Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có một số đặc điểm sinh học của vi sinh vật probiotic từ sản phẩm tỏi trắng lên men

LỜI CẢM ƠN Để nâng cao kỹ thuật sinh viên ngành Cơng nghệ sinh học Lâm Nghiệp nói riêng sinh viên đại học Lâm Nghiệp nói chung, đƣợc đồng ý lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp giáo viên hƣớng dẫn em xin tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có số đặc điểm sinh học vi sinh vật probiotic từ sản phẩm tỏi trắng lên men” Có đƣợc kết trƣớc hết em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cô giáo Th.S Nguyễn Thị Thu Hằng tận tâm hƣớng dẫn, bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt q trình nghiên cứu để em hoàn thành đƣợc đề tài Em xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện CNSH Lâm Nghiệp, Bộ môn Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh Bên cạnh em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình thầy, giáo tồn cán viên chức Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh tạo điều kiện, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho em để trình nghiên cứu đƣợc thuận lợi Với kết khả quan em xin tiếp tục đƣợc nghiên cứu tiếp để đề tài đạt đƣợc kết tốt Với tinh thần cố gắng, chăm nhƣ ham học hỏi nhiên với kinh nghiệm cịn hạn chế nên q trình nghiên cứu khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy, cô giáo để đề tài nghiên cứu em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 03 tháng 05năm 2019 Sinh viên thực VŨ THỊ HỒNG TOAN i M CL C LỜI CẢM ƠN i M C C ii DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv NH M C ẢNG .v NH M C H NH .vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi sinh vật probiotic .2 1.1.1 ƣợc sử nghiên cứu vi sinh vật probiotic 1.1.2 Thành phần đặc điểm vi sinh vật đƣợc sử dụng probiotic .3 1.1.3 Cơ chế tác động probiotic .3 1.2 Tổng quan vi khuẩn Bacillus 1.2.1 Đặc điểm sinh học Bacillus .6 1.2.2 inh dƣỡng tăng trƣởng 1.2.3 Một số loài Bacillus phổ biến tự nhiên 1.3 Lợi ích tỏi lên men 1.4 Cơ sở lựa chọn chủng Bacillus sản xuất chếphẩmprobiotic 12 CHƢƠNG 2: M C TIÊU, NỘI UNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 NGHIÊN CỨU 16 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Vật liệu nghiên cứu 16 2.4 Môi trƣờng nghiên cứu 17 2.5 Các phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.5.1 Phân lập chủng Bacillus có khả chịu nhiệt 18 2.5.2 Phƣơng pháp nhuộm Gram 19 2.5.3 Xác định mật độ tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc 20 2.5.4 Xác định hàm lƣợng axit sinh môi trƣờng nuôi cấy 21 2.5.5 Phƣơng pháp xác định khả sinh catalase .21 2.5.6 Khảo sát xác định khả sinh enzyme ngoại bào 22 2.5.7 Xác định khả chịu nhiệt .23 2.5.8 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 23 2.5.9 Khảo sát ảnh hƣởng số yếu tố đến sinh trƣởng vi khuẩn 24 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 ii 3.1 Kết phân lập phân lập khiết giống 26 3.2 Kết xác định đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập .27 3.3 Xác định số lƣợng vi sinh vật tế bào phƣơng pháp đếm khuẩn lạc .28 3.4 Xác định hàm lƣợng axit sinh môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn 30 3.5 Khảo sát xác định khả sinh enzyme ngoại bào 30 3.6 Khảo sát khả chịu nhiệt 32 3.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn .34 3.8 Xác định ảnh hƣởng số yếu tố đến sinh trƣởng phát triển vi khuẩn .36 3.8.1 Ảnh hƣởng pH ban đầu môi trƣờng nuôi cấy .36 3.8.2 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy .37 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 iii DANH M C CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CFU TB Colony Forming Unit Tế bào VSV Vi sinh vật CMC Cacborxyl Methy cellulose VK G Vi khuẩn Gram G (+) Gram dƣơng G (-) Gram âm LB Luria Bertani NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth iv DANH M C ẢN Bảng 2.1 Danh sách hóa chất 17 Bảng 2.2 Môi trƣờng Luria Bertani (LB) cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn 17 Bảng 2.3 Mơi trƣờng xác định hoạt tính enzyme 17 Bảng 3.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus từ mẫu tỏi đen 26 Bảng 3.2: Kết xác định hình dạng tế bào, hoạt tính calatase đặc điểm Gram chủng vi khuẩn phân lập 27 Bảng 3.3 Kết xác định số loại vi sinh vật số lƣợng tƣơng ứng với loại sản phẩm tỏi đen 29 Bảng 3.4 Khả sinh axit môi trƣờng nuôi cấy 30 chủng vi khuẩn 30 Bảng 3.5 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn 31 Bảng 3.6 Tổng hợp hình ảnh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn phân giải cellulose 1%, tinh bột 1% casein 1% 31 Bảng 3.7 Khả sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn nhiệt độ khác 33 Bảng 3.8 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định ba chủng vi khuẩn .35 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng pH ban đầu môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn 36 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến tạo thành sinh khối chủng vi khuẩn 38 v DANH M C H NH Hình 1.1 Hình thái tế bào Bacillus subtilis .6 Hình 2.1 Sơ đồ hóa q trình nghiên cứu 18 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc sinh khối chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập 26 Hình 3.2 Khả chịu nhiệt chủng B7 nhiệt độ khác 33 Hình 3.3 Sơ đồ hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định ba chủng .35 Hình 3.4 Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định chủng B3 35 Hình 3.5 Ảnh hƣởng độ pH môi trƣờng đến sinh trƣởng, phát triển chủng vi khuẩn B3, B6, B7 37 Hình 3.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến sinh trƣởng chủng 38 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với mục đích bảo vệ sức khỏe cho ngƣời sử dụng, bảo vệ môi trƣờng sống không bị nhiễm hố chất độc hại Do vậy, nhà khoa học khuyến cáo nên hạn chế cấm sử dụng số loại thuốc, đặc biệt thuốc kháng sinh thay thuốc kháng sinh sản phẩm chức có lợi cho sức khỏe Từ đó, sản phẩm lên men có lợi cho sức khỏe đƣợc ngƣời tiêu dùng quan tâm Các sản phẩm khơng làm phong phú văn hóa ẩm thực mà cịn góp phần cung cấp cho ngƣời chất dinh dƣỡng dƣới dạng hợp chất đơn giản dễ tiêu thụ, đặc biệt sản phẩm lên men mang lại cho ngƣời thể khỏe mạnh nhờ thành phần có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe, chống lại bệnh tật tác dụng y học khác Tỏi đen sản phẩm lên men từ tỏi trắng, đƣợc sử dụng rộng rãi với vai trò thực phẩm chức giúp tăng cƣờng sức khỏe Trong suốt trình này, màu trắng tỏi chuyển sang màu đen phản ứng Maillard Browning Gần đây, loại tỏi đen đƣợc phát triển Nhật ản cách chế biến tỏi tƣơi thông thƣờng theo đƣờng nhiệt độ độ ẩm Sản phẩm tỏi trắng lên men đƣợc tạo thành nhờ lên men tỏi trắng thực hoạt động vi sinh sinh điều kiện nhiệt độ cao o vậy, sản phẩm tỏi lên men có khả chứa mật độ cao vi sinh vật có khả chịu nhiệt, chịu axit, Nhóm vi sinh vật đƣợc sử dụng phổ biến công nghệ lên men tỏi: Bacillus, lactobacillus, nấm men Với mục tiêu phân lập vi sinh vật có số đặc điểm sinh học probiotic nhƣ khả chịu nhiệt độ cao, chịu axit, chịu muối, sản sinh số enzym ngoại bào với mật độ cao Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, theo xu hƣớng cơng nghệ sinh học giới nay, nhƣ nguồn lợi vi sinh vật lên men tỏi phong phú, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn có số đặc điểm sinh học vi sinh vật probiotic từ sản phẩm tỏi trắng lên men” CHƢƠN TỔN QUAN VẤN ĐỀ N HIÊN CỨU 1.1 Tổng quan vi sinh vật probiotic 1.1.1 Lược sử nghiên cứu vi sinh vật probiotic Lịch sử nghiên cứu vi sinh vật probiotic năm cuối kỷ 19, nhà vi sinh vật học phát khác biệt hẹ vi sinh ống tiêu hóa ngƣời bệnh ngƣời khỏe mạnh Năm 1925, Beach ngƣời có nghiên cứu thực nghiệm thức ăn có chứa VK "Lactobacillus acidophilus" [23] Năm 1965, thuật ngữ probiotic đƣợc đƣa Lilly Stillwell, nhằm mơ tả VSV có khả kích thích sinh trƣởng số vật ni [13] Năm 1968, King nghiên cứu thành công việc kích thích tăng trƣởng heo thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [22,23] Năm 1989, Fuller, nhiều nhà khoa học khác nhƣ ee (Singapore), Nomoto (Nhật), Salminen (Phần an), Gorbach ( nh) (1999) thống định nghĩa: "Probiotic chế phẩm sinh học thức ăn bổ sung có chứa VSV sống có ảnh hƣởng tốt cho sức khỏe vật chủ cách cải thiện cân hệ vi sinh đƣờng ruột" [3, 22, 23] Năm 2001, Schrezenmeir eVrese định nghĩa: “Probiotic lƣợng vi sinh vật xác định với số lƣợng thích hợp đƣợc chuẩn bị sản phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật đƣờng ruột ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe vật chủ” Theo định nghĩa F O/WHO năm 2002: “Probiotic vi sinh vật sống đƣợc kiểm sốt chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” [21] 1.1.2 Thành phần đặc điểm vi sinh vật sử dụng probiotic Hiện nay, có khoảng gần 20 lồi vi khuẩn (VK) đƣợc sử dụng chế phẩm probiotic Trong VK lactic VK Bacillus có lợi giữ vai trị đƣợc sử dụng nhƣ L acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subs., Lactobacillus casei, L plantarum, L bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium, VK Bacillus VK lactic có khả bám chặt vào màng nhầy ruột, ức chế bám vi sinh vật (VSV) gây bệnh Sản xuất acid lactic để làm giảm pH đƣờng ruột, tạo mơi trƣờng khơng thuận lợi cho VSV có hại phát triển Ngồi ra, chúng cịn sản xuất chất kháng sinh, sinh H2O2, sản xuất enzyme tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), vitamin, khử độc tố đƣờng ruột [2, 22, 23] Tham gia vào thành phần vi sinh vật probiotic cịn có nấm men nhƣ Saccharomyces cerevisiae Sacharomyces boulardii Nấm men khả làm cân hệ VSV đƣờng ruột cịn có vai trị tạo sinh khối nhanh, sinh khối giàu acid amin, vitamin (nhóm , ), tiết chất có khả hấp thu độc tố thải Chúng lên men chuyển hóa glucose thành acid pyruvic chất cho VSV có lợi khác đƣờng ruột hoạt động sinh sản Nấm men tiết enzyme tiêu hóa nhƣ amylase, cellulase, protease, cịn có khả đề kháng lại với tất kháng sinh (trừ kháng sinh nấm) Chính vậy, chúng tồn nơi đƣờng ruột vật ni mà hồn tồn khơng bị kháng sinh tiêu diệt [2, 7, 22, 23] Có thể tóm tắt đặc điểm chung VSV probiotic là: Có khả gắn vào tế bào; loại bỏ hay hạn chế gắn tác nhân gây hại; tồn lâu dài sinh sản nhanh; tạo chất chống lại phát triển tác nhân gây bệnh; không lan truyền rộng, không gây ung thƣ không gây bệnh 1.1.3 Cơ chế tác động probiotic Vi sinh vật probiotic đƣợc bổ sung vào thể vật chủ, tác động lên đƣờng tiêu hóa vật chủ theo chế nhƣ cạnh tranh đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sản sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch thể vật chủ,…  Cạnh tranh đối kháng với vi khuẩn gây bệnh: Hệ vi sinh vật đƣờng ruột tiêu hóa cân nhiều nguyên nhân khác nhau, nguyên nhân việc sử dụng kháng sinh dài ngày dẫn đến việc tiêu diệt vi sinh vật có lợi ruột Để khắc phục điều này, nhà khoa học thƣờng bổ sung vi sinh vật có lợi thơng qua sử dụng probiotic Khi cung cấp thƣờng xuyên VSV có lợi dƣới dạng sữa lên men dạng đông khô cho ngƣời động vật với liều lƣợng thích hợp (1,2 tỉ CFU/kg thức ăn/ngày), vi sinh vật phát triển, chiếm ƣu cạnh tranh với VSV có hại vị trí bám, hấp thu chất dinh dƣỡng, khối lƣợng chất sinh VSV [11, 83, 14, 22]  Sản xuất chất kháng khuẩn: Tác nhân ức chế VK gây bệnh VK lactic khơng acid lactic mà cịn chất ức chế đặc hiệu khác nhƣ acid hữu cơ, ethanol, H2O2, diacetyl, [8, 23, 26] Trong VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sản sinh acid lactic nhóm VK lactic lên men dị hình tạo acid hữu khác nhƣ acid acetic, acid formic, acid propionic,…Những sản phẩm làm giảm pH môi trƣờng pH đạt đến mức đủ để loại trừ VSV gây hại đƣờng ruột Chẳng hạn nhƣ VSV gây thối hỏng thực phẩm (B subtilis, P vulgaris, B mensenterium, Clostridum), VSV gây bệnh nhƣ E coli (gây viêm ruột động vật non trẻ em), Salmonella typhimurium, Salmonella cholerasuis (gây sốt thƣơng hàn) Một số lồi nhƣ Lactococcus lactic, Leuconostoc cremoris sản sinh H2O2 chuyển từ mơi trƣờng kị khí sang hiếu khí H2O2 có khả ức chế Staphylococus aureus loại tụ cầu vàng gây nhiễm độc thức ăn [2, 8] Hoạt tính ức chế iacetyl tăng lên môi trƣờng acid, ức chế mạnh VK gram âm nấm mốc, đặc biệt với M turberculosis (VK gây bệnh lao) trình bày Bảng 3.5 phần hình ảnh thu nhận trình nghiên cứu trình bày Bảng 3.6 ảng 3.5 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn Kí hiệu chủng vi Thời gian khuẩn (h) 24 B3 48 72 24 B6 48 72 24 B7 48 72 Đƣờng kính vịng phân giải D-d (mm) Casein (1%) CMC (1%) Tinh bột (1%) 12,3 ± 0,58 15,0 ± 1,73 15,0 ± 1,73 13,3 ± 0,58 10,3 ± 0,03 19,8 ± 0,12 15,0 ± 1,73 18,5 ± 0,10 25,2 ± 0,30 11,3 ± 0,58 16,3 ± 0,30 25,9 ± 0,40 18,4 ± 0,11 12,3 ± 0,58 22,7 ± 0,26 20,1 ± 0,10 11,4 ± 0,30 30,1 ± 0,02 15,0 ± 1,73 19,2 ± 0,23 35,3 ± 0,05 10,7 ± 0,22 21,6 ± 0,20 29,4 ± 0,03 15,0 ± 1,73 18,4 ± 0,01 22,8 ± 0,11 ảng 3.6 Tổng hợp hình ảnh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn phân giải cellulose 1%, tinh bột 1% casein 1% Hoạt tính Kí hiệu chủng vi khuẩn Đối chứng B3 B6 enzyme Protease Cellulase Amylase 31 B7 Kết cho thấy chủng vi khuẩn khảo sát có khả sinh loại enzym ngoại bào - đặc tính bật chủng Bacillus để chúng thích nghi tồn với điều kiện mơi trƣờng sống khác [6] Trong số chủng vi khuẩn phân lập, chủng B7 có khả sinh loại enzyme ngoại bào mạnh nhất, khả sinh amylase cellulose mạnh: khả sinh Protease đạt 19,2 mm sau 24 - 48h nuôi cấy, khả sinh cellulase: 21,6 mm khả sinh amylase 35,3 mm sau 24 – 48h nuôi cấy Chủng B3 chủng có khả sinh loại enzyme ngoại bào trung bình (D – d = 10,3 ÷ 25,2 mm) Chủng B6 chủng có khả sinh protease mạnh: 30,1 mm, khả sinh cellulase trung bình 12,3 mm, khả sinh amylase trung bình 11,3 mm Hoạt tính amylase protease chủng B6, B7 thể tốt Chủng cịn lại thể hoạt tính trung bình Vi sinh vật chuyển hóa tinh bột vi sinh vật phân giải tinh bột có vai trị quan trọng việc lên men tỏi Ngồi cịn dc sử dụng để sản xuất công nghiệp sản xuất rƣợu, bia, cồn, đƣờng… Ngồi ra, thời điểm định tính enzyme, thời điểm 24 chủng vi khuẩn có vịng phân giải chất lớn Do vậy, khóa luận đề xuất sử dụng chủng vi khuẩn B3, B6, B7 vào nghiên cứu ứng dụng để thu nhận enzyme ngoại bào nên thu hồi dịch enzyme canh trƣờng nuôi cấy chủng vi khuẩn thời điểm sau 24 nuôi cấy Qua bƣớc tuyển chọn xác định khả sinh enzyme ngoại bào, định chọn 3, 6, để tiếp tục cho nghiên cứu 3.6 Khảo sát khả chịu nhiệt Nhiệt độ yếu tố mơi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới sinh trƣởng phát triển vi khuẩn q trình ni cấy nhƣ thực tiễn Ở điều kiện ni cấy phịng thí nghiệm, chủng ni cấy thƣờng có giá trị nhiệt độ xác định thích hợp cho q trình sinh trƣởng phát triển Do vậy, tiến hành khảo sát khả chịu nhiệt chúng 32 nhiệt độ khác theo phƣơng pháp 2.5.7 Kết thu đƣợc trình bày Bảng 3.7 phần hình ảnh nhận đƣợc trình bày Hình 3.2 ảng 3.7 Khả sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn nhiệt độ khác SSTT Khả chịu nhiệt Chủng 250C 370C 400C 550C 700C 11 B3 + + ++ +++ +++ 22 B6 + + ++ +++ +++ 33 B7 ++ +++ +++ +++ +++ Ghi chú: +: Vi khuẩn sinh trƣởng ++: Vi khuẩn sinh trƣởng trung bình +++: Vi khuẩn sinh trƣởng mạnh Hình 3.2 Khả chịu nhiệt chủng B7 nhiệt độ khác 33 Kết Bảng 3.7 cho thấy: Ba chủng phân lập có khả sinh trƣởng, phát triển nhiệt độ từ 25-70°C Trong đó, khoảng nhiệt độ từ 37-70°C chủng sinh trƣởng mạnh sau 24 nuôi cấy Ở nhiệt độ 25°C, chủng sinh trƣởng yếu Nhiệt độ 40-55°C nhiệt độ nƣớc phù hợp cho việc lên men tỏi đen, nhiệt độ 70°C nhiệt độ thích hợp cho việc sấy khơ tỏi Vì vậy, kết cho thấy chủng B7 chủng đạt yêu cầu Nhƣ vậy, qua bƣớc sàng lọc tuyển chọn đặc tính probiotic chủng Bacillus điều kiện in vitro, chúng tơi nhận thấy chủng B7 có tiềm sử dụng lên men tỏi có nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ: Có khả sinh loại enzyme ngoại bào, có khả sinh trƣởng mạnh nhiệt độ cao, có khả chuyển hóa nguồn carbon thành axit – đặc điểm cần thiết để đáp ứng làm ứng viên vi khuẩn tiềm cho ứng dụng vào trình lên men tỏi tạo sản phẩm lên men từ nguồn vật liệu thực vật, công nghiệp sản xuất enzyme, công nghiệp sản xuất giấy… 3.7 Xác định hoạt tính kháng khuẩn Để xác định khả ứng dụng ba chủng vi khuẩn phân lập từ tỏi đen có số đặc điểm sinh học vi khuẩn probiotic (có hoạt tính enzyme ngoại bào cao, có khả chịu nhiệt, sinh axit vào) công nghệ sản xuất thực phẩm lên men Khóa luận tiếp tục khảo sát hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn vi sinh vật kiểm định có khả gây bệnh đƣờng ruột gồm E coli (gây tiêu chảy, viêm ruột, tạo độc tố đƣờng ruột), Salmonella typhimurium (sốt thƣơng hàn, gây tiêu chảy) Shigella (trực khuẩn lị gây bệnh đƣờng ruột, tiêu chảy ngƣời vật nuôi) Khả đối kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn đƣợc xác định phƣơng pháp khoan lỗ thạch Hoạt tính ức chế, đối kháng vi khuẩn đƣợc đánh giá hiệu số (D – d, mm) Kết nhận đƣợc thể Bảng 3.8 Hình 3.3 Hình 3.4 34 ảng 3.8 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định ba chủng vi khuẩn Kí hiệu Đƣờng kính vịng kháng khuẩn (D-d) mm chủng E coli Salmonella Shigella B3 23,1 ± 0,26 8,3 ± 0,42 B6 27,8 ± 1,28 10,4 ± 0,18 16,2 ± 0,23 B7 10,7 ± 0,37 5,8 ± 0,29 STT Hình 3.3 Sơ đồ hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định ba chủng Hình 3.4 Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định chủng B3 Chúng nhận thấy, hầu nhƣ tất chủng vi khuẩn khảo sát có khả ức chế với chủng vi khuẩn kiểm định mức độ khác Trong chủng B6 kháng tƣơng đối mạnh với E coli 27,8 mm, có mức kháng khuẩn trung bình chủng Salmonella 10,4 mm Shigella 16,2 mm) Dựa 35 vào kết này, chọn chủng để thực bƣớc chọn lọc 3.8 Xác định ảnh hƣởng số yếu tố đến sinh trƣởng phát triển vi khuẩn 3.8.1 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy Trị số pH ban đầu mơi trƣờng có vai trị quan trọng, góp phần tạo điều kiện thuận lợi cho VK đồng hóa tổng hợp chất cần thiết Nên pH có ảnh hƣởng rõ rệt đến tạo thành sinh khối tế bào o đó, pH yếu tố quan trọng cần đƣợc nghiên cứu Để xác định ảnh hƣởng pH ban đầu đến tạo thành sinh khối tế bào chủng nghiên cứu, tiến hành nuôi chủng B3, B6 B7 điều kiện lắc 180 vịng/phút mơi trƣờng LB dịch thể có pH khác (pH= 4, pH=5, pH=6, pH=7, pH=8) nhiệt độ 37℃ 48 Kết đƣợc đánh giá qua số OD600nm biểu thị mật độ tế bào vi khuẩn đƣợc thể Bảng 3.9 ảng 3.9 Ảnh hƣởng pH ban đầu môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh trƣởng chủng vi khuẩn Trị số OD600nm PpH Chủng B3 Chủng B6 44 0,943 0,823 0,801 55 1,883 1,732 1,629 66 1,956 1,635 1,621 77 2,292 2,183 2,215 88 2,171 2,101 2,034 36 Chủng B7 OD 600mm 2.5 1.5 B3 B6 B7 0.5 pH mơi trƣờng ni cấy Hình 3.5 Ảnh hƣởng độ pH môi trƣờng đến sinh trƣởng, phát triển chủng vi khuẩn B3, B6, B7 Kết trình bày Bảng 3.5 Hình 3.6 cho thấy, chủng B3, B6, B7 có khả sinh trƣởng dải pH rộng pH tăng từ 4-7 mật độ tế bào tăng theo cao pH = (OD600nm= 2,292 chủng B3, OD600nm = 2,183 chủng B6, OD600nm = 2,215 chủng 7) Sau tăng pH lên mật độ tế bào giảm Do vậy, pH môi trƣờng ban đầu thích hợp cho sinh trƣởng ba chủng vi khuẩn pH 3.8.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Để xác định thời điểm ni cấy thích hợp cho sinh trƣởng sinh enzyme chủng, nhằm thu nhận sinh khối tế bào hiệu sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo, tiến hành nuôi cấy chủng nghiên cứu LB-lỏng nhiệt độ 37°C, lắc 150 vòng/phút Thu nhận mẫu thời điểm 24, 36, 48 56 Kiểm tra mật độ TB hoạt tính enzyme chủng Kết đƣợc thể qua Bảng 3.10 Hình 3.6 37 ảng 3.10 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến tạo thành sinh khối chủng vi khuẩn Stt Thời gian nuôi cấy Trị số OD600nm (giờ) Chủng B3 Chủng B6 Chủng B7 24 0,721 0,756 0,675 36 1,213 1,195 1,186 48 1,952 1,819 1,895 52 2,256 2,212 2,235 OD600mm 2.5 1.5 Chủng B3 Chủng B6 Chủng B7 0.5 24 36 48 52 Thời gian ni cấy (h) Hình 3.6 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến sinh trƣởng chủng Qua số liệu Bảng 3.6 nhận thấy, sinh trƣởng 3, 6, đạt cực đại thời điểm 48 (Chủng B3: OD600nm = 0,952; chủng B6: OD600nm = 0,919; chủng B7: OD600nm = 0,895) Trong khoảng thời gian 48 – 52 mật độ vi sinh vật tăng khơng đáng kể Mật độ vi khuẩn Bacillus có chiều hƣớng tăng dần từ 24 – 52 Kết nhận đƣợc cho phép khẳng định thời gian thu nhận sinh khối vi khuẩn chủng B3, B6 B7 tốt sau 48 nuôi cấy 38 CHƢƠN KẾT LUẬN VÀ KIẾN N HỊ 4.1 Kết luận Từ thực nghiệm, khóa luận thu đƣợc kết nhƣ sau: - Đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn ký hiệu 3, B6 có khả thuộc chi Bacillus, có đặc điểm sinh lý sinh hóa: + Hình trực khuẩn, vi khuẩn gram dƣơng, sinh bào tử có khả chịu nhiệt + Có khả sinh catalase + Có mật độ tế bào sản phẩm tỏi lên men là: Chủng 3: 2,4 x10 10 (CFU/g); chủng 6: 1,6 x1010 (CFU/g) chủng 7: 1,0 x1010 (CFU/g) - Đã xác định đƣợc khả sinh axit ba chủng vi khuẩn 3, B7 môi trƣờng nuôi cấy là: 0,26%, 0,24%, 0,31%(w/v) Chủng sinh axit với hàm lƣợng axit cao nhất, đạt 0,31% - Đã xác định đƣợc khả sinh số enzyme ngoại bào thời điểm thu hồi enzyme ngoại bào tốt ba chủng vi khuẩn: + Chủng B7 chủng có khả sinh enzyme ngoại bào mạnh protease 35,3 mm sau 24 – 48h nuôi cấy - Cả ba chủng vi khuẩn 3, có khả sinh trƣởng, phát triển mạnh nhiệt độ 55 - 70℃ - Đã xác định khả đối kháng số vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột chủng vi khuẩn - Đã xác định đƣợc ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng nuôi cấy đến sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn: pH ban đầu môi trƣờng ni cấy thích hợp cho nhân giống chủng vi khuẩn pH 7,0; thời gian ni cấy thích hợp cho thu nhận sinh khối vi khuẩn sau 48h nuôi cấy 39 4.2 Kiến nghị Do thời gian thực đề tài ngắn nên cịn nhiều thí nghiệm chƣa đƣợc triển khai Để tăng tính xác ứng dụng đề tài đề nghị triển khai cứu thêm số nội dung sau: - Tất thí nghiệm đƣợc lặp lại để tăng tính xác đề tài - Trong thí nghiệm tối ƣu chất phổ thí nghiệm cịn hẹp nên cần mở rộng phổ - Định danh chủng B3 kỹ thuật sinh học phân tử 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt Đào Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu sử dụng nhóm vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí mơi trường nước nuôi thủy sản, uận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học Cơng nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 105-108 ê Ngọc Tú, et al (1982), Enzyme vi sinh vật, Vol 2, NX Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Ngô Tự Thành (2001), ph n ố, sinh trư ng sinh t ng h p protease ngoại Bacillus v ng Nội, Tạp chí Sinh học 23, pp 153-157 5.Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ (2008), Ph n lập sàng lọc số chủng Bacillus có hoạt tính pro iotic nuôi trồng thủy sản, uận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Quỳnh Quyên (2008), Nghiên cứu tuyển chọn số chủng Bacillus làm pro iotic chăn nuôi, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đh Sƣ phạm Tp.HCM Nguyễn ân ũng and cs (1972), Một số phương pháp nghiên cứu V V học, NX Khoa học Kĩ Thuật, Hà Nội Nguyễn ân ũng, Nguyễn, Đình Quyến, Phạm, Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, NX Giáo dục, 224-230 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn, uy Thảo (1996), Vi sinh vật học, NX Giáo dục, Hà Nội 10 Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hịa (2005), Vi sinh vật y học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 11 Trần Bích Ngọc, Từ Thị Mỹ Hƣờng, Đinh Xuân ãm (2015), Nghiên cứu lên men Tỏi đen từ tỏi trắng xã Quảng Hòa- Quảng Trạch 12 Trần Thanh Thủy (1999), ướng dẫn th c hành vi sinh vật học, NXB 41 Giáo dục 13 Trần Tƣờng ƣu (1994), ánh giá v số khía cạnh mơi trường liên quan đến ệnh tơm khu v c phía Nam, Viện Nghiên cứu mơi trƣờng thủy sản II, Chƣơng trình Khảo sát nguyên nhân gây chết tơm ni khu vực phía Nam biện pháp phịng trừ để phát triển nghề ni tơm 14 Trần Thị Mỹ Trang (2006), Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm pro iotic phòng trị ệnh đường ruột cho heo, Trƣờng Đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh Tài liệu tham khảo tiếng anh 15 Bae SE, Cho SY, Won YD, Lee SH, Park HJ A comparative study of the different analytical methods for analysis of S-allyl cysteine in black garlic by HPLC LWT-Food Sci Technol 2012;46(2):532-5 https://doi.org/10.1016/j lwt.2011.11.013 16 Bulla, Lee A, Costilow, Ralph N, and Sharpe, Eugene S (1978), "Biology of Bacillus popilliae", Advances in Applied Microbiology 23, pp 1-18 17 Chabrillón, Mariana, et al (2006), "Interference of Listonella anguillarum with potential probiotic microorganisms isolated from farmed gilthead seabream (Sparus aurata, L.)", Aquaculture Research 37(1), pp 78-86 18 Chandrashekar PM, Venkatesh YP Fructans from aged garlic extract produce a delayed immuno adjuvant response to ovalbumin antigen in BALB/c mice Immunopharm Immunot 2012;34(1):174-80 https://doi.org/10.3109/089239 73.2011.584066 ; PMid:21631395 19 CNSI (2012), Clinical and Laboratory Standards Institute Administrative Procedures, accessed May 7th-2017, from http://clsi.org/wpcontent/uploads/2013/07/CLSI-Admin-Procedures2.pdf 20 El–Serag HB, Rudolph KL Hepatocellular carcinoma: epidemiology and molecular carcinogenesis Gastroenterology 2007;132(7):2557-76 https:// doi.org/10.1053/j.gastro.2007.04.061 ; PMid:17570226 42 21 FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live actic cid acteria Galassi G.; Sandurucci ; Tamburrini.; Succi G.; “Energy uutilization of a low N-diet added with an antibiotic or with a probitic in fattening pigs”, in nimal physiology – Nutrition, Proceedings of the 15th symposium on energy metabolism in animals, Wageningen, p 145-148, 2001 22 Fleischauer AT, Arab L Garlic and cancer: a critical review of the epidemiologic literature J Nutr 2001;131(3):S1032-40 23 Garriga, Margarita, et al (1998), "Selection of lactobacilli for chicken probiotic adjuncts", Journal of applied microbiology 84(1), pp 125-132 Hoshino T, Kashimoto N, Kasuga S Effects of garlic preparations on the gastrointestinal mucosa J Nutr 2001;131(3):S1109-13 24 Jang EK, Seo JH, Lee SP Physiological activity and antioxidative effects of aged black garlic (Allium sativum L.) extract Korean J Food Sci Technol 2008;40(4):443- 25 Kang MJ, Lee SJ, Shin JH, Kang SK, Kim JG, Sung NJ Effect of garlic with different processing on lipid metabolism in 1% cholesterol fed rats J Korean Soc Food Sci Nutr 2008;37(2):162-9 https://doi.org/10.3746/ jkfn.2008.37.2.162 26 Kesarcodi-Watson, Aditya, et al (2008), "Probiotics in aquaculture: the need, principles and mechanisms of action and screening processes", Aquaculture 274(1), pp 1-14 27 Kim JH, Nam SH, Rico CW, Kang MY A comparative study on the antioxidative and anti-allergic activities of fresh and aged black garlic extracts Int J Food Sci Technol 2012;47(6):1176-82 https://doi.org/10.1111/ j.13652621.2012.02957.x 28 Kodera Y, Suzuki A, Imada O, Kasuga S, Sumioka I, Kanezawa A, et al Physical, chemical, and biological properties of S-allylcysteine, an amino acid derived from garlic J Food Chem 2002;50(3):622-32 https://doi org/10.1021/jf0106648 43 29 Lee, Yuan-Kun, et al (1999), Handbook of Probiotics, WileyInterscience Lybarger JA, Gallagher JS, Pulver DW, Litwin A, Brooks S, Bernstein IL Occupational asthma induced by inhalation and ingestion of garlic J Allergy Clin Immun 1982;69(5):448-54 https://doi.org/10.1016/0091- 6749(82)90120 30 Moriarty, DJW (1998), "Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds", Aquaculture 164(1), pp 351-358 31 Mosilhey, Sameh Hassan (2003), "Influence of different capsule materials on the physiological properties of microencapsulated Lactobacillus acidophilus", Abstract Dissertation Institut für Lebensmitteltechn Bonn 32 Netherwood, Trudy, et al (1999), "Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointestinal tract", Applied and Environmental Microbiology 65(11), pp 5134-5138 33 Park, Seung Hwan, Kim, Ha Keun, and Pack, Moo Young (1991), "Characterization and structure of the cellulase gene of Bacillus subtilis BSE616", Agricultural and biological chemistry 55(2), pp 441-448 34 Priest, FG, et al (1987), "Bacillus amyloliquefaciens sp nov., nom rev", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 37(1), pp 69-71.Nguyen N, Giang M, Nguyen Tu Biological Activities of Black Garlic Fermented with Lactobacillus plantarum PN05 and Some 35 Kinds of Black Garlic Presenting Inside Vietnam Indian J of Pharmaceutical Education and Research 2017 36 Ruddock PS, Liao M, Foster BC, Lawson L, Arnason JT, Dillon JAR Garlic natural health products exhibit variable constituent levels and antimicrobialactivity against Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis https://doi.org/10.1002/ptr.1667; Phytother Res 2005;19(4):327-34 PMid:16041728.hyperplasia cancer Nutr Res 2003;23(2):199-204 44 and prostate 37 Sasaki JI, Lu C, Machiya E, Tanahashi M, Hamada K Processed black garlic (Allium sativum) extracts enhance anti-tumor potency against mouse tumors Med Aromat Plant Sci Biotechnol 2007;1(2):278-81 38 Sultan MT, Buttxs MS, Qayyum MMN, Suleria HAR Immunity: plants as effective mediators Crit Rev Food Sci Nutr 2014;54(10):1298-308 https:// doi.org/10.1080/10408398.2011.633249 ; PMid:24564587 39 Wang X, Jiao F, Wang QW, Wang J, Yang K, Hu RR, et al Aged black garlic extract induces inhibition of gastric cancer cell growth in vitro and in vivo Mol Med Rep 2012;5(1):66-72 PMid:21922142 40 Yılmaz E, evrim E, Perk H, Kaỗmaz M Consumption of aqueous garlicextract leads to significant improvement in patients with benign prostate 45