BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN KHÁNG PSEUDOMONAS SOLANACEARUM GÂY HÉO CÂY TRỒNG" pdf

năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng P.solanacearum 12 gây bệnh héo lá trên

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ

KHUẨN KHÁNG PSEUDOMONAS

SOLANACEARUM GÂY HÉO CÂY TRỒNG

Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Trịnh Thành Trung, Nguyễn Thị Anh Đào

Trung tâm Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh héo cây gây ra bởi vi khuẩn Pseudomonas

solanacearum là một bệnh phổ biến và nghiêm trọng ở

nhiều loại cây hoa màu như cà chua, khoai tây, lạc, ớt,

gừng vv Đây là bệnh chủ yếu gây giảm năng suất và mất mùa lạc ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt

nam, Indonesia Hàng năm nạn dịch xảy ra gây thiệt hại từ 50-90% năng suất cây trồng Mặc dù đã có một số nghiên cứu tập trung nghiên cứu về Pseudomonas solanacearum nhưng việc kiểm soát loại vi khuẩn gây héo này vẫn còn quá xa so với kết quả mong muốn Với mục tiêu sử dụng đấu tranh sinh học nhằm góp phần giảm thiểu những tổn

thất cho mùa màng do vi khuẩn Pseudomonas

solanacearum gây ra, vì vậy chúng tôi tiến hành phân lập,

tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh ức chế và tiêu diệt loài vi khuẩn gây héo này Các vi

sinh vật đối kháng có khả năng tiêu diệt Pseudomonas solanacearum sẽ được sử dụng trong sản xuất phân bón

chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chủng giống

- Chủng xạ khuẩn, các vi sinh vật kiểm định từ Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật

- Các chủng Pseudomonas solanacearum từ Viện khoa

học kỹ thuật Nông nghiệp

Môi trường

Môi trường Gauze I và II; ISP-4; A-4H; A-4 ; A-9; A-12; ISP-6 (pepton-cao nấm men-sắt);

ISP-9; 79; Glyxerin- nitrat thạch; Gluco-asparagin thạch; ISP-3 (Thạch - đại mạch)

Phương pháp

Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

- Phương pháp thỏi thạch (Dùng để sơ tuyển xạ khuẩn)

- Phương pháp đục lỗ (Xác định kháng sinh trong môi

trường dịch thể )

Phương pháp xác định trọng lượng sinh khối khô

Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại [1, 4]

Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh: Môi trường lên men, nhiệt

độ, pH ban đầu, thời gian lên men, nguồn carbon, nguồn nitơ

ảnh hưởng của xạ khuẩn đến cây trồng

- ảnh hưởng của dịch nuôi xạ khuẩn đến khả năng nảy mầm của lạc

- ảnh hưởng của xạ khuẩn đến sự phát triển của cây lạc non

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chủng xạ khuẩn L30 được phân lập từ đất, được nuôi trên môi trường ISP-4 sau 5 ngày, xác định hoạt tính kháng

sinh Kết quả trên bảng 1 cho thấy chủng xạ khuẩn có khả

năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi khuẩn và

nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng

(P.solanacearum 12 gây bệnh héo lá trên khoai tây,

P.solanacearum 20 gây bệnh trên cà chua và

P.solanacearum 222 gây bệnh trên cây lạc)

Bảng 1 Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30

Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn L30

Chủng xạ khuẩn được nuôi trên 6 môi trường để xác định đặc điểm nuôi cấy (bảng 2) và các đặc điểm sinh lý, sinh hoá (bảng 3)

Bảng 2: Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn L30

Bảng 3: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng xạ khuẩn

L30

Từ kết quả bảng 2 và 3 dựa theo các bản mô tả của Shirling

và Gottlieb đồng thời dựa vào khoá phân loại của Gauze và cộng sự [1,4]: chủng L30 có các đặc điểm không giống với các loài đã được mô tả, nên tạm gọi là Streptomyces sp

L30 Cần được tiếp tục phân loại bằng phương pháp hoá phân loại và sinh học phân tử

Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30

Môi trường thích hợp

Trong lên men công nghiệp, sau khi tìm được chủng có hoạt tính cao cần phải lựa chọn môi trường thích hợp nhất Một môi trường thích hợp là vừa đảm bảo chủng có khả năng sinh trưởng tốt vừa sinh ra các sản phẩm mong muốn với hiệu suất tối ưu

Chủng L30 được nuôi cấy trên 6 loại môi trường, sau 5 ngày ở 30oC

Hình 1 Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng

sinh của chủng L30

Kết quả hình 1 cho thấy: Chủng xạ khuẩn đều sinh trưởng

và cho hoạt tính ở các môi nuôi cấy, nhưng sinh tổng hợp chất kháng sinh tốt nhất trên môi trường ISP-4 và A-9

pH thích hợp

Chủng xạ khuẩn L30 được nuôi trên môi trường ISP-4, pH được chỉnh ở 5, 6, 7, 8, 9 Sau 5 ngày nuôi cấy ở 300C cho kết quả ở hình 2

Hình 2 pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh

của chủng xạ khuẩn L30

Chủng xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong dải pH từ 5 đến 9 song khả năng tổng hợp chất kháng sinh nhiều nhất là trong khoảng pH7

Nhiệt độ thích hợp

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP-4 ở các nhiệt độ

25, 30, 35, 40, 450C trên máy lắc ổn nhiệt Hoạt tính kháng sinh được xác định ở hình 3

Hình 3 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng

sinh của xạ khuẩn L30

Kết quả cho thấy: Chủng xạ khuẩn sinh trưởng được trong khoảng 25-400C, hoạt tính kháng sinh và sinh khối cao nhất

ở 30-350C ở nhiệt độ nuôi cấy trên 400C thì sinh trưởng và tổng hợp chất kháng sinh giảm đáng kể

Thời gian nuôi cấy

Sự sinh trưởng và phát triển trong môi trường lên men

mang đặc tính của chủng và liên quan tới khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh

Chủng xạ khuẩn đựơc nuôi trong các điều kiện thích hợp,

cứ sau 24 giờ được lấy mẫu xác định hoạt tính kháng sinh

và sinh khối (hình 4)

Hình 4 Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng

sinh của xạ khuẩn L30

Kết quả cho thấy: Trong 3 ngày lên men đầu tiên sinh khối tăng dần đạt cực đại ở 96 giờ và giảm dần sau đó, còn quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh bắt đầu sau 2 ngày và mạnh nhất ở 120 giờ

Nguồn carbon thích hợp

Chủng xạ khuẩn đựơc nuôi trong các điều kiện thích hợp với các nguồn carbon khác nhau (hình 5)

Hình 5 Nguồn carbon thích hợp cho sinh tổng hợp chất

kháng sinh của xạ khuẩn L30

Kết quả trình bày ở hình 5 cho thấy sinh khối phát triển mạnh nhất trên nguồn glucoz, nhưng hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên nguồn tinh bột

Nguồn nitơ thích hợp

Chủng xạ khuẩn được nuôi trong các điều kiện thích hợp với các nguồn nitơ khác nhau (hình 6 ) Kết quả cho thấy sinh khối phát triển mạnh nhất trên nguồn cao men và

pepton, hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên nguồn amôn, cao men và pep ton

Hình 6 Nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng

sinh của xạ khuẩn L30

Ảnh hưởng của xạ khuẩn đến cây trồng

ảnh hưởng của dịch nuôi xạ khuẩn đến khả năng nảy mầm của hạt lạc [3]

Hạt lạc giống được ngâm trong dung dịch xạ khuẩn đã

được pha loãng, sau đó đặt vào các đĩa Petri đã lót sẵn giấy lọc ướt Sau 6 ngày kiểm tra tỷ lệ nảy mầm của hạt

Dịch nuôi được pha loãng 10 lần ức chế khả năng nảy

mầm, còn ở tỷ lệ pha loãng 100-10.000 lần thì lại kích thích nảy mầm

Bảng 4 ảnh hưởng của chất kháng sinh của chủng xạ

khuẩn đến khả năng nảy mầm của lạc

Điều này khẳng định rằng: chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn L30 tạo ra không ảnh hưởng xấu đến khả năng nảy mầm của hạt lạc mà còn có tác dụng kích thích nảy mầm

ảnh hưởng của chủng xạ khuẩn L30 đến khả năng sinh

trưởng của lạc [2]

Lạc được trồng trên các chậu đất được bố trí theo các phương án sau: có nhiễm xạ khuẩn L30, hoặc nhiễm xạ khuẩn L30 trộn với P solanacearum 222, hoặc không

nhiễm gì làm đối chứng Đo chiều cao cây lạc theo thời

gian

Bảng 5 ảnh hưởng của chủng xạ khuẩn đến khả năng sinh

trưởng của cây lạc

Kết quả cho thấy: khi nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào đất trồng lạc đã không ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lạc, ngay cả khi trong đất có chủng vi khuẩn gây bệnh

Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ

khuẩn L30 trên đất trồng lạc

Tiến hành nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào đất, cho chúng phát triển 2 tuần sau nhiễm tiếp chủng gây bệnh héo xanh Pseudomonas solanacearum 222 vào trước khi

trồng lạc Sau 1 tháng trồng lạc, tiến hành quan sát các chậu đất Khi lạc được 2-3 lá, tiến hành tiêm vi khuẩn gây bệnh héo xanh (ở nồng độ 10-5) vào các lách lá cây lạc Sau một tháng đọc kết qủa

Bảng 6 Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ

khuẩn L30 trên đất trồng lạc

Kết quả ghi ở bảng 6 cho thấy khi nhiễm P solanacearum vào đất trồng lạc, hay tiêm trực tiếp vào thân cây, trong

điều kiện trước đó đã nhiễm chủng xạ khuẩn thì không có cây nào bị nhiễm bệnh (tỷ lệ sống sót 100%), trong khi đó

ở đất không nhiễm xạ khuẩn thì có 80-100% cây bị bệnh

IV KẾT LUẬN

1 Chủng xạ khuẩn L30 có phổ kháng sinh rộng với các

nhiều loại vi sinh vật kiểm định đặc biệt là hoạt tính mạnh kháng Pseudomonas solanacearum

2 Dựa vào các đặc điểm nuôi cấy, hình thái và sinh lý sinh hoá, chủng L30 có đặc điểm khác với các loài đã mô tả

do đó gọi là Streptomyces sp

3 Điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30 trên môi trường ISP-4 với pH 7, nhiệt độ 28-350C, thời gian lên men là 120- 144 giờ, nguồn carbon trên tinh bột và nguồn nitơ là (NH4)2SO4

4 Chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn L30 sinh ra không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt lạc

5 Khi nhiễm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vào đất

không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lạc mà còn có tác dụng ức chế bệnh héo xanh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Vol 4,

1998

2 Naomichi Watanabe (1994), “Biological control effect

of Gliocladium spp against soil born plant pathogens”, Proceeding of the Kanto-Tosan plant protection Society,

99, pp 59-66

3 .Rasamee Dhitikiattipong, Chiradej Chamswarng and Twng Wah Mew (1999), “Antagonistic Bacteria against Rhizoctonia solani with Potential for Promoting Rice

growth”, International conference on Asian Network on Microbial Research, November 29- December1, Chiang Mai, Thailan , pp 140-141

4 Shirling, E B and D Gottlieb Methods for

characterization of Streptomyces species Intern J Syst Bact., 22,1966, p 313-340

SUMMARY

BIOLOGYCAL PROPERTIES AND ANTIBIOTIC ACTIVITY AGAINST PSEUDOMONAS

SOLANACEARUM OF THE STRAIN

STREPTOMYCES L30

Dao Thi Luong, Pham Van Ty, Nguyen Lan Dung,

Nguyen Thi Anh Dao

The strain L30 was isolated from soil sampl in Hatay

province and identified as belong to genus Streptomyces

This strain has antibiotic activity against a large range of pathogenic microorganisms causing diseases in human, animals and plants This strain was selected for

investigation of biologycal properties for the hightest

antibiotic activity in liquid culture Antibiotic produced by the strain L30 could stimulate the germination of groundnut seeds When the L30 was spayed to the soil, it could inhibit the bacterial wilt of groundnut (Pseudomonas

solanacearum), but did have negative effect on the growth

of the groundnut