Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống lúa

Các giai đoạn chính 1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị

Người ta thường đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng:auxin, xytokinin…các chất bổ sung khác như: nước dừa, dịch. Thông thường, các nhóm chất IAA, NAA, 2,4D được sử dụng nhiều trong quá trình nghiên cứu và sản xuất, tác dụng xúc tiến hình thành rễ từ chồi tái sinh. Cây đã tái sinh hoàn chỉnh (đủ rễ, thân, lá) đƣợc đƣa ra khỏi ống nghiệm, thuần dƣỡng trong các môi trường như đất, môi trường thuần dưỡng lỏng… kết quả của giai đoạn này sẽ quyết định khả năng ứng dụng cây invitro trong các chương trình giống hoặc vào các mục đích khác nhau.

Kỹ thuật đơn bội trong công tác chọn tạo giống cây trồng 1. Tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1

Ưu thế của các phương pháp này là tất cả các cây tạo thành đều có nguồn gốc từ tiểu bào tử hoặc đại bào tử, vì vậy con nhân đƣợc sẽ là cây đơn bội hoặc nhị bội đồng hợp tử tuyệt đối với các cặp nhiễm sắc thể hoàn toàn giống nhau (trừ trường hợp đột biến) [16]. Kết quả của quá trình này cho thấy kỹ thuật nuôi cấy bao phấn của con lai Japonica/Indica là con đường nhanh và có hiệu quả để phát triển các dòng phục hồi mang gen kết hợp rộng trong chọn tạo giống lúa lai (Yan J.Q, c.s, 1996; Virmani, 1996). Để tạo các dòng bất dục đực nhân với các nền di truyền khác nhau, nuôi cấy bao phấn con lai F1 mang gen bất dục đực nhân sẽ cho phép tạo ra các dòng thuần bất dục đực nhân chỉ sau một lần nuôi cấy bao phấn (Nin Jin c.s,1997; Q.R.Chu c.s, 1998).

Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 1 Vật liệu

• Phạm vi nghiên cứu 1. Điều kiện nghiên cứu

- Phần nuụi cấy bao phấn đƣợc tiến hành tại phũng thớ nghiệm ôCụng nghệ tế bào thực vật ằ Bộ mụn Cụng nghệ sinh học, Khoa Nụng học, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. - Phần đánh giá ở đồng ruộng đƣợc tiến hành tại Trung tâm thực hành thực nghiệm của Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên.

Thời gian

• Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1. Nội dung nghiên cứu

* Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất Kinetin đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo (callus). Thí nghiệm gồm 8 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dừi 5 lọ, mỗi lọ 10 mẫu cấy. Mẫu cấy là những callus đạt tiêu chuẩn. Sau 5 ngày cấy mẫu vào mụi trường. bắt đầu theo dừi mẫu tỏi sinh chồi. Cỏc chỉ tiờu theo dừi:. + Tỷ lệ callus hình thành chồi xanh. + Tỷ lệ callus hình thành chồi bạch tạng. + Tỷ lệ callus chết. * Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất BAP đến quá trình tái sinh chồi từ mô sẹo. Thí nghiệm gồm 8 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dừi 5 lọ, mỗi lọ cấy10 mẫu. Mẫu cấy là những callus đạt tiêu chuẩn. Sau 20 ngày cấy mẫu vào mụi trường thỡ theo dừi mẫu tỏi sinh chồi. Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ mẫu tỏi sinh chồi và mẫu chết. * Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ từ chồi của mẫu cấy. Thí nghiệm gồm 6 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 nhắc lại, mỗi lần nhắc lại theo dừi 8 mẫu cấy. Mẫu cấy là những chồi cú kớch thước đồng đều. Chỉ tiờu theo dừi: số lƣợng rễ hỡnh thành, chiều dài rễ. *Thí nghiệm 9 : Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại môi trường thuần dưỡng đến khả năng sinh trưởng của cây. Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức thí nghiệm làm với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại thỡ theo dừi 4 mẫu cấy. Mẫu cấy là những cõy lỳa cú kích thước đồng đều. Sau 20 ngày cấy bắt đầu theo dừi mẫu. Chỉ tiờu theo dừi: tỷ lệ sống, chết, chiều dài rễ, chiều cao cõy, số lỏ, số nhánh. 4/ Đánh giá kết quả nuôi cấy trong phòng thí nghiệm a) Đánh giá kết quả khử trùng. Sè mÉu sèng. Số mẫu chết. b) Đánh giá khả năng ra mô sẹo. Số mẫu tạo mô sẹo. c) Đánh giá khả năng tạo chồi. * Thí nghiệm 10: Đánh giá sơ bộ khả năng sinh trưởng phát triển trên đồng ruộng của cõy lỳa nuụi cấy từ bao phấn thụng qua theo dừi một số tiờu chí nông sinh học trong quá trình thí nghiệm. * Khả năng chống đổ: Theo dừi bằng phương phỏp đỏnh giỏ trực quan ở giai đoạn sinh trưởng của cây lúa từ giai đoạn vào chắc – chín sau đó đánh giá theo các thang điểm của IRRI.

Kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Thời gian xử lý lạnh dài quá cũng làm giảm tỷ lệ tạo callus của bao phấn trong môi trường nuôi cấy: Khi tăng thời gian xử lý lạnh lên 10 ngày thì tỷ lệ mô sẹo hình thành bắt đầu giảm so với xử lý lạnh 7 ngày. Để xác định nồng độ chất khử trùng thích hợp nhất, cho tỷ lệ sống cao nhất, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm xử lý mẫu trong dung dịch Hypocloratnatri ở các nồng độ khác nhau trong thời gian 25 phút trước khi đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy. Qua xử lý thống kê có thể kết luận: Nếu xử lý chất khử trùng Hypocloratnatri ở nồng độ 1% trong thời gian 25 phút thì tỷ lệ mẫu sống cao nhất và tỷ lệ mẫu chết thấp nhất.

Chúng tôi đã làm các thí nghiệm với 2 tổ hợp : KimA/R278, và KimA/R17 để xác định mức ảnh hưởng của từng loại môi trường đến khả năng tạo thành callus từ bao phấn lúa. Để xác định ảnh hưởng của nồng độ auxin 2,4D đến khả năng tạo callus của bao phấn lúa, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm bổ sung các chất này với các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Qua nghiên cứu, đánh giá, chúng tôi thấy rằng: Trong mỗi tổ hợp nghiên cứu, các công thức thí nghiệm khác nhau có tỷ lệ bao phấn tạo callus khác nhau.

Như vậy, Công thức 4 với nồng độ 2,4D là 1,5mg/l môi trường thích hợp nhất cho quá trình hình thành mô sẹo (callus) của bao phấn lúa, cho tỷ lệ tạo callus cao nhất và tỷ lệ chết thấp nhất. Biểu đồ 3.6(a): Ảnh hưởng của nồng độ chất Kinetin đến tỷ lệ tạo thành chồi xanh, chồi bạch tạng và tỷ lệ chết ở các công thức của tổ hợp KimA/R278. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9: Trong các loại môi trường thử nghiệm, tỷ lệ sống của 3 loại môi trường là nước cất, MS và Yoshida đạt giá trị tuyệt đối (100 %) và cùng trong nhóm có tỷ lệ cao nhất.

Nhƣ vậy, sau khi thí nghiệm với các tổ hợp lai khác nhau, với kết quả thu được, chúng tôi có thể kết luận: Trong môi trường Đất, cây lúa thuần dưỡng có số đo về chiều cao cây lớn nhất. Kết quả đánh giá về thời gian sinh trưởng và các giai đoạn sinh trưởng của các dòng lúa tạo ra từ nuôi cấy bao phấn trong vụ mùa năm 2008 đƣợc tổng kết ở bảng 3.10. Chỉ tiêu sâu hại và tính chống đổ (đơn vị tính: điểm) Sâu đục. Sâu cuốn lá nhỏ. Bệnh khô vằn. Bệnh bạc lá. Khả năng chống đổ. * Khả năng chống chịu sâu bệnh của các dòng lúa. Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng lúa nhiễm sâu bệnh ở các mức độ khác nhau:. a) Sâu đục thân: các dòng lúa thí nghiệm bị hại ở mức từ 1 đến 3 theo thang điểm IRRI.