Sàng lọc khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase ngoại bào của vi nấm ở vùng ven biển khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG DƢƠNG THỊ THU HUYỀN SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE NGOẠI BÀO CỦA VI NẤM Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Khánh Hoà – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG DƢƠNG THỊ THU HUYỀN SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE NGOẠI BÀO CỦA VI NẤM Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Mã học viên: 58CH261 Quyết định giao đề tài: 321/QĐ - ĐHNT ngày 27/3/2018 Quyết định thành lập HĐ: 1140/QĐ - ĐHNT ngày 10/9/2019 Ngày bảo vệ: 28/9/2019 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Phạm Thu Thủy TS Ngô Thị Hồi Dƣơng Chủ tịch hội đồng: TS Đặng Thúy Bình Phịng Đào tạo Sau Đại học: Khánh Hồ – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết đề tài “Sàng lọc khả sinh tổng hợp enzyme phytase ngoại bào vi nấm vùng ven biển Khánh Hịa” hồn tồn trung thực khách quan Kết phần đề tài “Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm phù du vùng ven biển Khánh Hòa dựa cách tiếp cận phụ thuộc độc lập nuôi cấy” (mã số 106-NN.02-2016.70) TS Phạm Thu Thủy chủ nhiệm đề tài Quỹ NAFOSTED tài trợ kinh phí Khánh Hòa, ngày 27 tháng năm 2019 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Thu Huyền iii LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Đặc biệt tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giáo viên hƣớng dẫn TS Phạm Thu Thủy, TS Ngơ Thị Hồi Dƣơng tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn truyền đạt cho kinh nghiệm quý báu suốt trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Thầy PGS.TS Nguyễn Văn Duy toàn Quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học & Môi trƣờng truyền đạt kiến thức cho tơi q trình học tập trƣờng Tôi xin cảm ơn Trung tâm Thí nghiệm Thực hành trƣờng Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi cho tơi để hồn thành luận văn tiến độ Ngồi tơi xin gửi lời cảm ơn đến em Trần Thị Châu Loan Nhóm nghiên cứu vi sinh phân tử đồng hành giúp đỡ tơi q trình làm luận văn Tơi ln biết ơn gia đình, bạn bè anh chị lớp cao học hỗ trợ, giúp đỡ động viên tơi suốt q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Khánh Hòa, ngày 27 tháng năm 2019 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Thu Huyền iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH .ix DANH MỤC BẢNG xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài .2 Nội dung nghiên cứu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi nấm biển 1.1.1 Định nghĩa phân loại nấm 1.1.2 Nấm men 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo 1.1.2.2 Sinh sản nấm men 1.1.3 Nấm mốc 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái cấu tạo nấm mốc 1.1.3.2 Sinh trƣởng dinh dƣỡng nấm mốc 1.1.3.3 Sinh sản nấm mốc 1.2 Giới thiệu axit phytic phytase 1.2.1 Axit phytic chất khác .8 1.2.2 Giới thiệu chung phytase 10 1.2.3 Phân loại phytase: 11 1.2.4 Vai trò phytase 12 v 1.2.5 Nguồn thu nhận enzyme phytase 12 1.2.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động enzyme phytase 13 1.2.7 Ứng dụng enzyme phytase 15 1.3 Khả sản xuất phytase vi sinh vật 16 1.4 Tình hình nghiên cứu enzyme phytase từ vi nấm biển giới Việt Nam .17 1.4.1.Trên giới 17 1.4.2 Ở Việt Nam 19 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng, thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu .21 2.2 Dụng cụ thiết bị chuyên dụng 21 2.3 Hóa chất 25 2.4 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 29 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh enzyme phytase chủng vi nấm 31 2.5.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ ni cấy .31 2.5.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy 32 2.5.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 32 2.5.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nguồn cacbon 33 2.5.5 Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng nguồn nitơ 34 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 36 2.6.1 Phƣơng pháp họat hóa chủng vi nấm 36 2.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy chủng vi nấm 36 2.6.3 Phƣơng pháp bảo quản chủng vi nấm 37 2.6.4 Xác định hoạt độ enzyme phytase .37 2.6.5 Tách chiết DNA tổng số 39 2.6.6 Khuếch đại đoạn gen ITS1 - 5,8S - ITS2 kỹ thuật PCR 40 2.6.7 Kỹ thuật điện di gel agarose 40 vi 2.6.8 Giải trình tự phân tích trình tự gen 41 2.6.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu 41 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Tuyển chọn chủng vi nấm biển có hoạt tính enzyme phytase ngoại bào .42 3.1.1 Sàng lọc sơ hoạt tính enzyme phytase chủng vi nấm phƣơng pháp đo vòng phân giải chất .42 3.1.2 Xác định hoạt độ enzyme phytase ngoại bào chủng vi nấm 42 3.2 Kết khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho q trình sinh tổng hợp enzyme phytase chủng nấm mốc DW7M 45 3.2.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme phytase chủng DW7M 45 3.2.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme phytase chủng DW7M 47 3.2.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme phytase chủng DW7M 48 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến trình sinh tổng hợp enzyme phytase chủng DW7M 49 3.2.5 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến trình sinh tổng hợp enzyme phytase chủng DW7M 51 3.2.5.1 Ảnh hƣởng nguồn nitơ vô .51 3.2.5.2 Ảnh hƣởng nguồn nitơ hữu 52 3.3 Định danh chủng nấm mốc DW7M 53 3.3.1 Kết quan sát hình thái khuẩn lạc tế bào 53 3.3.2 Giải trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 chủng DW7M 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .57 Kết luận 57 Kiến nghị .57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC I vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ Giải thích PDA Potato Dextrose Agar MT1 Môi trƣờng MT2 Môi trƣờng w/v Weight/volume Tỷ lệ khối lƣợng so với thể tích U/ml Unit/mililiter Đơn vị hoạt độ enzyme phytase g Gam TCA Trichloroacetic acid g/l Gam/lít TSCR 10 IUBMB Tausky-Shorr Color Reagent Solution The International Union of Biochemistry and Molecular Biology viii Dung dịch thuốc thử màu Tausky-Shorr Hiệp hội Hóa sinh Sinh học phân tử quốc tế DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo tế bào nấm mốc Hình 1.2 Cấu tạo axit phytic Hình 1.3 Phản ứng thủy phân phytate enzyme phytase 10 Hình 1.4 Phản ứng thủy phân 3-phytase 11 Hình 1.5 Phản ứng thủy phân 6-phytase 11 Hình 1.6 Thị phần thƣơng mại enzyme phytase 12 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 30 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh enzyme phytase 31 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng pH mơi trƣờng đến q trình sản sinh enzyme phytase .32 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh enzyme phytase 33 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh enzyme phytase 34 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng nguồn nitơ lên khả sinh enzyme phytase 35 Hình 3.1 Đƣờng kính vòng phân giải chất 10 chủng vi nấm mạnh 44 Hình 3.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh enzyme p376 0,38±0,05 0,297 0,321 0,322 0,319 0,321 0,024 0,654 0,436 0,321 0,34 0,345 0,348 0,344 0,023 0,649 0,433 0,342 0,361 0,364 0,368 0,364 0,022 0,633 0,422 0,46±0,05 0,287 0,315 0,319 0,32 0,318 0,031 0,771 0,514 0,255 0,304 0,302 0,294 0,300 0,045 0,994 0,662 0,279 0,316 0,323 0,329 0,323 0,044 0,972 0,648 0,63±0,05 0,288 0,323 0,323 0,328 0,325 0,037 0,861 0,574 0,282 0,34 0,339 0,336 0,338 0,056 1,174 0,783 0,275 0,32 0,324 0,327 0,324 0,049 1,052 0,701 0,74±0,04 0,241 0,288 0,297 0,297 0,294 0,053 1,121 0,747 0,32 0,314 0,034 0,819 0,546 0,281 0,309 0,311 0,312 0,311 0,030 0,750 0,500 0,54±0,03 0,247 0,285 0,286 0,276 0,282 0,035 0,840 0,560 0,28 0,302 phosphate Hoạt 0,32 IX Bảng Kết xử lý SPSS phân tích thống kê để tìm khác biệt có ý nghĩa thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme phytase chủng nấm mốc Fusicolla DW7M Tukey HSDa,b Thời Số lần gian lặp lại a ngày 30100 ngày 38200 ngày ngày Sig Phân nhóm b c d e 38200 45633 45633 53533 53533 62800 62800 74367 273 351 Sai số toàn phƣơng trung bình (Mean Square Error) = 002 a Kích thƣớc mẫu trung bình = 3.000 b Alpha = 05 X 295 168 059 ... DƢƠNG THỊ THU HUYỀN SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE NGOẠI BÀO CỦA VI NẤM Ở VÙNG VEN BIỂN KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201 Mã học vi? ?n: 58CH261 Quyết... Phịng Đào tạo Sau Đại học: Khánh Hoà – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết đề tài ? ?Sàng lọc khả sinh tổng hợp enzyme phytase ngoại bào vi nấm vùng ven biển Khánh Hịa” hồn tồn trung thực... enzyme phytase ngoại bào .42 3.1.1 Sàng lọc sơ hoạt tính enzyme phytase chủng vi nấm phƣơng pháp đo vòng phân giải chất .42 3.1.2 Xác định hoạt độ enzyme phytase ngoại bào chủng vi nấm