Thạc sĩ nông nghiệp: NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA

Thạc sĩ nông nghiệp: NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NUÔI CẤY BAO PHẤN Ở CÂY LÚA

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

THÁI NGUYÊN, NĂM 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS.TRẦN NGỌC NGOẠN PGS.TS.NGÔ XUÂN BÌNH

THÁI NGUYÊN, NĂM 2009

Lêi c¶m ¬n

Để hoàn thành khóa học và thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ, chỉ dẫn của các thầy cô giáo Khoa Nông học, tập thể cán bộ công nhân Trung tâm Thực hành Thực nghiệm - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, bạn bè cùng gia đình

Nhân dịp này tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới tập thể thầy, cô giáo và cán bộ nhân viên:

Bộ môn công nghệ sinh học - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Bộ môn Giống cây trồng - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Đặc biệt cho phép tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: PGS.TS.Trần Ngọc Ngoạn – Phó Hiệu Trưởng - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

PGS.TS Ngô Xuân Bình - Phó trưởng khoa Nông học - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

ThS Phạm Văn Ngọc - Bộ môn cây trồng - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua

Xin kính chúc thầy cô, các anh chị cán bộ cùng bạn bè và gia đình luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và công tác tốt

Thái Nguyên, ngày 16 tháng 10 năm 2009

Học viên

Đào Xuân Thanh

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây lúa (Oryza sativa L) là cây lương thực giữ vai trò quan trọng hàng

đầu Mỗi năm, khoảng 1/2 dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm lương thực chính Lúa được trồng phổ biến ở các nước Châu á, Châu Phi, Châu Mĩ La Tinh Đối với các nước Châu như: Ấn Độ, Trung Quốc, Inđônêxia, Băngladesh, Miến Điện, Thái Lan và Việt Nam thì lúa gạo là cây lương thực đặc biệt quan trọng trong đời sống con người

Trong những năm gần đây, cùng với đà tăng dân số, sự phát triển mạnh mẽ của nền công nghiệp và đô thị hoá nông thôn làm cho diện tích đất trồng trọt ngày càng thu hẹp lại Nếu mở rộng diện tích sẽ gặp rất nhiều khó khăn và tốn kém Để đáp ứng đủ nhu cầu lúa gạo của người tiêu dùng và an ninh lương thực quốc gia, các nhà tạo giống phải tìm cách làm tăng năng suất, sản lượng lúa trên diện tích đất trồng không thể mở rộng Phương án sử dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh trên những giống lúa cao sản, chịu thâm canh là thích hợp nhất

Bằng các phương pháp lai hữu tính, phương pháp chuyển gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ vào các giống lúa thuần, phương pháp xử lý đột biến v.v…các nhà tạo giống đã có nhiều thành công với những giống mới có năng suất và sản lượng cao Song việc sử dụng các phương pháp tạo giống như đã nói ở trên tuy có tạo ra những tổ hợp lai năng suất cao nhưng độ thuần chưa ổn định Mặt khác, nếu áp dụng phương pháp chuyển gen bất dục đực mẫn cảm nhiệt độ vào các giống lúa thuần rồi chọn thuần như các giống lúa thuần thì phải mất khoảng 10 vụ bởi vì giống bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ chỉ kết hạt trong điều kiện nhiệt độ < 240C Như vậy, thời gian từ tạo được giống đến khi phổ biến sản xuất thực tiễn đại trà phải mất 10 năm Trong những năm gần đây, việc ứng dụng biện pháp nuôi cấy bao phấn tạo các dòng nhị

bội, nhanh chóng tạo các giống lúa thuần có năng suất cao, chống chịu tốt, đã thu được nhiều kết quả Đó là phương pháp tạo dòng thuần nhanh và hiệu quả nhất

Tuy nhiên, mỗi dòng lúa với những tính trạng di truyền khác nhau, sẽ có hàm lượng Auxin trong cây khác nhau do đó sẽ có những phản ứng khác nhau với điều kiện nuôi cấy Để thành công trong việc tạo các dòng thuần bằng kỹ thuật nuôi cấy đó thì phải xác định được những yêu cầu về vật liệu cấy, môi trường dinh dưỡng, các tác nhân vật lý, hoá học…của các dòng lúa và đánh giá được khả năng thích ứng của chúng trên đồng ruộng

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu tạo vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ở cây lúa”

2 Mục đích của đề tài

- Xác định được mức ảnh hưởng của các nhân tố: vật lý, môi trường nuôi cấy, nồng độ hormon kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo, tái sinh chồi và ra rễ trong quá trình tạo cây lúa hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn

- Tạo được dòng thuần trong quá trình nuôi cấy

- Bước đầu đánh giá được dòng có triển vọng cho năng suất cao, thích nghi với điều kiện sinh thái đồng ruộng ở Thái Nguyên, có khả năng làm vật liệu khởi đầu trong công tác tạo giống lúa ưu thế lai

3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được thời gian xử lý lạnh thích hợp nhất đối với nuôi cấy bao phấn lúa

- Xác định được nồng độ chất khử trùng hypocloratnatri thích hợp nhất cho xử lý mẫu cấy

- Xác định được ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường N6 đến

- Xác định được nồng độ các chất 2,4 D; NAA thích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo của mẫu cấy

- Xác định được nồng độ các chất Kinetin và BAP thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ mô sẹo

- Xác định được nồng độ chất NAA thích hợp nhất cho quá trình ra rễ từ chồi xanh

- Xác định ảnh hưởng của các loại môi trường thuần dưỡng đến quá trình sinh trưởng của cây lúa

- Đánh giá sơ bộ năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất và một số đặc điểm sinh trưởng phát triển, khả năng kháng bệnh của 20 dòng lúa được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn

4 Ý nghĩa của đề tài

* Ý nghĩa trong nghiên cứu khoa học:

- Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật tạo cây lúa thuần đồng hợp tử bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn Từ đó làm cơ sở cho việc chọn các dòng tế bào như:

+ Chọn dòng kháng sâu bệnh + Chọn dòng chịu thâm canh…

- Lựa chọn sơ bộ được một số dòng thuần, làm vật liệu khởi đầu cho công tác tạo giống ưu thế lai

- Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần định hướng, làm tăng tính khả thi cho những đề tài nghiên cứu về bao phấn lúa tiếp theo

* Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất:

Rút ngắn thời gian tạo giống, do đó giảm giá thành sản xuất giống lúa mới đồng thời nhanh chóng đưa được nhiều giống lúa mới vào sản xuất

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu mô tế bào thực vật 1.1.1 Lịch sử phát triển

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được các nhà khoa học tiến hành vào cuối thế kỷ XIX

Quá trình phát triển đó có thể tạm chia thành 4 giai đoạn [12]

1.1.1.1 Giai đoạn khởi xướng (1898-1930)

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được nhà Bác học người Đức Grottied Haberlandt đề xướng năm 1898 Ông đã tìm cách nuôi cấy các tế bào thực vật phân lập nhưng không thành công Các công trình về nuôi cấy mô tế bào của các nhà khoa học khác như Winker (1902), Thielman (1924), Kuster (1929), cũng không đạt được mục tiêu nghiên cứu

Năm 1929 Schmacker đã bước đầu thành công trong lĩnh vực này Sau đó có Schitterer (1931), Pfeiffer (1931), Lanrue (1933) cũng đã có những thành công bước đầu trong nuôi cấy đầu rễ phân lập trong môi trường nhân tạo Điều đó giúp cho các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau

1.1.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 -1950)

Giai đoạn này được bắt đầu bằng công trình nuôi cấy đầu rễ cây cà chua trong môi trường nhân tạo, được thực hiện bởi nhà bác học White (1934) Bằng thí nghiệm này ông là người đầu tiên đã chứng minh được rằng mô phân sinh có thể duy trì thời gian sinh trưởng hơn nữa nếu chúng tiếp tục được nuôi cấy bằng môi trường dinh dưỡng mới Cũng trong thời gian này, Gautherets đã thành công trong nuôi cấy mô tượng tầng và tìm được môi

Năm 1935 Went và Thisnamn đã khám phá ra auxin IAA có khả năng kích thích sự hình thành mô sẹo

Năm 1941, hai nhà khoa học người Mỹ Overbeek và Steward với thí nghiệm nuôi cấy họ cà Datura, đã chỉ ra rằng auxin kích thích sinh trưởng có trong nước dừa Cũng trong thời gian này hai ông đã phát hiện ra tác dụng chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin, đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công như NAA, 2,4 D có ảnh hưởng tích cực trong việc tạo mô sẹo và gây phân chia tế bào Nhiều nhà khoa học đã bổ sung các Auxin và các Vitamin vào môi trường nuôi cấy và đã khẳng định vai trò của chúng trong môi trường nuôi cấy mô

Năm 1955 Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã xác định được vai trò của Kinetin tới việc kích thích sự phát triển của mô Những phát hiện mới mẻ về vai trò của các chất kích thích sinh trưởng 2,4D, IAA, NAA, kinetin, các vitamin trong giai đoạn này là bước tiến quan trọng trong lịch sử của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1.3 Giai đoạn phát sinh hình thái (1950 - 1960)

Năm 1956 Miller và Skoog đã thành công trong thí nghiệm tạo chồi từ mô thuốc lá nuôi cấy Chính Skoog đã phát hiện ra vai trò của kinetin trong sự phân hoá các cơ quan của cây thuốc lá

Những năm 1958-1959 Reinert (Đức) và Steward (Mỹ) đã nuôi cấy tế bào cây cà rôt và thu được phôi soma từ mô của chúng

Năm 1956 Nickell đã nuôi cấy thành công tế bào đơn Phaseolus vulgais trong dung dịch lỏng

Năm 1960, bằng kỹ thuật gieo tế bào, Bergman đã tái sinh thành công tế bào đơn của cây thuốc lá

1.1.1.4 Giai đoạn nghiên cứu di truyền (1960 đến nay)

Các thành tựu của giai đoạn này đã chính thức ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật invitro vào công tác giống và nghiên cứu di truyền

Năm 1960 Cooking (Anh) đã dùng men Cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào không có vỏ, còn gọi là các tế bào trần (protoplast)

Nitsch (1967), Nakata và Tanaka (1968) là những người thành công đầu tiên trong việc tạo cây thuốc lá đơn bội bằng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn

Takabe (1971) tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast Melchers(1977) dung hợp protoplast thành công giữa khoai tây và cà chua tạo cây “Pomate”

Năm 1985, cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố Khái niệm chuyển gen trở thành phổ cập trong thuật ngữ công nghệ sinh học thực vật Ledoux cho rằng có thể gây ra biến dị di truyền ở biến dị tế bào, thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai.[20]

Từ năm 1980 đến nay, hàng loạt thành công mới trong lĩnh vực công nghệ được công bố Nuôi cấy mô tế bào đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong công nghệ tạo giống và nhân giống hiện đại

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã mang lại những cơ sở lý luận mới mẻ cho sinh học hiện đại

1.1.2 Tình hình nuôi cấy bao phấn lúa trên thế giới

Năm 1968 Nishi và cộng sự là những tác giả đầu tiên thành công trong lĩnh vực nuôi cấy bao phấn trên những cây một lá mầm sau khi công bố kết quả tái sinh cây lúa hoàn chỉnh từ mô sẹo Sau đó, hàng loạt các tác giả cũng công bố những kết quả khả quan như: Chu et al (1975), Chen (1977), Chalyf anh Stalanrl (1981), Wang et.al (1982), Mich et.al (1985) Kết quả tạo cây đơn bội và lưỡng bội thuần thu được chủ yếu ở loài phụ Japonica, đối với loài

Các giống lúa có nguồn gốc họ phụ Indica là những giống lúa khó tính trong việc nuôi cấy bao phấn Để tiến tới thành công, các nhà khoa học đã và đang tìm cách xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố có tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến quá trình nuôi cấy Các yếu tố đó là: Kiểu gen của cây cho phấn, giai đoạn phát triển của cây trong thời điểm lấy mẫu, thành phần môi trường nuôi cấy, các yếu tố vật lý như nhiệt độ, ánh sáng

* Ảnh hưởng của kiểu gen cây cho bao phấn:

Sự thay đổi của tần số tạo mô sẹo và khả năng tái sinh của mô sẹo ở phấn hoa phụ thuộc phần lớn vào kiểu gen của cây Kết quả quan sát của Oono (1968), Chu (1982), Hu (1985), Zapata (1990) cho thấy sự khác biệt của các kiểu gen kéo theo sự khác biệt trong khả năng nuôi cấy lúa Kiểu gen loài phụ Indica phát triển và tạo mô sẹo kém so với loài phụ Japonica

Theo Mathias và Fukki (1986) khả năng tái sinh của cây lúa trong nuôi cấy tế bào bị chi phối bởi sự tương tác tế bào chất, nhân của chính nó

* Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của cây trong thời điểm lấy mẫu

Các tác giả Oono (1975), Lin (1976), Chen (1977) cho thấy: mẫu bao phấn được lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai đoạn đơn bào muộn là tốt nhất Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả năng phát triển trong môi trường nuôi cấy invitro, Bao phấn ở giai đoạn đơn bào sớm phát triển kém

Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi tứ tử (giai đoạn đơn bào giữa đến đơn bào muộn)

*Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đòng

Kêt quả nghiên cứu của Zhou và Cs (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn lúa Điều kiện lạnh làm tăng khả năng tạo cây xanh

+ Chaleff và Cs (1975) xử lý đòng ở 60C trong 5 ngày

+ Hu và Cs (1978) đã xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 100C trong thời gian 4 - 8 ngày

+ Matitin và Drimo Millo (1981) đã tiến hành xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 2 - 40C trong thời gian 48h

+ Gupta và Borthakeu (1987) đã xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 100C trong thời gian 11 ngày

+ Guapta, Quimio và Zapata (1990) xử lý đòng ở 6-80C trong thời gian 8 ngày

+ Rush và cộng sự (1982) đã tiến hành xử lý đòng lúa ở nhiệt độ 400C trong thời gian 15 phút

+ Năm 1886, Torrizo xử lý đòng ở 350C trong 15 phút cũng cho kết quả khả quan

Nói chung, đã có nhiều thí nghiệm nghiên cứu về sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thởi gian xử lý đòng đến kết quả nuôi cấy bao phấn lúa Kết quả nghiên cứu của các tác giả cho thấy rằng xử lý đòng ở nhiệt độ khác nhau sẽ cho những kết quả nuôi cấy khác nhau

* Ảnh hưởng của nồng độ Cacbon đến quá trình tạo mô sẹo và tái sinh cây

Nồng độ cacbon có thể làm thay đổi tỷ lệ hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn lúa

Chen (1978) cho biết đường có tác dụng làm thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy Nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy từ 6 - 8% sẽ làm tăng cả hai quá trình hình thành mô sẹo và tái sinh tiếp theo

Năm 1988 Kim và Paghavan thông báo rằng: Tỷ lệ hình thành mô sẹo từ bao phấn sẽ giảm đi khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy cao (8 -12%)

* Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến quá trình tạo mô sẹo và tái sinh cây

Trong kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa, các chất điều hoà sinh trưỏng có thể sử dụng ở dạng đơn hay kết hợp theo những tỷ lệ khác nhau

Năm 1980, Khi nuôi cấy bao phấn lúa Japonica, Yang và cộng sự đã sử dụng kết hợp NAA 4mg/l + 2,4D 1mg/l + IAA 2mg/l + Kinetin 3mg/l Kết quả cho thấy rằng nếu môi trường tạo mô sẹo có chứa 2,4D nồng độ 1mg/l thì mô sẹo dễ dàng tái sinh thành cây

Theo Wasakd (1982): IAA xúc tiến quá trình hình thành rễ, Sự kết hợp các auxin: IAA, NAA, Kinetin một cách hợp lý sẽ xúc tiến mạnh mẽ quá trình phân hoá tế bào và tái sinh cây xanh

Nhìn chung, các chất tham gia vào môi trường nuôi cấy bao phấn lúa như chất điều hoà sinh trưởng, muối, đường, sắt, Vitamin đều có sự ảnh hưởng lẫn nhau và ảnh hưởng chung đến kết quả của quá trình nuôi cấy

* Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý trong môi trường

Các yếu tố vật lý của môi trường bao gồm:

+ Trạng thái vật lý của môi trường ở dạng rắn hay lỏng + Độ pH môi trường

+ Độ ẩm không khí

+ Ánh sáng và nhiệt độ của phòng nuôi cấy

Các yếu tố trên tác dụng trực tiếp đến sự hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh chồi

Kết quả nghiên cứu lúa mỳ của Bjarmsta (1989) cho thấy rằng xử lý ánh sáng cường độ cao sẽ kìm hãm quá trình tạo mô sẹo nhưng lại kích thích quá trình tạo cây xanh, ánh sáng yếu hoặc ánh sáng khuyếch tán không ảnh hưởng gì đến khả năng tạo mô sẹo của mẫu cấy

* Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau đến quá trình nuôi cấy bao phấn

Các môi trường khác nhau sẽ cho những kết quả nuôi cấy bao phấn là khác nhau Năm 1962 Dono thông báo môi trường Murashige and skoog là môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy bao phấn Đến năm 1975 thì Chu và

Cs lại thông báo rằng môi trường N6 là môi trường tốt nhất cho nuôi cấy bao phấn lúa

Năm 1974, hai nhóm nghiên cứu của Chen và Wang đã thành công lớn khi sử dụng môi trường Miller trong nuôi cấy bao phấn lúa

Rất nhiều tác giả có chung một kết luận rằng: môi trường có nồng độ muối vô cơ cao sẽ rất thích hợp cho phân hoá mô sẹo

1.1.3 Tình hình nuôi cấy bao phấn ở Việt Nam

Ở nước ta, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật mới bắt đầu từ năm 1975 [16] Kỹ thuật nhân giống invitro đã được tiến hành trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau như: chuối, khoai tây, cà chua, ngô, lúa, phong lan…và cũng đã đạt được những kết quả nhất định, làm tăng hệ số nhân giống và tạo được giống mới sạch bệnh ở các loại cây này

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa được ứng dụng rất sớm vào công tác chọn tạo giống và đã được tiến hành ở những cơ quan nghiên cứu khoa học, các trường đại học Phương pháp này được thực hiện có sự trợ giúp của công nghệ sinh học nhằm chuyển lạp gen, gây áp lực bằng điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở mức độ tế bào (rét, nóng, bệnh hai…), nuôi cấy bao phấn, dung hợp tế bào trần, nuôi cấy phôi lúa Bằng công nghệ sinh học người ta có thể chủ động chuyển thêm một số gen mới có lợi đã được nghiên cứu kỹ vào cây lúa như gen kháng bạc lá, gen chịu phèn, gen chịu rét, gen chịu mặn…Tuy nhiên số lượng những giống lúa đạt năng suất, chất lượng được tạo ra chưa nhiều

Đỗ Năng Vịnh và Lê Thị Diệu Muội [15] đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo thành mô sẹo và tạo thành cây lúa từ hạt phấn bằng phương pháp nuôi cấy invitro

Sau nhiều năm tiến hành nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn, năm 1993 Nguyễn Hữu Hổ và Nguyễn Văn Uyển đã có những kết luận sau:

- Trong mô túi phấn có chất ức chế ảnh hưởng tới sự phát triển hạt phấn

- Giữa phôi dinh dưỡng và hạt phấn hoặc là giữa các phôi với nhau luôn luôn có sự cạnh tranh làm ức chế quá trình tái sinh cây

- Trong môi trường nuôi cấy, phôi dinh dưỡng nhị bội phát triển mạnh hơn hạt phấn tách rời dẫn đến kết quả là mô sẹo nhị bội chiếm ưu thế so với mô sẹo đơn bội

Để loại bỏ các nhân tố cạnh tranh đối với sự phát triển của hạt phấn, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nuôi phấn hạt phấn sau khi đã tách rời khỏi mô túi phấn Song kết quả đạt được vẫn còn rát khiêm tốn Thực tế cho thấy tỷ lệ mô sẹo hình thành thấp, sức tái sinh cây từ mô sẹo cũng không cao

Cũng trong thời gian này, các tác giả đã thử nghiệm nuôi cấy bao phấn lúa trong môi trường lỏng và rút ra kết luân:

+ Môi trường lỏng thuận lợi cho sự hấp thu dinh dưỡng hơn môi trường rắn + Các chất độc do hạt phấn chết tạo ra không có tác động xấu tới các hạt phấn khác bởi vì nó đã bị khuyếch tán vào môi trường lỏng

Năm 1994, Viện di truyền nông nghiệp công bố quá trình nuôi cấy bao phấn, nâng cao tỉ lệ tạo mô sẹo và khả năng tái sinh của cây đơn bội (Nguyễn Văn Đồng, Vũ Đức Quang, Phạm Ngọc Lương, Trần Duy Quý 1994)

Từ năm 1994 – 2001, đã có công trình nghiên cứu nuôi cấy bao phấn lúa mới để chọn tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ phát triển lúa lai đựơc công bố (Viện di truyền nồng nghiệp 1997 - 2000)

Các nhà khoa học Việt Nam đã đạt được một số thành tựu có ý nghĩa to lớn trong sản suất Tại viện Di Truyền Nông nghiệp, phương pháp nuôi cấy bao phấn kết hợp với chọn dòng biến dị đã tạo ra 50 dòng bất dục phản ứng với nhiệt độ (TGMS) mới , trong đó 5 dòng được xác định là có tính bất dục ổn định, có ưu thế lai cao khi lai tạo và đang được sử dụng trong chọn giống lúa lai 2 dòng

Bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 12 dòng, giống thuần có ưu thế lai gần tương đương với con lai F1 các dòng giống có triển vọng

gồm DT26, DT29, DT32, AC22, AC23, AC24, AC25, đang được khảo nghiệm Nhờ nuôi cấy bao phấn lúa có thể rút ngắn thời gian chọn giống mới xuống từ 4-6 thế hệ Kỹ thuật đơn bội invitro cũng đang được triển khai mạnh trong chọn giống ở Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Viện công nghệ sinh học [9]

Những năm gần đây, Vũ Đức Quang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu và cải tiến môi trường N6 thành môi trường HD Ông cho rằng môi trường HD có ưu điểm vượt trội so với môi trường N6 và là môi trường tốt nhất cho sự phát triển của bao phấn lúa

Viện Di truyền nông nghiệp Hà Nội đã tạo ra 3 giống lúa quốc gia DT10, A20, DT11 bằng phương pháp gây đột biến

1.2 Khái niệm nhân giống Invitro

Nhân giông vô tính invitro là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trường nuôi cấy thích hợp và được kiểm soát [1]

Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin có trong các tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó để xây dựng lại toàn bộ cơ thể

1.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy Invitro 1.3.1 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy rằng, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ

điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [11]

Miller và Skoog (1956) đã tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy, chứng minh được tính toàn năng của tế bào Thành công trên đã tạo ra công nghệ mới: Công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

1.3.2 Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau

Mỗi tế bào khác nhau sẽ thực hiện một chức năng cụ thể khác nhau Song, mọi tế bào đều được tạo thành từ tế bào phôi sinh.[12]

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Quá trình phân hoá của tế bào có thể biểu thị như sau:

Tế bào phôi sinhTế bào giãn Tế bào chuyên hoá chức năng riêng

Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưng chúng vẫn giữ nguyên khả năng phân chia Trong điều kiện thích hợp, các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào, (ngược lại với quá trình phân hoá tế bào) Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong điều kiện cần thiết ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và

phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với quá trình phân hoá tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy 2 nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp thì sự phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi; nếu tỷ lệ này cao thì tạo thành rễ, còn khi tỷ lệ này cân bằng thì sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo [3]

1.3.3 Cơ chế di truyền thông qua các hệ tế bào

Cơ chế di truyền thông qua các thế hệ tế bào bao gồm các công đoạn: Trong quá trình nguyên phân, từ một tế bào mẹ sẽ nhân đôi, tạo ra 2 tế bào con giống nhau và giống tế bào mẹ ban đầu Như vậy qua nguyên phân bộ NST trong nội bộ từng cơ thể được diễn ra theo cơ chế nguyên phân, đây là cơ chế phân bào mà từ một tế bào ban đầu sẽ phân chia thành hai tế bào con có bộ NST giống bộ NST của tế bào mẹ đã truyền nguyên vẹn sang tế bào con Sở dĩ có hiện tượng này là do trước mỗi lần giảm phân, mỗi phân tử ADN đã thực hiện quá trình tái sinh để từ mỗi phân tử ADN hình thành 2 phân tử ADN giống nhau và giống ADN ban đầu Quá trình này được thực hiện ở kỳ trung gian và thông qua cơ chế phân ly đều của NST ở kỳ sau, là cơ sở cho sự truyền nguyên vẹn thông tin di truyền trong nội bộ cơ thể

Giữa 2 thế hệ cơ thể được hình thành thông qua cơ chế giảm phân đã làm cho ở thế hệ đời sau có hiện tượng phân ly tính trạng, do bộ NST của thế hệ sau không giống nhau và không giống bố mẹ Vì vậy việc duy trì các tính

thể đảm bảo hoàn toàn chắc chắn Đây là một trở ngại lớn trong sinh sản hữu tính Ngày nay bằng phương pháp sinh sản vô tính, người ta đã khắc phục được nhược điểm này Đặc biệt là nhân giống vô tính in vitro

Dựa trên cơ chế nguyên phân, trong nhân giống invitro khi lấy các bộ phận sinh dưỡng trong một cây đem nhân giống thì các bộ phận đó có thông tin di truyền giống nhau và tạo nên các cơ thể mới có thông tin di truyền giống nhau và giống cơ thể mẹ Như vậy nếu cơ thể mẹ có các tính trạng di truyền tốt thì các tính trạng đó sẽ được thể hiện ở mọi cơ thể con cái [9]

1.3.4 Môi trường nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng) 1.3.4.1 Khái niệm

Môi trường nuôi cấy là điều kiện vô cùng quan trọng, có tính chất quyết định sự phân hoá tế bào và cơ quan trong nuôi cấy

Theo Street [23] thì môi trường nuôi cấy và môi trường xung quanh là những nhân tố quyết định sự thành công hoặc thất bại của quá trình nuôi cấy invitro Môi trường nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự phân chia và phân hoá của mô tế bào trong suốt quá trình nuôi cấy Vì vậy, môi trường dinh dưỡng phải đầy đủ chất dinh dưỡng, các chất cần thiết

Đối với hầu hết các loài thực vật, Môi trường nuôi cấy bao gồm các nguyên tố đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các axitamin, các chất điều hoà sinh trưởng và một số chất phụ gia Thành phần dinh dưỡng, hàm lượng các chất cần thiết cho tế bào sinh trưởng tốt nhất thay đổi tuỳ theo từng loài, giống, nguồn gốc mẫu cấy hay từng cơ quan khác nhau trên cùng một cơ thể

1.3.4.2 Một số môi trường cơ bản

Đã có rất nhiều môi trường dinh dưỡng lần lượt được tìm ra trên cơ sở cải tiến môi trường của Kotte và Robbin (1902) như: Môi trường White (1934), Knudson (1946), Vacin và Went (1949), Heller(1953), Murasnige - Skoog (1962), Gammborg (B5) (1968), Knop (1974), WMR (1982), Aderson (1984),… Tuy nhiên, mỗi môi trường chỉ thích hợp với một loài cây nhất định

như: Môi trường Knudson (1946), Vacin và Went (1949), chỉ thích hợp cho các loài Lan, môi trường Murasnige - Skoog (1962) thích hợp cho cácloài cây thân thảo và một số loài cây thân gỗ sinh trưởng nhanh như Keo, Bạch đàn…Môi trường WMP chỉ thích hợp cho các loài cây thân gỗ.[9]

Tuỳ thuộc vào từng đối tượng cụ thể, trong mỗi giai đoạn nuôi cấy, mà lựa chọn loại môi trường thích hợp thì mới có kết quả khả quan Thông thường, người ta hay sử dụng môi trường MS và môi trường N6 cho nhân giống Invitro

- Các nguyên tố vi lượng:

Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, Co, I …là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi trường nuôi cấy invitro Các nguyên tố này đóng vai trò rất quan trọng trong các hoạt động của Enzim

Các nguyên tố vi lượng thường được dùng ở nồng độ thấp hơn so với các nguyên tốa đa lượng

- Nguồn cacbon

Mặc dù dưới ánh sáng nhân tạo, cây Invitro có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp Song, khả năng tổng hợp cacbon của chúng rất kém do đó các mô thực vật sống theo phương thức dị dưỡng là chính Các mô tế bào sống nhờ nguồn cacbon lấy từ đường trong môi trường dinh dưỡng Có hai loại

đường được sử dụng chủ yếu là sacarose và glucose với nồng độ thay đổi từ 20 – 40g/l tuỳ theo từng loài thực vật và mục đích nuôi cấy

- Các vitamin

Trong quá trình nuôi cấy, cây invitro có thể tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng chưa đáp ứng được nhu cầu sinh trưởng Do đó người ta thường bổ sung một số vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6 ở nồng độ 1mg/l; Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và bị phân huỷ ở nhiệt độ cao Vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 00C hoặc chỉ pha chế trước khi sử dụng Ngoài ra, bổ sung một lượng tương đối lớn myo-inositol : 50 - 500mg/l, để thúc đẩy sự phân chia mô tế bào

- Các chất phụ gia hữu cơ khác

Nước dừa, thanh hoạt tính, dịch chiết nấm men có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo nên thường được dùng lam chất phụ gia

Trong nước dừa có chứa đường, các axitamin, axit hữu cơ, đặc biệt trong nước dừa có chứa các hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô đó là myo-inositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các gluxit của xytokinin Nước dừa tỏ ra có tác dụng vượt trội trong các môi trường nhân nhanh chồi

- Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình nuôi cấy invitro, là yếu tố quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy Các hoormon tự nhiên có tác dụng đến sự biến đổi sinh lý, sinh hoá trong cây, đặc biệt ở các cơ quan chồi và rễ

Hoormon thực vật là những hợp chất hữu cơ do thực vật sinh sản ở nồng độ thấp làm nhiệm vụ điều tiết các quá trình sinh trưởng của cây Có 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng của thực vật đã được phát hiện, đó là: auxin, xytokinin, gibberellin, absixic axit và ethylen Trong đó, auxin và xytokinin là hai nhóm chất được sử dụng nhiều hơn cả

- Auxin:

Auxin là hoormon sinh trưởng Tác dụng chủ yếu của Auxin là kích thích sự giãn tế bào, làm tăng phân bào, sự hình thành mô sẹo và sự xuất hiện rễ bất định

Các Auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: + 2,4 Dicloro phenoxy axetic axit (2,4 D);

+ α – Naphtylaxetic axit(α –NAA); + Indolaxit axetic ( IAA)

+ Indol butyric acid (IBA)

Riêng IAA là auxin tự nhiên còn NAA, IBA và 2.4D là các auxin nhân tạo, auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên, do cấu trúc phân tử khá bền vững nên auxin nhân tạo khó bị oxy hóa bởi các enzyme Kinh nghiệm sử dụng auxin trong nuôi cấy cho kết quả cao là sử dụng auxin với nồng độ cao tại thời điểm ban đầu sau đó giảm dần để tránh tình trạng mô bị “say” và nhiễm độc Nồng độ auxin thường dùng từ 0,001 – 10mg/l môi trường nuôi cấy

- Cytokinin (hoormon phân bào):

Các hợp chất cytokinin kích thích sự phân bào và sự phân hoá chồi bất định Việc điều chỉnh tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phân hóa tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ hay tạo phôi soma Có 3 loại cytokinin chính được sử dụng trong nuôi cấy mô là:

+ Kinetin: Kinetin được hình thành từ chế phẩm AND ở điều kiện nhiệt

độ cao Trong cơ thể sống có thể không có kinetin tồn tại, sản phẩm này kích thích sự tạo thành chồi mô nuôi cấy

+ Zeatin: Tác dụng tương tự kinetin nhưng giá thành của zeatin khá

cao nên chỉ dùng trong những trường hợp thật đặc biệt

+ 6-Benzylaminopurine (BAP): Tác dụng của BAP giống kinetin

nhưng hoạt tính của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bền vững hơn zeatin

+ Nhóm xytokinin : Các chất thuộc nhóm xytokinin đang được sử dụng

chủ yếu là :

Kinetin (K), benzyl adenin purin (BAP), zeatin trong đó BAP và K được sử dụng rộng rãi nhất vì giá không đắt lại có hoạt tính cao

- Chất làm đông cứng môi trường – agar

Mỗi loài thực vật thích hợp với môi trường giá thể khác nhau người ta thường sử dụng thạch Aga – một loại polysacarrit làm từ rong biển, có khả năng ngậm nước cao, để làm đông cứng môi trường nuôi cấy Aga tan ở 1000C, đông đặc ở 450 Trong môi trường axit, aga không có khả năng đông đặc Nồng độ thường dùng từ 0,4% - 0,8% (tức 4 - 8 g/l) tuỳ thuộc vào độ tinh khiết và từng loại môi trường

Ví dụ : Đối với cây lúa, hàm luợng aga thích hợp từ 5,5 – 6,5 g/l

- pH môi trường : pH môi trường là yếu tố rất quan trọng, có tác động

rất lớn đến quá trình trao đổi chất của tế bào Độ pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào Các hợp chất đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, GA3, và cỏc vitamin Ngoài ra, hàng loạt các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào độ pH Khoảng pH thích hợp nhất cho nuôi cấy invitro là 5,5 – 5,8 Độ pH nhỏ hơn 4.5 hoặc lớn hơn 7 đều gây ức chế quá trình sinh trưởng của cây

Có thể dùng dung dịch KOH 1N, NaOH 1N hay HCl 1N với nồng độ 10% để điều chỉnh độ pH môi trường

* Môi trường Chu (N6)

Đây là môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn lúa và các loài cây hoà thảo khác

1.3.5 Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy Invitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô

nuôi cấy sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của của nuôi cấy mô invitro [12]

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định Tuy vậy, nếu tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl20.1%, NaHCl 10%, nước javen, cồn 760, clorox,…để khử trùng

Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cây

1.3.6 Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng và nhịêt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy [5]

1.3.6.1 Ánh sáng:

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18 h/ngày

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Theo Ammirato (1986): cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux (Morein, 1974), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo

Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35- 40cm

1.3.6.2 Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 250

C (white, 1973)

1.3.7 Vật liệu nuôi cấy

Để bắt đầu quá trình nhân giống vô tính cho 1 loài hoặc 1 dòng người ta phải chú trọng trước nhất là vật liệu nuôi cấy Đây là bước đầu tiên và là khâu quan trọng quyết định đến sự thành bại và tốc độ sinh trưởng của quá trình nhân giống Theo nguyên tắc, bất kỳ một tế bào trong cơ thể đều có khả năng tái sinh thành một cây hoàn chỉnh trong điều kiện thích hợp Tuy vậy để có tốc độ tái sinh, sức sống, sức chống chịu của cây con cao thì khả năng đó còn tùy thuộc vào tuổi sinh lý của vật liệu nuôi cấy [11]

Trong nuôi cấy mô người ta thường sử dụng vật liệu nuôi cấy như đỉnh sinh trưởng, chồi, bao phấn, gieo qua hạt, thân mầm…

1.3.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô, tế bào 1.3.8.1 Kiểu gen của cây cho bao phấn

Kiểu gen của cây cho bao phấn nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy Nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Japonica (kể cả trường hợp không xử lý lạnh trước) đều đạt tỷ lệ thành cây thường cao hơn nuôi cấy bao phấn của các giống lúa thuộc loài phụ Indica Chen và Lin (1981) còn thấy rằng tỷ lệ bao phấn tạo callus, khả năng callus tái sinh thành cây, tỷ lệ cây xanh/cây bạch tạng và số lượng nhiễm sắc thể của cây tái sinh đều liên quan đến kiểu gen của cây cho bao phấn Điều này chứng tỏ khả

năng nuôi cấy bao phấn lúa cũng do gen điều khiển, đối với những giống phản ứng tốt có thể chứa nhiều gen tác động lên quá trình này

Để tăng hiệu quả nuôi cấy có thể bằng cách lai tạo nhằm cải tiến giống Ví dụ : ở khoai tây kiểu gen phản ứng tốt có thể thu được bằng cách lai giữa kiểu gen phản ứng kém với kiểu gen phản ứng tốt

Phải thay đổi điều kiện và môi trường nuôi cấy cho từng loại cây trồng thậm chí cho từng giống cây trong cùng một loài

1.3.8.2 Giai đoạn phát triển của bao phấn

Giai đoạn phát triển của bao phấn tại thời điểm tách rời ra và nuôi cấy cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy Đối với lúa giai đoạn phản ứng tốt nhất là trước và giữa giai đoạn hạt phấn một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tăng từ 6% đến 9% (Chen, 1978)

Các tác giả Oono (1975), Lin (1976) và Chen (1977) cho thấy: Mẫu bao phấn được lấy vào thời điểm các tiểu bào tử trong bao phấn đang ở giai đoạn đơn bào muộn là tốt nhất Bao phấn ở giai đoạn tứ thể không có khả năng phát triển trong môi trường nuôi cấy invitro Bao phấn ở giai đoạn đơn bào sớm phát triển kém Hạt phấn chỉ có thể phát triển tốt khi đã tách ra khỏi tứ tử (giai đoạn đơn bào giữa đến đơn bào muộn)

1.3.8.3 Điều kiện sinh lý của cây cho bao phấn

Chen và Lin (1976), Chen và Tsay (1984) cho rằng bao phấn nào được lấy ở những bông trỗ sớm thì cho kết quả nuôi cấy tốt hơn bao phấn lấy ở những bông trỗ muộn Tỷ lệ tạo callus ở bao phấn lấy từ nhánh cấp 3 thấp hơn bao phấn từ nhánh cấp 1, cấp 2 và từ cây mẹ Lý do bao phấn từ nhánh cấp 3 cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn có thể những nhánh này thiếu dinh dưỡng.Tuy nhiên không có sự sai khác giữa những hoa ở các vị trí khác nhau trên cùng một nhánh Nhìn chung cây nào sinh trưởng khoẻ, trong điều kiên môi trường dinh dưỡng tối ưu, có cường độ ánh sáng mạnh thường cho bao phấn có tỷ lệ

1.3.8.4 Nhiệt độ và thời gian xử lý đòng

Kết quả nghiên cứu của Zhou và c.s (1983) đã cho thấy rằng: Xử lý đòng ở nhiệt độ thấp rất có hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn Điều kiện lạnh làm tăng khả năng tạo cây xanh

Hiệu quả của xử lý trước nhiệt độ thấp đến việc hình thành callus và cây con đã được nghiên cứu bởi một số tác giả về một số phương pháp xử lý như: Xử lý bông đã tách bẹ, xử lý bông chưa tách bẹ hoặc xử lý bao phấn đã được nuôi cấy Tất cả các phương pháp đó đều cho kết quả tốt, Tuy nhiên tốt hơn cả là theo phương pháp của Genovest và Magill (1979), xử lý bông còn nằm trong bẹ lá đòng ở nhiệt độ 10- 130

C trong 10-14 ngày [11]

Tsay và Chen (1984), Lin và Tsay (1984) phát hiện ra rằng những hạt phấn được xử lý lạnh đột ngột ở 8-100C trong 7 ngày tạo ra nhiều callus hơn gấp 2 lần so với không xử lý Tuy nhiên kết quả không khác biệt khi xử lý lạnh bao phấn đã cấy trên môi trường

Theo Chen và Cs (1982), thời gian xử lý lạnh dài 8-10 ngày tốt hơn 2-4 ngày Tuy nhiên nếu kéo dài thời gian này quá 15 ngày lại ức chế quá trình hình thành callus

Lin và Tsay (1984), Tsay và c.s (1988) cho biết callus hình thành từ bao phấn được xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn bội và ít cây lưỡng bội hơn là từ bao phấn không xử lý, điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh thành cây cao

Các giống khác nhau đòi hỏi điều kiện xử lý khác nhau, trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của hạt phấn cũng ảnh hưởng đến hiệu quả của xử lý Tsay và c.s (1988) thấy rằng khả năng hình thành callus tăng gấp 2 lần khi xử lý bao phấn chứa bào tử ở giai đoạn giữa và cuối một nhân trong 7-14 ngày, quá 14 ngày thì tỷ lệ cây xanh giảm

Nói chung đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đòng đến kết quả nuôi cấy bao phấn Kết quả của các tác giả cho thấy rằng xử lý đòng ở nhiệt độ khác nhau sẽ cho kết quả nuôi cấy khác nhau

1.4 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.4.1 Khái niệm nuôi cấy bao phấn

Nuôi cấy bao phấn chứa các bào tử hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường nhân tạo nhằm tạo cây đơn bội và được sử dụng rộng rãi trong cải tiến giống cây trồng Thông qua phương pháp này rút ngắn thời gian chọn tạo, tăng tính biến dị cho chọn lọc và giải quyết vấn đề lai xa Từ đó tạo dòng thần từ nuôi cấy bao phấn F1 hoăc F2 trong thời gian ngắn Kỹ thuật nuôi cấy invitro kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong môi trường nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Cho phép nhân nhanh chóng, tạo ra hàng loạt cây đơn bội đó là một lối thoát kì diệu đối với ứng dụng cây đơn bội, di truyền giống cây trồng [10]

Bình thường sự phát triển của tế bào sinh dục đực trong bao phấn đi theo các giai đoạn sau: Từ bào tử tế bào mẹ thông qua tính phân bào giảm nhiễm hình thành tiểu bào tử (đơn bội) Sau đó các tiểu bào tử hình thành các giao tử đực (hạt phấn cũng đơn bội) Nhưng khi ta đưa bao phấn và nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, sự phát triển của tiểu bào tử sẽ khác đi Dưới sự tác động của hàng loạt các yếu tố trong môi trường nhân tạo, đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng, trong tế bào sẽ diễn ra quá trình phản phân hoá, từ đó các bào tử sẽ phân chia thành mô sẹo, các mô sẹo này lúc đầu là đơn bội Sau đó tuỳ theo từng điều kiện nuôi cấy chúng có thể là đơn bội hay lưỡng bội hoá, khi chuyển vào trong môi trường tái sinh cây, ta sẽ thu được cây đơn bội hay lưỡng bội Khi cần thiết cây đơn bội thu đựơc ta có thể xử lý bằng colchicine để lưỡng bội hoá dòng đơn bội thu được (Theo Phan Khải, Vũ Đức Quang và cộng sự, 1990)

1.4.2 Các giai đoạn chính 1.4.2.1 Giai đoạn 1: Chuẩn bị

Đây là giai đoạn lựa chọn đối tượng nuôi cấy (cây trồng, giống) từ đó xác định bộ phận thích hợp của cây để làm vật liệu nuôi cấy (Ví dụ: thân, lá, chồi, nụ, cuống hoa, đế hoa, hạt phấn ) Song song với việc chuẩn bị mẫu cấy là tiến hành vệ sinh và khử trùng phòng nuôi cấy, các dụng cụ nuôi cấy, mẫu cấy Yêu cầu đối với mẫu cấy trước khi đưa vào nuôi cấy là phải được vô trùng, tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả giai đoạn này được quyết định bởi kỹ năng lấy mẫu, nồng độ chất khử trùng và thời gian xử lý khử trùng mẫu cấy

1.4.2.2 Giai đoạn 2: Cấy mẫu tạo mô sẹo

Sau khi vật liệu cấy đã được khử trùng trong thời gian nhất định thì tiến hành cấy mẫu vào môi trường invitro (vào mẫu) để tạo mô sẹo

Yêu cầu của giai đoạn này là phải hạn chế tối đa tỷ lệ nhiễm nấm và khuẩn trong phòng nuôi cấy

1.4.2.3 Giai đoạn 3: Tái sinh chồi

Khi mẫu cấy trong ống nghiệm đã tạo được nhiều mô sẹo thì tiến hành cấy tái sinh Yêu cầu của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy

Quá trình được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin/xytokinin đưa vào môi trường nuôi cấy Để tái sinh mẫu nuôi cấy trong ống nghiệm thường sử dụng chồi đỉnh, chồi nách, mô sẹo…

1.4.2.4 Giai đoạn 4: Nhân nhanh chồi

Để tạo hệ số nhân chồi cao nhất, tiến hành cấy chuyển các chồi được tái sinh ở mẫu tái sinh sang môi trường dinh dưỡng mới

Người ta thường đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng:auxin, xytokinin…các chất bổ sung khác như: nước dừa, dịch

chiết nấm men…đồng thời điều khiển nhiệt độ ánh sáng thích hợp…tạo điều kiện tốt nhất cho chồi sinh trưởng tốt, tăng hệ số nhân chồi tái sinh

Tùy thuộc vào đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành cụm chồi hoặc kích thích sự phát triển chồi nách

1.4.2.5 Giai đoạn 5: Cấy tạo rễ

Khi chồi đạt được kích thước nhất định ta cấy chuyển các chồi đó sang môi trường ra rễ Thường sau 2-3 tuần từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin có chức năng tạo rễ phụ từ chồi

Thông thường, các nhóm chất IAA, NAA, 2,4D được sử dụng nhiều trong quá trình nghiên cứu và sản xuất, tác dụng xúc tiến hình thành rễ từ chồi tái sinh Mỗi một loài cây, loại mô sẽ yêu cầu một nồng độ hoá chất khác nhau để tạo rễ tốt nhất

1.4.2.6 Giai đoạn 6: Đưa cây tái sinh trở về điều kiện sống tự nhiên

Đây là công đoạn cuối cùng của quá trình nuôi cấy invitro Cây đã tái sinh hoàn chỉnh (đủ rễ, thân, lá) được đưa ra khỏi ống nghiệm, thuần dưỡng trong các môi trường như đất, môi trường thuần dưỡng lỏng… kết quả của giai đoạn này sẽ quyết định khả năng ứng dụng cây invitro trong các chương trình giống hoặc vào các mục đích khác nhau

1.5 Kỹ thuật đơn bội Invitro và công tác giống cây trồng 1.5.1 Cây đơn bội

Cây trồng trong tự nhiên da dạng về loài và mỗi loài có mức bội thể khác nhau Song, hầu hết cây trồng có nhiễm sắc thể lớn hơn 1 dạng nhị bội thể 2n là phổ biến Cũng có những loài cây có bộ nhiễm sắc thể tam bội, tứ bội, lục bội ví dụ như: Cây mía, cây khoai lang có bội nhiễm sắc thể hỗn loạn 2n, 4n và 6n Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền của chúng đều bị hai hay nhiều gen chi phối, một số gen sẽ có trên 2alen và có hiện tượng trội hoặc lặn

Nếu cây đa bội thể mang những cặp gen dị hợp tử thì biểu hiện kiểu hình là do các tính trạng trội hoặc lặn quyết định Đối với những cây có nhiễm sắc thể đơn bội thì kiểu hình sẽ phản ánh trung thực kiểu gen Dựa vào đặc điểm này người ta có thể nhận biết dễ dàng các đột biến lặn của giống đang nghiên cứu Vì vậy cây đơn bội là vật liệu lý tưởng trong công tác chọn giống cây trồng

Trong cơ thể thực vật, chỉ có hạt phấn và noãn là những tế bào đơn bội (1n) Từ năm 1924 Blakeslee và cộng sự đã chứng minh được rằng: Hoàn toàn có thể thu được những dòng đồng hợp tử nhị bội thuần bằng cách nhị bội hoá cơ thể đơn bội

Năm 1968, Mizenkes oono (Nhật Bản) đã thành công trong việc tạo cây lưỡng bội đồng hợp tử tuyệt đối từ cây đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa Hiện nay đã có 65 loại cây trồng được tạo ra bằng con đường đơn bội

Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro bằng cách kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây thông qua nuôi cấy bao phấn đã tạo ra hàng loạt cây đơn bội một cách nhanh chóng Đây là thành tựu vô cùng to lớn, mở ra một hướng đi mới trong lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào công tác chọn giống cây trồng, có thể rút ngắn thời gian tạo giống từ 5 đến 7 năm

1.5.2 Kỹ thuật đơn bội trong công tác chọn tạo giống cây trồng 1.5.2.1 Tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1

Giá trị của cây đơn bội trong công tác chọn tạo giống đã được phát hiện từ lâu Tuy nhiên, các cây đơn bội xuất hiện ngẫu nhiên với tần số rất thấp không thể đáp ứng nhu cầu của nghiên cứu và chọn tạo giống [16]

Năm 1964, lần đầu tiên trên Thế giới, 2 nhà khoa học ấn Độ Guha và Maheshwari thành công trong việc tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn invitro cây cà Datura innoxia Ngay sau đó, cây đơn bội đã được tạo ra bằng nuôi cấy bao phấn ở hàng loạt cây trồng khác nhau Ngoài nuôi cấy bao phấn

các nhà khoa học còn thành công rất lớn trong nuôi cấy noãn chưa thụ tinh, nuôi cấy hạt phấn tách rời Kỹ thuật này tạo ra nhanh chóng hàng loạt cây đơn bội, phục vụ đắc lực cho công tác chọn tạo giống cây trồng

Hai phương pháp nghiên cứu cây đơn bội hiện nay là :

- Nuôi cấy bao phấn hay tiểu bào tử tách rời, còn gọi là phương pháp trinh sinh đực trong ống nghiệm

- Nuôi cấy tế bào trứng chưa thụ tinh, còn gọi là phương pháp trinh sinh cái trong ống nghiệm

Tại Trung Quốc, công nghệ đơn bội đã được triển khai trên quy mô rộng lớn và có định hướng chiến lược rõ ràng trong tạo giống mới Hơn một nghìn cơ sở nuôi cấy bao phấn đã hoạt động trên toàn quốc từ những năm 1970 kết quả đã tạo được trên 100 giống lúa mới trong một thời gian ngắn

Tại Triều Tiên, kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã tạo ra 42 giống lúa mới (Sasson, 1993; Jain, 1997)

Ưu thế của các phương pháp này là tất cả các cây tạo thành đều có nguồn gốc từ tiểu bào tử hoặc đại bào tử, vì vậy con nhân được sẽ là cây đơn bội hoặc nhị bội đồng hợp tử tuyệt đối với các cặp nhiễm sắc thể hoàn toàn giống nhau (trừ trường hợp đột biến) [16]

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời trên môi trường tổng hợp đã được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau Phương pháp tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1 không những rút ngắn thời gian trong tạo giống mà còn đơn giản hoá quá trình chọn giống

* Ta có sơ đồ tạo cây từ hạt phấn con lai F1 như sau:

Theo sơ đồ trên bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn sẽ nhận được 4

kiểu gen đồng hợp khác nhau, trong đó xác suất xuất hiện kiểu gen AABB là 1/4 Trong khi đó xác suất xuất hiện kiểu gen AABB bằng phương pháp chọn lọc thông thường là 1/16 Mặt khác nhà chọn tạo giống sẽ rất khó khăn để phân biệt được các cây đồng hợp (AABB ) với các cây dị hợp (AABb, AaBb) vì chúng đều giống nhau về kiểu hình Do đó bắt buộc phải chọn ở các thế hệ tiếp theo Ngược lại, bằng phương pháp tạo cây từ hạt phấn có thể dễ dàng phân biệt được các kiểu gen khác nhau vì chúng ở trạng thái đồng hợp, khi đó các kiểu hình được biểu hiện rõ rệt Như vậy bằng phương pháp này có thể rút ngắn thời gian và đơn giản hóa qua trình chọn tạo giống [16]

1.5.2.2 Ứng dụng kỹ thuật đơn bội trong chọn tạo giống mới và dòng thuần ở cây lúa

Nhờ kỹ thuật nuôi cấy bao phấn có thể rút ngắn thời gian chọn giống mới xuống từ 4 đến 6 thế hệ và tạo ra hàng loạt các dòng thuần mới Thành tựu nuôi cấy mô hứa hẹn nhiều triển vọng đối với chọn tạo giống lúa là tái sinh cây lúa từ nuôi cấy hạt phấn tách rời ở cả 2 dạng lúa nước Japonica và Indica do Raina và Irfan công bố năm 1998 Trên 500 phôi đã được tái sinh từ

Cây mẹ AAbb x aaBB Cây bố

Kiểu gen của cây F1 : AaBb Kiểu gen của hạt phấn :

AB Ab aB ab

Kiểu gen của cây đơn bội tái sinh từ hạt phấn:

AB Ab aB ab

Kiểu gen của cây nhị bội hoá có nguồn gốc hạt phấn:

AABB AAbb aaBB aabb

80.000 hạt phấn nuôi cấy trong đĩa petri đương kính 3.5 cm Rất nhiều cây đã được tái sinh từ hạt phấn Theo lý thuyết, một cặp lúa lai F1 có thể tạo ra 4.096 kiểu gen đồng hợp khác nhau tái sinh từ hạt phấn invitro (Đỗ Năng Vịnh và Phan Khải, 1996)

Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn tách rời hứa hẹn có thể tạo ra vô số những nguồn gen quý giá cho chọn giống [16]

Ở nước ta, công nghệ đơn bội được áp dụng với 2 mục tiêu chính sau: - Cố định ưu thế lai thông qua việc rút ngắn thời gian tạo giống thuần chủng bằng nuôi cấy bao phấn của con lai F1

-Tạo dòng thuần có những đặc tính thích nghi với thụ phấn chéo và mang gen kết hợp rộng

Hiện nay công nghệ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tách rời được sử dụng phổ biến với các mục đích sau:

- Cố định ưu thế lai và các gen hữu ích

Thông qua kỹ thuật nuôi cấy bao phấn người ta có thể cố định ưu thế lai và các gen hữu ích từ con lai F1 có ưu thế lai cao, làm tăng năng suất lúa (M.S, Swaminathan, 1995; Chen và c.s, 1978; Narayanan và c.s, 1996) Nuôi cấy bao phấn lúa lai Indica/Indica đã thu được các dòng có năng suất cao hơn bố mẹ và bằng 93.2% so với con lai F1 (Batachandran và c.s, 1994)

- Tạo các dòng bất dục đực mới và các dòng mang gen kết hợp rộng cho tạo giống lúa lai

Để tạo các dòng bất dục đực mới và các dòng có tiềm năng và rút ngắn quá trình tạo giống, người ta kết hợp lai, lai xa với nuôi cấy bao phấn Kết quả của quá trình này cho thấy kỹ thuật nuôi cấy bao phấn của con lai Japonica/Indica là con đường nhanh và có hiệu quả để phát triển các dòng phục hồi mang gen kết hợp rộng trong chọn tạo giống lúa lai (Yan J.Q, c.s, 1996; Virmani, 1996)

Để tạo các dòng bất dục đực nhân với các nền di truyền khác nhau, nuôi cấy bao phấn con lai F1 mang gen bất dục đực nhân sẽ cho phép tạo ra các dòng thuần bất dục đực nhân chỉ sau một lần nuôi cấy bao phấn (Nin Jin c.s,1997; Q.R.Chu c.s, 1998)

- Lai xa kết hợp với nuôi cấy mô tế bào trong chọn tạo các dòng kháng sâu bệnh và các điều kiện bất thuận của môi trường

Người ta đã tạo ra các con lai khác loài để chuyển các gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng Tuy nhiên, khi lai gặp phải khó khăn là tính không tương hợp và để khắc phục hiện tượng này người ta đã áp dụng phương pháp cứu phôi và nuôi cấy bao phấn Phương pháp này cho phép ta có thể chuyển những gen kháng từ cây dại vào cây trồng để cải thiện nguồn gen của cây trồng

- Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy để chọn tạo ra các giống lúa hạt dài chất lượng cao

Tại trường Đại học tổng hợp Lossiana (Mỹ), người ta đã xây dựng chiến lược chọn giống lúa hạt dài cho miền Nam nước Mỹ bằng nuôi cấy bao phấn lúa Các giống lúa hạt dài có khả năng tái sinh yếu, tỷ lệ 0.5% Bằng tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, hàng năm họ đã tạo ra đựoc hơn 8.000 dòng thuần đơn bội kép bằng nuôi cấy bao phấn của con lai F1 hạt dài Mục tiêu là chọn ra các giống lúa hạt dài có giá trị thương mại cao [16]

Các bước chọn giống có thể tiến hành theo trình tự như sau:

- Lai giống có đặc tính nông học và chất lượng ưu việt với giống mang gen kháng để tạo ra con lai F1

- Nuôi cấy bao phấn con lai F1 tạo ra dòng thuần với những đặc tính khác nhau

- Sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử để chọn những dòng thuần mang gen kháng bệnh

- Khảo nghiệm những dòng thuần chọn lọc trong những điều kiện sản xuất khác nhau để chọn giống tốt, kháng bệnh

CHƯƠNG II

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu

- Vật liệu nuôi cấy invitro là bao phấn của một số dòng lúa lai F1 thuộc các tổ hợp lai: KimA/R278, KimA/ R17

- Vật liệu thí nghiệm ở vụ mùa 2008 tại đồng ruộng gồm 20 dòng lúa, Đó là các dòng: TN49, TN50, TN53, TN57, TN64, TN65, TN68, TN70, TN71, TN72, TN73, TN76, TN81, TN83, TN84, TN85, TN87, TN91, TN93, TN97

Để tiện trong việc so sánh, thí nghiệm bố trí thêm giống Khang Dân (giống số 21) Trong đó, Khang Dân được sử dụng làm vật liệu thí nghiệm như một dòng lúa để có thể tiến hành so sánh Duncan (so sánh cặp nhóm không có đối chứng)

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 2.1.2.1 Điều kiện nghiên cứu

Phòng thí nghiệm nuôi cấy bao phấn lúa được duy trì trong điều kiện : - Số giờ chiếu sáng trong ngày: 8 - 10 h/ngày

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 18 - 250C - Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux - Ẩm độ: 80 - 90%

Thí nghiệm thuần dưỡng cây tái sinh được bố trí trong nhà lưới có mái che, nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng phụ thuộc vào môi trường

Thí nghiệm đánh giá các đặc điểm nông sinh học của các dòng thuần đồng hợp tử được bố trí ngoài đồng ruộng, chịu ảnh hưởng của môi trường tự nhiên

2.1.2.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 1/ Địa điểm

Các thí nghiệm nghiên cứu được bố trí tại hai điểm:

- Phần nuôi cấy bao phấn được tiến hành tại phòng thí nghiệm «Công nghệ tế bào thực vật » Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Phần đánh giá ở đồng ruộng được tiến hành tại Trung tâm thực hành thực nghiệm của Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

2/ Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 4 năm 2007 đến tháng 10 năm 2008

3/ Giới hạn nội dung nghiên cứu

- Các nghiên cứu tạo dòng thuần được tiến hành trong phòng thí nghiệm ở các giai đoạn : Vệ sinh đòng lúa và xử lý lạnh, khử trùng hoa lúa, tạo callus, tái sinh chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

- Giai đoạn ở nhà lưới : tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường thuần dưỡng đến sinh trưởng của cây lúa

- Giai đoạn ngoài đồng ruộng : Tiến hành đánh giá sơ bộ khả năng sinh trưởng của các dòng lúa thông qua các chỉ tiêu : Năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất, thời gian sinh trưởng, thời gian đẻ nhánh, khả năng chống đổ, khả năng kháng sâu bệnh

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nội dung nghiên cứu

2.2.1.1 Nội dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

1/ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến tỷ lệ sống của bao phấn lúa

2/ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cấy

3/ Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS và môi trường N6 đến khả năng tạo callus của mẫu cấy

4/ Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất 2,4 D ; NAA đến khả năng tạo callus của mẫu cấy

5/ Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất Kinetin, BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

6/ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất NAA đến khả năng ra rễ từ chồi xanh 7/ Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường thuần dưỡng đến khả năng sinh trưởng của cây

2.2.1.2 Nội dung nghiên cứu ở đồng ruộng

Sơ bộ đánh giá một số đặc điểm sinh trưởng, chống chịu, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của 20 dòng lúa được tạo từ nuôi cấy bao phấn

ở vụ mùa 2008 thông qua các chỉ tiêu:

- Thời gian đẻ nhánh, thời gian trỗ, thời gian chín sinh lý, Tổng thời gian sinh trưởng

- Khả năng chống chịu sâu đục thân, sâu cuốn lá, bệnh khô vằn, bệnh bạc lá

- Khả năng chống đổ

- Số bông/m2 , Số hạt chắc/ bông, P1000 hạt, Năng suất thực thu

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

1/ Quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa:

Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo Quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa của Viện nghiên cứu cây lương thực và thực phẩm (Hải Dương)

2/ Các thí nghiệm nghiên cứu

Các thí nghiệm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh đến

khả năng tạo mô sẹo (callus) của mẫu cấy

Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ 50 mẫu Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm

Môi trường nuôi cấy:

N6 + (1,5 mg 2,4D + 60g đường + 100mg inostol/lit môi trường)

Tiến hành vệ sinh đòng sạch sẽ bằng nước sạch rồi khử trùng bằng cồn 750 sau đó gói lại bằng giấy thấm và giấy bạc và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 8 – 100C trong những khoảng thời gian khác nhau

- CT1: không xử lý lạnh - CT2: xử lý lạnh 1 ngày - CT3: xử lý lạnh 3 ngày - CT4: xử lý lạnh 5 ngày - CT5: xử lý lạnh 7 ngày - CT6: xử lý lạnh 10 ngày

Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trường, bắt đầu theo dõi mẫu cấy

Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo callus (mô sẹo) và tỷ lệ mẫu chết

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng

hypocloratnatri đến tỷ lệ sống của mẫu cấy

Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ cấy 50 mẫu (bao phấn)

Tiến hành bóc bao lá đòng, ngâm hoa lúa trong chất khử trùng hypocloratnatri ở nồng độ khác nhau với thời gian 20 phút Sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 5 lần

- CT1 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 0,5 % nguyên chất - CT 2: Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 1,0 % nguyên chất - CT 3 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 1,5 % nguyên chất - CT 4 : Xử lý mẫu bằng hypocloratnatri nồng độ 2,0 % nguyên chất

Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trường bắt đầu theo dõi mẫu Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống

* Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường MS và môi

trường N6 đến khả năng tạo mô sẹo (callus)

Thí nghiệm gồm 2 công thức, mỗi công thức làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 20 lọ, mỗi lọ cấy 100 mẫu Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm

- CT1: MS + (1,5 mg 2,4D + 30 g đường + 100mg inostol/lit môi trường) - CT2: N6 + (1,5 mg 2,4D + 30 g đường + 100mg inostol/lit môi trường) Sau 30 ngày cấy mẫu vào môi trường, tiến hành theo dõi mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu hình thành mô sẹo và tỷ lệ mẫu chết

* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất 2,4 D đến khả năng

tạo mô sẹo (callus) của mẫu cấy

Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ cấy 50 mẫu Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm

- CT1: Nền + 0 mg 2,4D/lit môi trường - CT2: Nền + 0,5 mg 2,4D/lit môi trường - CT3: Nền + 1,0 mg 2,4D/lit môi trường - CT4: Nền + 1,5 mg 2,4D/lit môi trường - CT5: Nền + 2,0 mg 2,4D/lit môi trường - CT6: Nền + 2,5 mg 2,4D/lit môi trường

Môi trường nền: N6 + (60g đường + 100g inostol + 6,5 g agar/lit môi trường)

Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trường bắt đầu theo dõi mẫu Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (callus), tỷ lệ mẫu chết

* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo mô

sẹo (callus)của mẫu cấy

Thí nghiệm gồm 6 công thức, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 10 lọ, mỗi lọ 50 mẫu Mẫu cấy là những bao phấn không bị nhiễm

- CT1: Nền + 0 mg NAA /lít môi trường - CT2: Nền + 0,5 mg NAA /lít môi trường - CT3: Nền + 1,0 mg NAA/lít môi trường - CT4: Nền + 1,5 mg NAA/lít môi trường - CT5: Nền + 2,0 mg NAA/lít môi trường - CT6: Nền + 2,5 mg NAA /lít môi trường

(Môi trường nền: N6 + 60g Đường + 100g Inostol + 6,5 gam Agar/lit môi trường)

Sau 5 ngày cấy mẫu vào môi trường, bắt đầu theo dõi mẫu Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu ra mô sẹo, tỷ lệ mẫu chết

* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất Kinetin đến khả năng

tái sinh chồi từ mô sẹo (callus)

Thí nghiệm gồm 8 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dõi 5 lọ, mỗi lọ 10 mẫu cấy Mẫu cấy là những callus đạt tiêu chuẩn

- CT1: Nền + 0 mg kinetin/lit môi trường - CT2: Nền + 1,0 mg kinetin/lit môi trường - CT3: Nền + 1,5 mg kinetin/lit môi trường - CT4: Nền + 2,0 mg kinetin/lit môi trường - CT5: Nền + 2,5 mg kinetin/lit môi trường - CT6: Nền + 3,0 mg kinetin/lit môi trường - CT7: Nền + 3,5 mg kinetin/lit môi trường - CT8: Nền + 4,0 mg kinetin/lit môi trường

(Môi trường nền: N6 + 60g đường + 100mg inostol + 6,5 g agar/lit )