Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phosphate khó tan trên đất bazan nâu đỏ ở Đak Lak

Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định sự biến đổi vật chất và năng lượng. Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosin triphosphate (ATP) là những chất cần thiết cho sự sống

PHẦN I: MỞ ĐẦU1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định sự biến đổi vật chất và nănglượng Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosin triphosphate (ATP)… là những chất cần thiết cho sự sống [2] Ngoài ra lân còn đóng những vai trò khác nhưtạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến quá trình hút các chất khoáng khác của cây Đất chứakhối lượng lớn chất chứa lân Tuy nhiên không phải hợp chất chứa lân nào trong đất cũngđược cây sử dụng dễ dàng Đặc biệt là đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên vốn rất giàu lântổng số nhưng lân dễ tan lại rất thấp.

Sự chuyển hóa lân xảy ra chủ yếu dưới tác dụng của quá trình hóa học và sinh học[1] Quá trình chuyển hóa hợp chất phophat khó tan trong đất có phần đóng góp quantrọng của các loại vi sinh vật Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa quặng phosphate khótan thành dễ tan để cây trồng hấp thụ được Do vậy bón vi sinh vật phân giải phosphatekhó tan sẽ cung cấp một lượng lân dễ tan cho cây trồng và giúp cây hấp thụ các chất dinhdưỡng trong đất tốt hơn [3].

Ngoài ra những vi sinh vật chuyển hóa hợp chất lân vừa có khả năng tạo các chấtdinh dưỡng cho cây, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật đồng thời cũng cókhả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng [7].

Theo Fridland (1973) đất bazan nâu đỏ là loại đất hình thành trên đất bazan, trongđiều kiện nhiệt đới ẩm, các bazơ bị rửa trôi mạnh, đất có phản ứng chua, sắt nhôm tích lũynhiều, đây là nguyên nhân chủ yếu của quá trình giữ chặt lân trên đất bazan [13].

Theo Đoàn Triệu Nhạn (1999): Đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên có hàm lượng lântổng số đạt 0,02% P2O5 và lượng lân dễ tiêu là 4,12mg P2O5/ 100g đất [13].

Đak Lak với hơn 360.000 ha đất bazan nâu đỏ là một loại đất giàu lân tổng số rấtthích hợp cho việc phát triển các cây công nghiệp dài ngày [21] Tuy nhiên các quá trìnhcố định lân từ dễ tiêu thành dạng khó tiêu thường xuyên xảy ra nên lượng lân dễ tiêu luônở mức nghèo Đồng thời, nông dân trong thời gian qua thường chỉ dùng phân hóa học để

bón cho cây trồng thiếu bón phân hữu cơ cũng như phân vi sinh vật làm cho đất trồng bịthoái hóa, chai cứng, vi sinh vật đất bị suy thoái, gây ô nhiễm môi trường.

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu

phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải phosphate khó tan trên đất bazan nâuđỏ ở Đak Lak

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinhvật phân giải lân khó tan trong sản xuất nông, lâm nghiệp nhằm cung cấp lân dễ tan chocây trồng, giảm chi phí đầu tư, giảm sự thoái hóa đất, góp phần cải thiện đời sống củanông dân và bảo vệ môi trường nông thôn ở Đak Lak.

1.4 Giới hạn của đề tài

Trong quá trình thực hiện do thời gian, trang thiết bị, hóa chất có hạn nên chúng tôichỉ tiến hành phân lập trên một số mẫu đất của tỉnh Đak Lak và chỉ theo dỏi một số chỉtiêu cơ bản Mặc khác, là sinh viên lần đầu tham gia nghiên cứu nên không thể tránh khỏithiếu sót Kính mong quý thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến.

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Các dạng lân trong đất

Lân rất quan trọng đối với cây trồng Tuy nhiên hiệu suất sử dụng lân bởi cây trồngkhông quá 25%, trong khi đó một lượng lớn bị cố định trong đất và chuyển thành dạngkhó hấp thụ Lượng dự trữ lân trong đất xấp xỉ 0,025 – 0,3% P2O5 nhưng chúng tồn tạitrong đất ở dạng không tan trong nước cây khó hấp thụ Thành phần lân dễ tan và khó tantrong đất được quyết định bởi tính chất đá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữucơ quyết định [5].

Theo Sepfe-Satsaben (1960) thì hàm lượng phosphate trung bình ở nhiều loại đấtthường từ 0.02 – 0.08% Do quá trình tích lũy sinh học, hàm lượng phosphate trong lớpđất mặt cao hơn ở lớp dưới [13].

Trong các loại đất khoáng , tỉ lệ lân hữu cơ thường từ 25 – 65% Các cỡ hạt thuộcthành phần sét thường chứa nhiều lân hơn các cỡ thuộc thành phần cát Do đó: Ở các chânđất nhẹ, đất bạc màu… có ít keo sét, thì tỉ lệ phosphate thường thấp hơn các loại đất khác[13].

Tỉ lệ lân trong đất khác nhau thùy theo tính chất của đá mẹ và những tầng phát sinhtừ đá mẹ như: Nai, mica, quartzit… thường tỉ lệ lân thấp hơn là đất phát sinh từ mẫu thạchkhông chua như: Bazan, đá vôi,…[13]

Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất một nguồn phosphatequan trọng Như vậy việc bổ sung chất hữu cơ vào đất giúp làm tăng cường hàm lượnglân cho đất Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng , phosphate tồn tại ở hai dạngchủ yếu sau:

2.1.1 Lân hữu cơ

Tùy loại đất, tỷ lệ phosphate hữu cơ thường chiếm từ 20 – 80% phosphate tổng sốtrong đất Ở lớp đất mặt, phosphate chiếm khoảng 50% [5] Phosphate hữu cơ trong đấtchủ yếu ở trong thành phần mùn Đất càng giàu mùn thì càng giàu phosphate hữu cơ.Theo Kletcôpki và Petecbuaxki (1964) thì: Trong phosphate hữu cơ của đất, dạng phổ

biến nhất là dạng fytat, có thể chiếm đến 50% tổng số phosphate hữu cơ Tùy theo môitrường acid hay kiềm mà tồn tại các dạng fytat khác nhau Ở đất chua, phosphate hữu cơchủ yếu là fytat Fe, Al; ở đất trung tính, kiềm tồn tại dạng fytat Ca, Mg [13].

Phosphate hữu cơ trong cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật thường gặp các hợpchất chủ yếu như fitin, phospholipide, acid nucleic Điều đáng chú ý là phosphate ở visinh vật không tham gia trực tiếp vào dinh dưỡng cây trồng mà phải đợi vi sinh vật chếtđi, tế bào bị khoáng hóa thì cây trồng mới hấp thu được [5].

Khi thực hiện khoáng hóa có sự tham gia của vi sinh vật phân giải phosphate,những hợp chất hữu cơ (trong đó có lân hữu cơ) sẽ được khoáng hóa để giải phóng ra lânvô cơ hay hữu cơ, là nguồn dinh dưỡng cung cấp thức ăn cho cây trồng Có 70 – 80 tậpđoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình phân giải phosphate [13] Trong quá trình khoánghóa chất hữu cơ của đất, phosphate hữu cơ được giải phóng ra dưới dạng acid phosphoricvà muối dễ tan của nó Nhưng các dạng lân này lại bị đất hấp phụ và vi sinh vật hút lại,nên trong đất rẩ ít phosphate ở dạng hòa tan Nhiều tác giả nghiên cứu cho rằng: Nếu chấthữu cơ vùi trong đất là chất hữu cơ nghèo phosphate thì qua quá trình phân giải khôngnhững hàm lượng phosphate hữu cơ trong đất không tăng mà còn giảm xuống (Ivanop1955) [3].

Theo những công trình nghiên cứu của Kaila (1954): Nếu chất hữu cơ vùi xuốngđất chứa ít hơn 0.2 – 0.3% P2O5 thì quá trình phân giải không tăng thêm về phosphate dễtancho cây vì vi sinh vật sẽ hút hết Cường độ hút phosphate hữu cơ của đất thông qua sựphân giải của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ Theo Sepfe-Satsaben (1960)trong điều kiện nhiệt độ bình thường, ở các nước ôn đới , sự khoáng hóa phosphate hữucơ tiến hành rất chậm và lượng phosphate cung cấp cho cây từ những hợp chất hữu cơkhông đáng kể Trái lại, ở nhiệt độ từ 35 – 50oC thì quá trình khoáng hóa tăng lên rấtmạnh và cung cấp cho cây được nhiều phosphate từ những hợp chất hữu cơ Vì thế, ởnước ta bón phân chuồng cũng là giải pháp cung cấp phosphate cho cây trồng [13].

2.1.2 Lân vô cơ

Phosphate vô cơ tồn tại ở dạng muối của những nguyên tố Ca, Fe, Al Ở đất trungtính và đất kiềm thì phosphate Ca là chủ yếu, còn ở đất chua thì phosphate Fe, Al là chủyếu Phosphate Ca dễ được huy động để làm thức ăn cho cây hơn là phosphate Fe, Al Sựtồn tại của ion phosphate trong môi trường đất bị chi phối bởi ion phosphate bị chuyển đổihóa trị [13].

Môi trường chua: H2PO4- HPO42- PO4

3-Trong thực tế, H2PO4- là dạng cấy trồng dễ hấp thu nhất Các dạng phosphate cònlại thường là những loại khó hòa tan mà cây trồng không thể đồng hóa được, muốn câytrồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan [13] Cũng như các yếutố khác, phosphate trong tự nhiên luôn luôn tuần hoàn chuyển hóa Nhờ vi sinh vật, lânhữu cơ được vô cơ hóa biến thành dạng muối của acid phosphoric Các dạng lân này mộtphần được cây trồng sử dụng biến thành dạng lân hữu cơ, một phần bị cố định dưới dạngkhó tan như Ca3PO4, AlPO4, FePO4 Những dạng khó tan này trong các môi trường có pHthích hợp sẽ chuyển thành dạng dễ tan Trong quá trình này, vi sinh vật giữ vai trò quantrọng.

2.1.3 Vòng tuần hoàn của lân trong tự nhiên

Vòng tuần hoàn của lân không giống như vòng tuần hoàn của nitơ Trong khi nitơluôn khan hiếm trong đất thì lân tồn tại nhiều trong đất ở dạng khó phân giải [15, 18].Nitơ được đưa vào đất nhờ vi sinh vật cố định đạm từ không khí, còn đối với lân, chúngđược các vi sinh vật phân giải từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ khác nhau Vòng tuầnhoàn của lân được biểu diễn trong sơ đồ sau:

2.2 Sự chuyển hóa lân trong đất2.2.1 Đối với lân hữu cơ

Trong đất có nhiều loại vi sinh vật khoáng hóa được lân hữu cơ Các vi sinh vậtnày tiết ra các enzyme khử phosphoryl đồng thời giải phóng ion phosphate Phản ứngenzyme nhanh khi hợp chất lân hữu cơ vừa mới bón vào đất và sau đó xảy ra chậm khi lânđã bị cải biến Lân sẽ tạo các phức liên kết với Fe, Al, các chất hữu cơ phân tử lượng caovà bị giữ chặt trên các phần tử sét.

Tốc độ giải phóng lân phụ thuộc vào các yếu tố sau:

- Bản chất các hợp chất hữu cơ có lân: Acid nucleic dễ khoáng hóa hơn phytin.Nguyên nhân dohầu hết các vi sinh vật khoáng hóa lân hữu cơ đều tiết ra các enzymetương ứng để phân giải acid nucleic [3].

- Nếu lượng C/P cao hơn 300 thì lân sẽ bị các vi sinh vật trong đất cố định Còn ởmức C/P nhỏ hơn 200, lân sẽ thừa nên được khoáng hóa [3].

PO43- trong dung dịch đấtPO43- bị hấp thụ

Hòa tanLân vô cơCố định tạm thời

Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vậtChất hữu cơ mùn hóa

- pH tối thích là 6 – 7 Ở môi trường kiềm lân vô cơ được phóng thích nhanh hơnlân hữa cơ.

- Nhiệt độ cao cũng thuận lợi cho việc khoáng hóa lân hữu cơ Tối thích là 40 –50oC Do đó, trong mùa hè tốc độ khoáng hóa lân mạnh hơn các mùa khác.

2.2.2 Đối với lân vô cơ

Sự tồn tại các loại ion phosphate trong đất phụ thuộc vào pH đất Do vậy, thực tếtrong đất, lân tồn tại chủ yếu ở hai dạng: H2PO4- và HPO42-.

H2PO4- HPO42- PO4

3-Ở pH = 7 tỷ lệ 2 loại ion này gần bằng nhau H2PO4- dễ đồng hóa hơn HPO42-, nênvề mặt lý thuyết ở pH = 5 – 6 dinh dưỡng lân của cây thuận lợi nhất Song trong đất do cómặt của nhiều ion khác mà vấn đề trở nên phức tạp hơn.

2.2.2.1 Sự chuyển hóa lân ở đất chua

Trong đất chua nghèo chất hữu cơ: Fe, Al và Mn thường nằm dưới dạng hòa tanphản ứng với H2PO4- tạo thành hợp chất không tan cây không đồng hóa được [13].

Al3+ + H2PO4- + 2H2O 2H+ + Al(OH)3.H2PO4

Ở các loại đất rất chua, Al3+ và Fe3+vượt các ion H2PO4- nhiều làm cho phản ứngtrên càng nghiêng theo chiều thuận, tạo thành lân không tan khiên cho chỉ còn một lượngrất nhỏ H2PO4- trong đất.

Ở đất chua, ion H2PO4- không những phản ứng với Fe3+, Al3+ hòa tan mà còn phảnứng với các oxit ngậm nước của các nguyên tố đó như gibbsit (Al2O3.3H2O) và goethit(Fe2O3.3H2O) Ở đất chua số lượng lân bị các oxit sắt, oxit nhôm ngậm nươc cố định cònvượt quá cả số lượng lân bị kết tủa với Fe, Al và Mn hòa tan.

Al(OH)3 + H2PO4- Al(OH)2.HPO4- + H2ODung dịch acid

Dung dịch kiềm

Không tan

Điều đáng lưu ý là hầu hết các loại đất đều chứa oxit sắt, nhôm ngậm nước nên đâycũng là kiểu cố định khá nhiều lân và diễn ra trên phạm vi rộng.

Trong môi trường chua còn có hai quá trình cố định lân liên quan tới sét Đó là dosự tồn tại các ion OH- lộ trên bề mặt khoáng sét Sự cố định này đi kèm với việc giảiphóng kiềm theo phản ứng sau:

Còn về vôi, người ta thấy khi để cho sét hấp thụ Ca2+, tỉ lệ anion phosphate đượchấp thu tăng lên, bất chấp ngưỡng kết tủa canxi phosphate Điều đó chứng tỏ rằng : Đây làquá tình cố định ion chứ không phải bằng con đường hóa học Tính ổn định của quá trìnhgiữ chặt này phụ thuộc vào điều kiện môi trường và việc giải phóng anion có thể xảy rakhi điều kiện môi trường thay đổi và đặc biệt là nếu sét bị giải keo.

Ở đất chua, các hydroxit sắt, nhôm lương tính có thể mất 1 nhóm OH- trở thànhkeo dương tính tham gia hấp phụ trao đổi anion:

Al(OH)3 + H+ = Al(OH)2+ + H2O

2.2.2.2 Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm

Trong môi trường kiềm giàu Ca, ion H2PO4- phản ứng mạnh với Ca tạo thành cáchợp chất ít tan hơn theo các phản ứng lần lượt như sau [13]:

Ca(H2PO4)2 + CaCO3 + H2O → 2CaHPO4.2H2O + CO2

6CaHPO4.2H2O + 2CaCO3 + H2O → Ca8H2(PO4)6.5H2O + 2CO2

Ca8H2(PO4)6.5H2O + CaCO3 → Ca3(PO4)2 + CO2 + 6H2O

Lân trở nên kém hòa tan hơn khi gặp điều kiện thuận lợi và đủ thời gian Ca3(PO4)2

có thể chuyển thành các hợp chất không tan hơn nữa như hydroxy, carbon và ngay cảfluoro apatit.

2.3 Tổng quan về vi sinh vật phân giải lân

Vi sinh vật (microorganisms) là tên chung dùng để chỉ tất cả các loại sinh vật nhỏbé mà muốn thấy chúng, người ta phải sử dụng tới kính hiển vi Theo Hoàng Lương Việt(1978) trung bình một gam đất khô có đến gần 200 triệu tế bào vi sinh vật Vi sinh vật cócác nhóm chính sau: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi tảo, virus [6] Các nhómcó khả năng phân giải phosphate là vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc [5] Nghiêncứu của Puneet và cộng sự cho thấy: Việc nhiểm một số chủng nấm sợi có khả năng hòa

tan phosphate như Aspergillus flavusvà Asp niger với vi khuẩn cố định nitơ

Azotobacter sp đã tăng năng suất hạt 17.7%, trong khi chỉ nhiễm Azotobacter sp chỉ làm

tăng 9% [18] Kopoor và cộng sự cũng đạt kết quả tương tự khi nghiên cứu sự phối hợp

giữa chủng Azotobacter sp với các vi khuẩn phân giải phosphate thuộc các chi

Asgrobacterium sp, Bacillus sp và Pseudomonas sp…[20]

Vi sinh vật phân giải lân được chia thành hai nhóm: Vi sinh vật phân giải lân hữucơ và vi sinh vật phân giải lân vô cơ.

2.3.1 Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ

Sự chuyển hóa các hợp chất lân hữu cơ thành muối của H3PO4(Stoklaza – 1991,Menkina – 1952) theo sơ đồ sau [1, 5]:

1 Nucleoprotein Nuclein acid nucleic Nucleotic H3PO4

2 Lơxitin Glixerphosphate H3PO4

Sơ đồ của quá trình phân giải nucleoprotein cụ thể như sau:

Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus và Pseudomonas.Ngoài ra còn có một số xạ khuẩn và nấm khác Đáng chú ý là B megaterium var

phosphatsum có khả năng phân giải lân hữu cơ cao [13] Đồng thời B megaterium còn có

khả năng hình thành bào tử nên sức sống rất mạnh [4].

2.3.2 Vi sinh vật phân giải lân vô cơ

Nhiều vi khuẩn như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus butyricus,

Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn hệ rễ, xạ khuẩn có khả

năng phân giải Ca3(PO4)2 và bột apatit Khả năng phân giải lân vô cơ liên quan mật thiếttới sự sản sinh acid của vi sinh vật Quá trình lên men tạo ra acid carbonic, là acid chủ yếuthúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ [3].

Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O → Ca(PO4)2H2O + Ca(HCO3)2

Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụngquan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2 Vì trong quá trình sống, các vi khuẩn này tíchlũy trong đất HNO3 và H2SO4 Quá trình hòa tan có thể biểu thị theo phương trình sau:

NH3

Ca3(PO4)2 + 4 HNO3 = Ca(H2PO4)2 + 2 Ca(NO3)2

Ca3(PO4)2 + 2 H2SO4 = Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4

Đối với nấm thì Aspergillus niger cho khả năng phân giải lân mạnh nhất Ngoài racòn có một số chủng khác như Penicillin, Rhizopus…

2.3.3 Các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của vi sinh vật

- Độ pH: nhìn chung pH ít ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân Tuy nhiên pHtrong khoảng 7.8 – 8.0 ảnh hưởng tốt tới sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân [5].

- Nhiệt độ: các chủng vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cho quá trình phân giải lânlà khác nhau Nhìn chung khoảng nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 20 – 40oC [9].

- Hợp chất hữu cơ: chất hữu cơ làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Dođó khả năng phân giải lân của chúng sẽ tăng lên.

- Độ ẩm: ở những nơi có độ ẩm cao, do hoạt động của vi sinh vật mạnh nên tạo ranhiều acid hữu cơ làm tăng phân giải lân.

- Hệ rễ: hệ rễ cây trồng khích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật Do đó phân giảilân cũng được tăng cường Tuy nhiên một số loài cây có thể tiết ra các chất độc ngăn cảngsự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật.

- Tỷ lệ N và C trong môi trường: N, C là những thành phần cần thiết cho sự sinhtrưởng và phát triển của vi sinh vật Tỉ lệ N, C trong môi trường cao sẽ thúc đẩy khả năngphân giải lân

2.4 Tổng quan về đất bazan nâu đỏ ở Đak Lak

Theo hệ thống phân loại đất của FAO – UNESCO (1995), Đak Lak có 11 nhóm và84 đơn vị đất đai Trong đó, nhóm đất xám chiếm diện tích lớn nhất 44% Nhưng nhómđất sám thường phân bố ở những vùng đất dốc, về bản chất có độ phì thấp, chua, hàmlượng lân tổng số và lân dễ tiêu thấp Như vậy, nhóm đất xám không thuận lợi cho việctrồng các loại cây trồng Nhóm đất chiếm diện tích nhiều thứ 2 ở Đak Lak là đất bazan đỏ

(Ferrasols) Diện tích đất bazan đỏ khoảng 311.340ha, chiếm 23.7% diện tích đất tựnhiên Phân bố tập trung tại các khối bazan Buôn Ma Thuột Nhóm đất này có các đơn vịphân loại: Nâu đỏ trên Bazan (Fk), nâu vàng trên bazan (Fu), là nhóm đất có tầng B tíchtụ nhôm rõ nhất Đất được phân bố tập trung ở khối bazan Buôn Ma Thuột chảy từ bắcxuống Nam, từ Đông sang Tây Phía Bắc cao nguyên (Ea H'Leo) có độ cao 800m, phíaNam độ cao 400 m, phía Tây cao 300m (khu vực huyện Cư M'gar) Bề mặt cao nguyênrất bằng phẳng [21]

Đất bazan nâu đỏ hình thành và phát triển trên các cao nguyên Ba zan phần lớn cóđộ dốc thấp, tầng đất mịn dày, có thành phần cơ giới nặng (tỷ lệ sét >40%), tơi xốp khiẩm, độ xốp trung bình 62-65%, khả năng giữ nước và hấp thu nước tốt Rất thích hợpvới các loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị hàng hoá cao: cà phê, cao su, tiêu vànhững cây ăn quả khác [21] Tuy nhiên, điểm hạn chế của nhóm đất này là hàm lượnglân dễ tiêu thấp, lượng P2O5 dễ tan nhỏ hơn 1,0 mg/100 g đất Trong khi đó, lân tổng sốcủa nhóm đất này lại cao, P2O5 tổng số trên 0.2% [21].

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hàm lượng lân trong các loại đất thường rất thấp vì vậy người ta tìm cách để tănglượng lân dễ tan trong đất bằng cách bón phân Nhưng 2/3 lượng lân bón vào đất bịchuyển hóa trở thành lân khó tiêu khiến cây trồng không hấp thụ được hoặc bị rữa trôi đi.Do đó hiệu quả của việc bón phân lân bị giảm đi nhiều Các vi sinh vật phân giải lân khótan đã giải quyết được vấn đề này Chúng vừa giảm được lượng phân lân bón cho cây,đồng thời huy động được cả lượng lân khó tiêu trong đất Với những lợi ích như vậy, cácvi sinh vật phân giải lân được nhiều nước trên thế giới quan tâm Nhiều công trình nghiêncứu ở châu Âu, Mỹ và Ấn Độ đã cho thấy hiệu quả to lớn của các vi sinh vật phân giảilân.

Các nghiên cứu của Sen và Paul, 1957 , Katznelson và Bose,1967; Ostwal và

Bhide, 1999 cho thấy: các chủng vi khuẩn đặc biệt thuộc loài Pseudomonas và Bacillus,các chủng nấm thuộc loài Penicillium, Aspergillus có khả năng chuyển hóa photphat

không tan thành dạng dễ hòa tan ở trong đất nhờ tiết ra các acid hữu cơ như formic,

acetic, lactic, propionic, fumaric, glucolic và acid succinic Những acid này làm giảm pHvà hòa tan các dạng photphate khó tan [20].

Ở Liên xô (cũ) sản phẩm phân bón vi sinh vật thương mại “phosphobacterin” với

sự có mặt của B megateirum var phosphaticum đã được sử dụng rộng rãi ở Liên xô và

các nước Đông Âu , làm tăng năng suất cây trồng 5 – 10% so với đối chứng.Viện nghiêncứu nông nghiệp Ấn Độ đã sử dụng phosphobacterium trên lúa mì, lúa và ngô cũng đãcho kết quả tăng đáng kể so với đối chứng Người ta tính nếu sử dụng vi sinh vật phângiải lân có tác dụng tương đương với việc bón 50kg P2O5/ha [3].

Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada cho thấy bón vi sinh vật phân giải lân cóthể thay thế 50 – 75% lượng lân cần bón bằng quặng nghèo P2O5 mà năng suất, chấtlượng không hề thay đổi (Gaur, 1992) Sử dụng chủng Pseudomonas striata khi bón quặngphosphate và superphosphate cũng làm tăng đáng kể năng suất khoai tây (Gaur và Negi,1980) [16].

Perez (2007) đã nghiên cứu phân lập được 130 chủng vi khuẩn có khả năng phângiải phosphat khó tan ở Venezuela Tuy nhiên, không có chủng nào có hoạt tính phân giảiphosphate Fe và Al Tác giả cũng chọn được 10 chủng có tiềm năng để nghiên cứu tiếpthuộc các chi Raltonia, Pantoea, Serratia [15].

Alvaro (2009) đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn từ rễ cỏ ở Tây Ban Nha có hoạttính phân giải phosphate và kích thích sinh trưởng đối với cây trồng thuôc chi mới là

Acenitobacter [17].

Hiện nay, hai nước Trung Quốc và Ấn Độ đang đẩy mạnh nghiên cứu và ứng dụngcông nghệ sinh học trong sản xuất phân lân vi sinh với quy mô công nghiệp, ứng dụngtrên hàng chục triệu ha [3].

2.6 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững Việt Nam đã có khánhiều nghiên cứu về vi sinh vật phân giải lân Thập kỉ 90 thế kỷ XX các vi sinh vật phângiải lân sau khi được nhân sinh khối được tẩm nhiễm vào chất mang tạo thành chế phẩmvi sinh vật phân giải lân hoặc phối trộn với chất hữu cơ để tạo thành phân lân hữu cơ visinh vật.

Kết quả nghiên cứu ở nhiều nơi cho thấy phân vi sinh vật phân giải photphate khótan có thể nâng cao hiệu quả sử dụng phân lân khoáng lên 20 – 30% so với đối chứngđồng thời có tác dụng nâng cao năng suất cây trồng 5 – 10% tùy loại đất trồng và câytrồng Việc sử dụng vi sinh vật phân giải lân có thể thay thế 30 – 50% lượng lân cần bónbằng quặng phosphorit với hàm lượng lân tổng số tương đương mà năng suất cây trồngkhông bị giảm sút Ngoài tác dụng phân giải lân ,vi sinh vật phân giải lân còn có khả năngsản sinh ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật hoặc các chất kháng sinh giúp câytrồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài [7].Nguyễn Thị Phương Chi, Phạm Thanh Hà, Nguyễn thị Quỳnh Mai đã nghiên cứu khảnăng tiết enzyme photphataza của 10 chủng vi sinh vật hòa tan lân và nhận thấy rằngngoài khả năng hòa tan lân khó tan các chủng vi sinh vật này có khả năng sản sinhenzyme photphatase (chủ yếu là nấm sợi và vi khuẩn) enzyme này đóng vai trò xúc táckhông thể thiếu cho quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa lân Vũ ThúyNga ,Nguyễn Ngọc Quyên, Trần Thủy Tú, Phạm văn Toản (2003) nghiên cứu khả năng

sinh tổng hợp IAA và phân giải phosphate vô cơ khó tan của vi khuẩn Bradyrhizobium.

Kết quả cho thấy chúng có khả năng tổng hợp 20 – 100 microgam/ml môi trường nuôicấy Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các

nguồn nitơ lên khả năng phân giải photphat khó tan của hai chủng nấm sợi Aspergillus

awamori MN1 và Penicillum cyaneofulvum ĐT1.Tác giả nghiên cứu 7 nguồn cung cấp

nitơ khác nhau lên khả năng phân giải photphat của Aspergillus awamori MN1 và

Penicillum cyaneofulvum ĐT1 Kết quả cho thấy KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 là nhữngnguồn nitơ tốt nhất cho môi trường nuôi chủng MN1 tạo khả năng phân giải photphat cao.Còn đối với chủng ĐT1 là NH4Cl [10].

Nghiên cứu gần đây nhất đối với vi sinh vật phân giải lân trên đất bazan nâu đỏ làsử dụng chế phẩm vi sinh phân giải lân (50g) cho 1 ha cà phê có tác dụng tương đươngvới 34.3kg P2O5/ha [13] Nghiên cứu cũng cho thấy, việc bón thêm vi sinh vật phân giảilân làm tăng số lượng vi sinh vật phân giải lân trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giảilân khó tan trong đất 23 – 35%.

PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật phân giải photphat khó tan trên đấtbazan nâu đỏ ở Đak Lak.

- Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan mạnh.- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính phân giảiphosphate khó tan trong điều kiện phòng thí nghiệm.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc) đếnkhả năng phân giải phosphate khó tan trong điều kiện phòng thí nghiệm.

- Nghiên cứu khảo sát hoạt tính phân giải phosphate nhôm khó tan của các chủngvi sinh vật được tuyển chọn.

3.2 Phương pháp nghiên cứu3.2.1 Phương pháp thu mẫu

Địa điểm thu mẫu: Rẫy cà phê của các địa bàn sau: thôn 4 - xã Eahu - huyện CưKuin, thôn 3 – xã Cư Suê – huyện Cư Mgar, Thôn Xuân Hoà – Xã Phú Xuân – HuyệnKrông Năng.

Thời gian thu mẫu: từ ngày 29/01/2010 đến ngày 31/01/2010.

Đất được lấy ở tầng mặt, độ sâu từ 0 đến 30cm Lượng đất lấy mỗi lần từ 40 – 50g.Mẫu đất được đựng trong túi nilon polypropylen đã được khử trùng Các mẫu sau khi lấyđược ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu Mẫu đất sau khi thu được đem ngaytới phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập [15].

3.2.2 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan

Môi trường phân lập nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa phosphate khó tan được sửdụng là NBRIP [15] NBRIP là môi trường chỉ chứa dạng phosphate khó tan nên các vi

sinh vật muốn sinh trưởng và phát triển được phải có khả năng sử dụng phosphate khótan Hay nói cách khác, các vi sinh vật đó phải có khả năng phân giải phosphate khó tan.Thành phần cơ bản của môi trường NBRIP gồm:

- 5 g Ca3(PO4)2 - 0.25g MgSO4.- 0.2g KCl.- 0.1g (NH4)2SO4

- 5 gMgCl2.6 H2O - 10g glucose- Nước 1lít.

-Phân lập các vi khuẩn trên môi trường đặc ở đĩa petri [8]:

+ Đất được nghiền nhỏ và phơi khô.

+ Cân 1g đất pha trong 99ml nước muối sinh lý 0.9% vô trùng Lắc 10 phút.+ Pha loãng dung dịch đất 10-2 – 10-5 lần.

+Dùng micropipette có đầu côn vô trùng hút 0.1ml dịch đất ở các độ phaloãng cấy trải trên các đĩa petri chứa sẵn môi trường NBRIP.

- Tuyển chọn các vi khuẩn phân giải phosphate khó tan: sau 5 – 7 ngày, quan sátkhuẩn lạc, những khuẩn lạc nào có vòng phân giải được lựa chọn.

- Đếm số lượng tế bào (CFU/ml) theo Trần Linh Thước (2007) Đếm tất cả cáckhuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạcđể tính kết quả Mật độ vi sinh vật phân giải phosphate tổng số được tính theo công thứcsau [12]:

A (CFU/ml) =

Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu.N: tổng số khuẩn lạc đếm trên cá đĩa đã chọn.

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng i.

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.fi: độ pha loãng tương ứng.

- Làm thuần: cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứa môi trườngNBRIP khác để thu khuẩn lạc đơn Quá trình làm thuần được tiến hành 2 – 3 lần Chọnkhuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy truyền vào ống thạch nghiên để giữ giống.

3.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính phân giải photphat khó tan của các chủng visinh vật

Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật dựa trên nồng độPO4 có trong dịch nuôi cấy Nồng độ PO4 càng cao chứng tỏ lượng phosphate khó tan bịphân giải càng nhiều.

Nồng độ PO4 được xác định bằng phương pháp xanh molipdate [9] Nguyên tắccủa phương pháp là ion PO4 sẽ phản ứng với (NH4)2SO4 tạo ra phức chất(NH4)2PO4.12MoO3 màu vàng Trong điều kiện acid và có ion Sn2+ phức màu vàng sẽchuyển thành phức màu xanh (NH4)3(4MoO2.2MoO3):

PO43- + 12(NH4)2SO4 + 24H+ = (NH4)2PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12H2O(NH4)2PO4.12MoO3 + Sn2+ + 16H+ = (NH4)3(4MoO2.2MoO3) + Sn4+ + 8H2O

Phức màu xanh có bước sóng hấp thụ cực đại ở 690nm Sử dụng máy UV Vis đo ởbước sóng 690nm để xác định độ hấp thụ màu của phức chất Độ hấp thụ màu càng lớnchứng tỏ nồng độ ion PO4 càng cao.

n1Vf1 + … + niVfi

Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ PO4 cần thiết lậpphương trình tương quan giữa hai chỉ số đó bằng KH2PO4 Sử dụng dung dịch KH2PO4

5mg/l để pha dãy nồng độ theo bảng 3.1.

Chuẩn bị bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường NBRIP đã đượckhử trùng Cấy các chủng vi sinh vật đã phân lập được vào và ủ 5 ngày Sau đó, lấy 1.5mldịch môi trường nuôi cấy đem ly tâm ở 10000rpm trong 10 phút Hút cẩn thận 1ml dichphía trên để làm phản ứng xanh molipdate rồi đo OD xác định nồng độ PO4.

Chọn ra 6 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải phosphate khó tan mạnh nhất đểtiếp tục thí nghiệm.

3.2.4 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào

- Tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch: sử dụng kỹ thuật ria chữ T ( T streak) [12] Sau

đó ủ ở 30oC trong 72h.

- Khuẩn lạc sẽ được xác định hình thái theo Nguyễn Lân Dũng (1979) Mô tả cácđặc điểm sau: hình dạng, kích thước, bề mặt, đặc tính quang học, màu sắc, mặt cắt ngang,cấu trúc [6].

- Làm tiêu bản tế bào bằng thuốc nhuộm methyl blue và quan sát bằng kính hiển viquang học ở độ phóng đại 40x10.

3.2.5 Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giảiphosphate khó tan của các chủng vi sinh vật

Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường NBRIP với nguồn phosphate khó tan làCa3PO4.

3.2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giảiphosphate khó tan của các chủng vi sinh vật

Thực hiện 54 ống nghiệm chứa 10ml môi trường NBRIP Hấp khử trùng các ốngnghiệm bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 1atm trong thời gian 20 phút Cấy giống mỗi chủngvi sinh vật vào 9 ống nghiệm Chia các ống nghiệm thành 3 lô Mỗi lô có 3 ống nghiệmcủa mỗi chủng vi sinh vật Mỗi lô thí nghiệm được phân bố như sau:

- Lô 1: Đặt trong điều kiện bình thường của phòng thí nghiệm - Lô 2: Đặt trong tủ ấm, chỉnh nhiệt độ tại 30oC.

- Lô 3: Đặt trong tủ ấm, chỉnh nhiệt độ tại 35oC.

Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các ống nghiệm để làmphản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4.

3.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giảiphosphate khó tan của các chủng vi sinh vật

Sử dụng môi trường NBRIP cho thí nghiệm Đo pH của môi trường bằng máy đopH – meter Điều chỉnh pH môi trường bằng KOH 1N và HCl 1N Thí nghiệm trên 3 lô:

- Lô 1: Sử dụng môi trường NBRIP không có điều chỉnh pH (pH = 6.8) - Lô 2: Môi trường được điều chỉnh pH về giá trị 5.8.

- Lô 3: Môi trường được điều chỉnh pH về giá trị 7.8.

Mỗi lô thí nghiệm môi trường được phân phối vào 18 ống nghiệm, mỗi ốngnghiệm chứa 10ml môi trường Sau đó hấp khử trùng ở 1atm trong 20 phút Cấy giống visinh vật vào 3 lô Cấy mỗi giống vi sinh vật vào 3 ống nghiệm của một lô.

Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các ống nghiệm để làmphản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO43-.

3.2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân giảiphosphate khó tan của các chủng vi sinh vật

Chuẩn bị 3 lô thí nghiệm, mỗi lô thí nghiệm gồm 12 bình tam giác 250ml Phânphối vào mỗi bình tam giác 50ml môi trường NBRIP, đem hấp khử trùng ở 121oC, 1atm.Cấy giống vi sinh vật vào cấc bình tam giác Mỗi giống cấy vào 2 bình tam giác trên 1 lô.Các lô được lắc ở các tốc độ khác nhau:

- Lô 1 : Để ở trạng thái tĩnh.- Lô 2 : Lắc ở tốc độ 75rpm.- Lô 3 : Lắc ở tốc độ 150 rpm.

Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làmphản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO43-.

3.2.6 Phương pháp nghiên cứu một số thành phần môi trường để nuôi cấy cácchủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan

3.2.6.1 Phương pháp xác định nguồn carbon thích hợp cho nuôi cấy các chủng visinh vật phân giải phosphate khó tan

Thành phần môi trường dựa trên môi trường NBRIP nhưng có thay đổi Các nguồncarbon sử dụng là glucose và saccharose

Thực hiện 2 lô thí nghiệm.

- Lô 1 : sử dụng nguồn carbon là glucose (10g/l) Môi trường được phân phối vào18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm Cấygiống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.

- Lô 2 : Sử dụng nguồn carbon là saccharose (10g/l) Môi trường được phân phốivào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm.Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.

Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làmphản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4.

3.2.6.2 Phương pháp xác định nguồn nitơ thích hợp cho nuôi cấy các chủng vi sinhvật phân giải phosphate khó tan

Sử dụng môi trường NBRIP, tuy nhiên thành phần chứa nitơ được thay đổi Các

nguồn nitơ sử dụng là urê và (NH4)2SO4.Thực hiện 2 lô thí nghiệm.

- Lô 1 : sử dụng nguồn nitơ là urê ( 0.053g/l) Môi trường được phân phối vào 18ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm Cấygiống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.

- Lô 2 : Sử dụng nguồn nitơ là (NH4)2SO4 (0.1g/l) Môi trường được phân phối vào18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm Cấygiống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.

Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làmphản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO43-.

3.2.7 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính phân giải phosphate khó tan của cácchủng vi sinh vật tuyển chọn được trên nguồn phosphate AlPO4

Sử dụng môi trường NBRIP với nguồn phosphate khó tan được thay đổi làAlPO4(3.9g/l).

Thực hiện 2 lô thí nghiệm:

- Lô 1 : sử dụng nguồn phosphate khó tan là Ca3(PO4)2 Môi trường được phânphối vào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và1atm Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.

- Lô 2 : Sử dụng nguồn phosphate khó tan là AlPO4 Môi trường được phân phốivào 18 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml môi trường, đem hấp khử trùng ở 121oC và 1atm.Cấy giống vi sinh vật vào các ống môi trường, mỗi giống lặp lại 3 lần.

Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch môi trường của các bình tam giác để làmphản ứng xanh molipdate, xác định nồng độ PO4 So sánh hoạt tính phân giải phosphatekhó tan khi sử dụng AlPO4 với đối chứng là Ca3(PO4)2 ở lô 1.

3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Các số liệu về khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vậtđược xử lý trên phần mềm MSTATC version 2.10 của Đại học bang Michigan Các sốliệu được phân tích ANOVA 1 và được trắc nghiệm phân hạng LSD với mức ý nghĩa0.01.

Đồ thị tương quan và phương trình tương quan giữa chỉ số mật độ quang OD vànồng độ PO4 được xử lý trên phần mềm EXCELL 2007 của Microsoft Các biểu đồ kháccũng được xử lý trên phần mềm này.

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1 Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan

Các mẫu đất đỏ bazan của 3 huyện Krông Năng, Cư Kuin, Cư M gar được nghiềnnhỏ rồi pha loãng từ 10-2 đến 10-7 Mỗi độ pha loãng lấy 100 μl trải đều trên đĩa thạch Kếtl trải đều trên đĩa thạch Kếtquả cho thấy ở độ pha loãng 10-4 – 10-5 cho kết quả khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250.

Bảng 4.1 Tổng mật độ vi sinh vật phân giải phosphate khó tan ở 3 mẫu đất: KrôngNăng, Cư Kuin, Cư Mgar

Các khuẩn lạc sẽ được phân loại sơ bộ dựa vào hình thái của khuẩn lạc và hình tháitế bào của vi sinh vật Những khuẩn lạc nào có đặc điểm hình thái giống nhau sẽ được xếpvào một chủng

Bảng 4.2 Các chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan phân lập

Để xác định số lượng chủng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan ở mỗi mẫuđất, đếm số chủng vi sinh vật trên các đĩa thạch Kết quả được ghi nhận trong bảng 4.3như sau:

Bảng 4.3 Số chủng vi sinh vật phân lập được trên các mẫu đất từ Krông Năng, CưMgar và Cư Kuin.

4.2 Đánh giá và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải phosphatekhó tan cao

4.2.1 Xây dựng đường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồngđộ mg/l của dung dịch PO4

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp xanh molypdate để đánhgiá khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật Do đó, việc dựngđường chuẩn và phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l của dung dịchPO4 là cần thiết cho các đánh giá sau này cũng như có thể so sánh kết quả của nghiên cứunày với các nghiên cứu khác KH2PO4 được pha ở các nồng độ khác nhau rồi thực hiệnphản ứng xanh molipdate Kết quả thể hiện qua bảng 4.4 như sau:

Bảng 4.4 Chỉ số OD của các nồng độ KH2PO4 khác nhau.STTNồng độ KH2PO4 (mg/l)Chỉ số OD 690nm

Theo đồ thị 4.1, phương trình tương quan giữa chỉ số OD và nồng độ mg/l:y=1.84x

Trong đó: x là nồng độ PO4 (mg/l).y là chỉ số OD.

4.2.2 Đánh giá và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải phosphatekhó tan cao

Các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng phân giải phosphate khó tan khônggiống nhau Vì vậy, đánh giá khả năng phân giải của từng chủng là rất cần thiết Chúngtôi tiến hành nuôi 17 chủng vi sinh vật trong môi trường NBRIP trong 5 ngày, sau đó xácđịnh nồng độ PO4 được phân giải Kết quả về khả năng phân giải phosphate khó tan của17 được ghi nhận trong bảng 4.5.

Bảng 4.5 Hoạt tính phân giải phosphate khó tan của 17 chủng vi sinh vật

So sánh kết quả thí nghiệm với nghiên cứu của Henri và cộng sự (2008) về khả

năng phân giải phosphate khó tan của Pseudomonas fluorescens sau 5 ngày nuôi cấy ở pH

bằng 6.3 là 15.25mg/l [20], chúng tôi nhận thấy có thể tuyển chọn một số chủng có hoạttính phân giải phosphate khó tan cao để tiếp tục thí nghiệm

Khả năng phân giải phosphate khó tan của các chủng vi sinh vật được thể hiện quabiểu đồ sau:

Biểu đồ 4.2 Khả năng phân giải phosphate khó tan của 17 chủng vi sinh vật

Như vậy, đã xác định được 6 chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải phosphatekhó tan cao nhất là M1, X2, X3, M5, M7, X15 Trong đó X3, M7, M1 có khả năng phângiải cao nhất a Sau đó là hai chủng M5, X15, X2 có mức phân giải phosphate thấp hơn b,bc Các chủng này sẽ được chúng tôi sử dụng cho các thí nghiệm sau.

4.3 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Sáu chủng vi sinh vật tuyển chọn sẽ được cấy ria chữ T trên đĩa petri Sau 3 ngày,chúng tôi quan sát các đặc điểm khuẩn lạc của các chủng và làm tiêu bản tế bào để xemtrên kính hiển vi Các khuẩn lạc sẽ được quan sát trên vật kính 4x và 10x Tiêu bản tế bàođược quan sát ở vật kính 40x, 100x Hình thái khuẩn lạc của 6 chủng vi sinh vật được môtả trong bảng 4.6.

Bảng 4.6 Hình thái khuẩn lạc của 6 chủng vi sinh vật tuyển chọn

def cd

hfg

Hình thái tế bào của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được mô ta trong bảng 4.7.

Bảng 4.7 Hình thái tế bào của 6 chủng vi sinh vật tuyển chọn được.Ký hiệu

Khuẩn ti khí sinh: 0.5 - 1µm.Cuống sinh bào tử:0.5 - 1µm x 10- 20µm

Khuẩn ti không vách ngăn,cuống sinh bào tử nhánhthẳng, mọc đơn.

Khuẩn ti khí sinh: 1.5 - 2µm.Cuống sinh bào tử: 1.5 - 2µm x15 - 20µm.

Khuẩn ti không váchngăn,cuống sinh bào tử lượnsóng.

Khuẩn ti khí sinh: 0.5 - 1µm.Cuống sinh bào tử:0.5 - 1µm x30- 40µm.

Ký hiệuchủng

Hình thái khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy

Ghồ

4.4 Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân giải phosphate khótan của các chủng tuyển chọn

4.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải phosphate khó tan của cácchủng tuyển chọn

Mỗi cơ thể vi sinh vật đều chịu tác động của nhiệt độ ở ba giới hạn khác nhau:nhiệt độ thấp nhất, nhiệt độ tối thích và nhiệt độ cao nhất Chính vì vậy nghiên cứu ảnhhưởng của nhiệt độ đến khả năng phân giải phosphate của các chủng vi sinh vật là cầnthiết Chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường NBRIP trong trạng tháitĩnh ở 3 mốc nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ thường, 30oC, 35oC Sau 72h nuôi cấy, đem lytâm dịch môi trường rồi thực hiện phản ứng xanh molypdate và đo OD ở bước sóng690nm Kết quả được trình bày trong bảng 4.8.