suốt q trình làm địng đến chín Sau lúa trỗ, đòng phát triển dài ra, diện tích địng góc địng định suất Diện tích địng thấp, quang hợp khơng tốt Diện tích địng lớn bị che khuất lẫn , hứng gió nhiều va chạm dẫn tới rách lá, điều kiện cho bệnh phát sinh giới Theo số liệu, chiều dài đòng biến thiên khoảng 28,6±2,30 (XF10-2) đến 40,4±2,41 (11079) Độ biến động chiều dài đòng mẫu giống tƣơng đối thấp, nhiều giống có CV%