Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh tswv (Tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật elisa và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật rt - pcr

Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh tswv (Tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật elisa và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật rt - pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN

CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI

HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌCNiên khoá: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN

CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI

HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005

Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình dạy bảo, dìu dắt em trong suốt quãng đường sinh viên

Cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 đã luôn bên cạnh mình, đóng góp, động viên mình trong học tập cũng như trong cuộc sống

TP HCM, Tháng 9 năm 2005 Nguyễn Thị Thùy Dương

TÓM TẮT

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG, Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005 “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU

ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP”

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Bùi Cách Tuyến

Đề tài được tiến hành tại hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 Nội dung thực hiện:

- Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra

- Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm vòng ở hai tỉnh này

- Thiết lập quy trình RT-PCR để phát hiện PRSV với đối tượng thí nghiệm là các mẫu dương tính thu được từ phương pháp ELISA

Kết quả đạt được theo phương pháp DAS ELISA - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng ở các địa điểm

- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo từng giống cây

- Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi cây

4 - 5 tháng (chưa trái) 70,00 % 6 - 8 tháng 85,71 % 8 - 11 tháng 12,50 % Trên 1năm 36,11 %

Xã Mỹ Hiệp 92,68 % Xã Bình Thạnh 77,42 % Xã Phú Tân 47,37 % Xã Phú Lộc 47,37 % Xã Phú An 16,00 %

Da bông (Db) 86,54 % Mã Lai (Ml) 80,00 % Địa phương (Đp) 34,92 %

Kết quả đạt được theo phương pháp RT-PCR

- Cặp mồi 1 không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein của PRSV-P song vẫn khuếch đại được sản phẩm mong muốn

- Cặp mồi P4-M30 và P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein của PRSV-P Kết quả giải trình tự một số mẫu

- Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu được đoạn có kích thước 619 bp

- Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu được đoạn có kích thước 410 bp

- Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu được đoạn có kích thước 412 bp

So sánh các trình tự vừa giả được với trình tự coat protein và genome của PRSV-P trên Genebank, thấy có sự tương đồng khá cao Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14-M31 và P7-M30 đúng là đợc khuếch đậi từ gen coat protein của PRSV-P

Như vậy, đã xây dựng được quy trình chẩn đoán PRSV trên cây đu đủ bằng phương pháp RT-PCR với các cặp mồi P14-M31 hay P7-M30

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L ) 3

2.1.1 Phân loại học 3

2.1.2 Nguồn gốc, phân bố 4

2.1.3 Đặc điểm thực vật học 4

2.1.4 Nhu cầu sinh thái 5

2.1.5 Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ 6

2.1.5.1 Giá trị dinh dƣỡng 6

2.1.5.2 Ứng dụng thực tiễn 7

2.1.6 Tình hình sản xuất 8

2.1.7 Sâu bệnh 9

2.1.7.1 Các loài côn trùng gây hại chính 10

2.1.7.2 Các bệnh phổ biến trên đu đủ 10

2.2 Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ 11

2.2.1 Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật 11

2.2.2 Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) 15

2.2.3 Những phương pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV 20

2.2.3.1 Phương pháp quan sát triệu chứng 20

2.2.3.2 Phương pháp cây chỉ thị 20

2.2.3.3 Phương pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử 21

2.2.3.4 Phương pháp huyết thanh học 21

2.2.3.5 Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử 22

2.2.3.6 Các phương pháp khác 22

2.2.4 Sơ lược về phương pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay 22 2.2.5 Sơ lược về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) 24

PHẦN III 27

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

3.2 Phương pháp lấy mẫu 27

3.3 Phương pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease) 28

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

4.1 Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu 39

4.2 Kết quả thu được từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA 40

4.2.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra 40

4.2.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây 42

4.2.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây 43

4.3 Kết quả thí nghiệm PCR 44

4.4 Kết quả giải trình tự một số mẫu 53

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EtBt: Ethidium bromide

FDA: Food and Drug Administration

MMLV: Moloney murine leukemia virus

mRNA: Messenger RNA OD: Optical density

PCR: Polymerase chain reaction p-NPP: p- nitrophenyl phosphate

PRSV: Papaya ringspot virus

PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20 RNA: Ribonucleic acid

RNase: Ribonuclease

RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Ta: Annealing temperature

Tm: Melting temperature UV: Ultra violet

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây đu đủ 3

Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus 12

Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây 16

Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá 17

Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) 18

Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả 18

Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải) 19

Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA 24

Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn 44

b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 44

Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 45

Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 46

Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 47

Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên 50

Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 51

Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 52

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ 6

Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (Trần Thế Tục, 1998) 9

Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm 28

Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra 40

Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây 42

Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây 43

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra 41 Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây 42 Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây 43

PHẦN I

GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Tính cấp thiết của đề tài

Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại trái cây giàu dinh dưỡng và đang có giá trị

kinh tế hiện nay

Trái chín có hàm lượng dinh dưỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nước, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lượng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng như: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg) Đặc biệt, đu đủ cung cấp lượng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998) Hơn nữa, lá đu đủ có thể sử dụng làm mềm thịt hay làm giảm độ đục trong quy trình sản xuất bia Ngoài ra, đu đủ còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác như: ly trích papain, sử dụng làm rau (đối với trái chưa chín), hoặc để diệt khuẩn

Trên thế giới, vùng trồng và xuất khẩu đu đủ nổi tiếng là Hawaii, đồng thời nó cũng là nơi sản xuất đu đủ lớn nhất ở Mỹ, cung cấp 60 % số quả tươi cho Mỹ và Nhật Bản

Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do papaya ringspot virus (PRSV)

(Gonsalves, 1998) Đây là virus gây thiệt hại hàng đầu đối với canh tác đu đủ Không chỉ ở Hawaii, Philippine - một quốc gia nổi tiếng về sản xuất đu đủ - cũng bị thiệt hại rất lớn bởi loài virus này Chẳng hạn, năm 1984, 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite đã bị tàn phá, làm thiệt hại 300.000 USD (Opina, 1986)

Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kì phương thức nào mà chỉ có thể khắc phục bằng cách phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát được triệu chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thường không chính xác

Thiệt hại đáng kể do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nước có nền sản xuất đu đủ lớn như Mỹ, Brazil, Philippine, Cuba… mà còn

đối với các nước nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam - tiềm năng khí hậu, đất đai rất phù hợp cho việc phát triển sản xuất đu đủ

Cùng với sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay đã giúp ta có thể chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh virus Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi

xin thực hiện với nội dung “Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát

hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh

Đồng Nai và Đồng Tháp” 1.2 Mục đích

- Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và Đồng Tháp

- Chẩn đoán nhanh và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kit ELISA

- Xây dựng quy trình RT-PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ - Phân tích trình tự gene của một số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam với các chủng khác trên thế giới

1.3 Yêu cầu

- Đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu thu thập được - Xây dựng quy trình RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu lá đu đủ (Carica papaya L.) được lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp

- Phạm vi nghiên cứu

Chẩn đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phương pháp DAS-ELISA Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập được thông qua sử dụng kĩ thuật RT-PCR

Hình 2.1 Cây đu đủ

(Semillas del Caribe, 2003)

PHẦN II

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây đu đủ (Carica papaya L )

2.1.1 Phân loại học

- Tên khoa học: Carica papaya L

- Họ: Caricaceae (hay Papayaceae- họ đu đủ)

Đu đủ do có nhiều đặc tính ưu việt như cây thân thảo nên tiết kiệm được diện tích trồng trọt, tận dụng được những khoảng không gian trống trên đồng ruộng, vườn nhà… lại mau cho trái (khoảng từ 6 - 7 tháng) nên cây được trồng rất phổ biến ở khắp nơi trên thế giới dù đây là một loại cây khá nhạy cảm với các tác nhân gây hại trong tự nhiên Sản phẩm thu hoạch được sử dụng để ăn hoặc làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp như thực phẩm, dược, thuộc da

Ở một số nơi trên thế giới, đặc biệt là ở Australia và một vài đảo ở phía đông Ấn

Độ, cây đu đủ được biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw Bên cạnh tên papaya

rất phổ biến thì ở Nam Á và Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi như

kapaya, kepaya, lapaya hay tapaya

Ở Pháp, trái đu đủ được gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi được gọi theo tên nội địa là figuier des Iles

Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ được gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn cây đu đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc

vào từng nước

Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao

Ở Châu Âu, khi được phát hiện lần đầu tiên nó được đặt cho tên địa phương là “tree

melon” (James A Duke, 1983)

2.1.2 Nguồn gốc, phân bố

Mặc dù hiện nay vẫn chưa xác định chính xác nguồn gốc, xuất xứ nhưng cây đu đủ được đa số các nhà nghiên cứu khẳng định là bắt nguồn từ Châu Mỹ nhiệt đới, có thể là từ miền Nam Mexico và một số vùng lân cận của Trung Mỹ (Gonsalves, 1998) Hiện nay, người ta vẫn chưa tìm thấy một dạng cây nào gần gũi với những giống hiện có mà ở trạng thái hoang dại do cây đu đủ là cây có khả năng giao phấn rất lớn và thường nhân giống bằng hạt nên khả năng bị biến đổi di truyền là rất dễ dàng

Các tài liệu nghiên cứu đã ghi lại rằng, trước năm 1525, hạt đu đủ lần đầu tiên thu thập được là từ Panama, sau đó là ở Dominican Republic Từ đó việc trồng trọt đã lan rộng sang khắp các vùng có khí hậu ấm hơn ở miền Nam và Trung Mỹ, miền Nam Mexico, Đông Ấn Độ và Bahamas rồi lan dến Bermuda vào năm 1616 Vào khoảng 1550, người Tây Ban Nha đem các hạt đu đủ từ Philippine về trồng và từ đây đu đủ bắt đầu lan rộng đến Malacca và Ấn Độ Sau đó hạt đu đủ lại được lan truyền từ Ấn Độ sang Naples vào năm 1626

Ở Mỹ, hạt đu đủ được đem đến Florida từ Bahamas Đến 1959, đu đủ được trồng phổ biến ở khắp miền Nam và Trung Florida nhưng chủ yếu là trong các vườn nhà và các trang trại với quy mô nhỏ

Ngày nay, đu đủ phổ biến ở khắp các khu vực nhiệt đới trên thế giới cũng như quần đảo thuộc Thái Bình Dương và ngày càng trở nên thích hợp được với nhiều khu vực và nhiều vùng đất khác nhau

Hầu hết rễ đu đủ là rễ chùm, đâm nhánh ngang mạnh khi gặp điều kiện thuận lợi, phân bố rất nông trên tầng đất 10 - 30 cm và rất rộng Rễ nhỏ, giòn dễ bị tổn thương do cơ giới cũng như do ngập úng hay khô hạn Trong đất, rễ hoạt động rất mạnh do vậy

rất cần oxy, vì vậy chúng rất mẫn cảm khi đất chặt, bí hay ngập nước, đất có độ ẩm cao cũng gây bất lợi cho sự phát triển của rễ

Nằm sát thành phía trong của thịt quả là bó sợi màu trắng, mang các hạt hình trứng, màu đen như hạt tiêu Chiều dài hạt khoảng 5 mm, được phủ bởi bao hạt bằng chất gelatin trong suốt Trái đu đủ mang trung bình khoảng 300 - 500 hạt Khi trái có đủ độ già thường có khoảng 60 - 70 % hạt có thể mọc thành cây

2.1.4 Nhu cầu sinh thái Khí hậu

Đu đủ rất nhạy cảm với sự lạnh giá, giới hạn phân bố trong khoảng 32o Nam đến 32o Bắc với nhiệt độ ấm áp khoảng 25oC và lượng mưa 1200 mm/năm Do đó cần lượng mưa phải nhiều hoặc phải được tưới nước đầy đủ nhưng cũng cần phải có sự thoát nước tốt Nếu ngập úng, cây sẽ chết trong vòng 48 giờ Trong điều kiện nhiệt độ thấp khoảng 32o

F (-0,56oC) sẽ gây hại cho cây, nếu cái lạnh cứ kéo dài cây sẽ chết Đu đủ là một cây ưa sáng, thiếu ánh sáng dẫn đến các đốt của thân vươn dài, cuống lá nhỏ, phiến lá mỏng và dễ bị sâu bệnh phá hoại như rệp, virus

Đất đai

Mặc dù ánh sáng là yếu tố cần nhất nhưng bên cạnh đó đất trồng cũng cần giàu hữu cơ và tơi xốp Tuy nhiên nhìn chung đu đủ có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau song đất đó phải giữ nước cũng như thoát nước tốt và có độ thoáng nhất định, có tầng canh tác dày 70 cm, hàm lượng khí trong đất là 4 % pH tối ưu cho cây phát triển là 5,5 - 6,5

2.1.5 Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dưỡng của đu đủ 2.1.5.1 Giá trị dinh dưỡng

Hàm lượng dinh dưỡng có trong các thành phần của cây đu đủ được công bố từ Trung Mỹ và Cuba (James A Duke, 1983)

Bảng 2.1 Giá trị dinh dưỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn được của cây đu đủ

2.1.5.2 Ứng dụng thực tiễn Giá trị thực phẩm

Đu đủ phổ biến nhất là được sử dụng dưới dạng tươi sống Ngoài ra còn có thể sử dụng làm món trái cây trộn, nước sốt trái cây, coctail, thêm vào kem, bánh… Đu đủ chưa chín không bao giờ được ăn do nó chứa rất nhiều nhựa Thậm chí khi được sử dụng làm salad nó cũng cần được bỏ vỏ, hạt, đun sôi đến khi mềm

Trái chín có thể loại bỏ vỏ, hạt, phần thịt cho vào các chai hoặc can chứa để lên men làm rượu trái cây

Ở miền Đông Ấn Độ, lá đu đủ non có thể sử dụng nấu và ăn tương tự như rau bina (rau Spinach)

Các chùm hoa đực được bán sang các nước Indonesia, New Guinea để nấu (có thay nước nấu để loại bỏ vị đắng) và ăn như rau sống Ở Indonesia, hoa đôi khi được sử dụng để làm kẹo

Ở Châu Phi, thân cây còn non có thể được sử dụng để nấu ăn

Sự hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Italy và Somalia đã tìm thấy trong hạt đu đủ có chứa đến 18 acid amine gồm: glutamic acid, arginine, proline, aspatic acid, proline, tyrosine, lysine, aspatic acid, glutamic acid

Ngoài ra còn ly trích được tinh dầu có mùi hương nhẹ từ hạt và tinh dầu này có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hay trong kĩ nghệ công nghiệp

Giá trị thương mại

Nhựa thu được từ thân và trái đu đủ còn xanh chứa 2 loại enzyme phân giải protein là papain và chymopapain Trong đó, chymopapain có số lượng nhiều nhất song papain lại có hoạt lực mạnh gấp đôi

Một công dụng được biết đến nhiều nhất của sản phẩm papain thương mại là xử lý làm mềm thịt, đặc biệt là ở các hộ gia đình Tại các lò mổ, người ta nhận thấy rằng nếu tiêm papain vào gia súc khoảng nửa giờ trước khi mổ sẽ có tác dụng làm thịt mềm hơn bình thường

Ngoài ra, papain còn được sử dụng để làm tinh khiết bia, xử lý len và sợi vải trước khi nhuộm, xử lý da thú trong công nghiệp thuộc da, sử dụng như một chất bổ trợ trong sản xuất cao su, sử dụng xử lý gan cá ngừ trước khi ly trích dầu để thu được lượng vitamin A và D nhiều hơn Mặt khác, nó còn được bổ sung vào kem đánh răng, chất tẩy rửa, mỹ phẩm cũng như là các dược phẩm trị về tiêu hóa Papain

còn có khả năng điều trị những vết loét, hạn chế sự sưng tấy, khả năng phát sốt và hàn dính vết thương sau phẫu thuật

Gần đây, FDA (Cơ quan quản lý lương thực và dược phẩm Hoa Kỳ) đã khẳng định tác dụng của việc tiêm chemopapain vào đĩa sụn xương sống của bệnh nhân để điều trị hoạt động thoái hoá các đĩa sống lưng (FDA Drug Bull 12(3):17-18)

Sử dụng trong dân gian

Trong các bài thuốc dân gian ở miền nhiệt đới, nhựa tươi được bôi lên những vết sưng tấy, trị mụn cóc, đốm tàn nhang và được sử dụng như một bài thuốc trị giun sán

Trái còn xanh, hạt khi tiêu hoá rất có hại, có khả năng gây sẩy thai Tuy nhiên một vài nơi sử dụng chúng như một bài thuốc điều kinh và tẩy giun

Lá, rễ cũng có thể sử dụng làm thuốc tẩy giun Lá khô được sử dụng dưới dạng thuốc hút với công dụng làm dịu đi cơn hen suyễn hoặc sử dụng thay thế cho thuốc lá

Nhựa cây có thể sử dụng trị bệnh vảy nến, trị chứng khó tiêu, sát trùng tại chỗ, sử dụng đắp lên các vết bỏng, vết cháy…

Hoa được dùng trị bệnh vàng da

Công dụng như một liều thuốc kháng sinh: những nghiên cứu tại trường Đại học Nigeria đã phát hiện thấy dịch trích từ quả đu đủ chín, chưa chín và từ hạt đều có hoạt tính chống lại vi khuẩn G+; sử dụng với liều mạnh có thể chống lại cả vi khuẩn G-

Dịch thu từ hạt được ly trích, sản xuất ra aglycone của glucotropaeolin benzyl isothiocyanate (BITC) có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt vi khuẩn, nấm

Ở một bệnh viện tại London vào năm 1977, trong một ca bị nhiễm khuẩn sau phẫu thuật trên một bệnh nhân được thay thận, bệnh nhân này đã được cứu chữa chỉ bằng một mảnh đu đủ đắp lên vết thương và để trong 48 giờ, trong khi đó tất cả các phương thuốc hiện đại lúc bấy giờ đều không hiệu quả

2.1.6 Tình hình sản xuất Trên thế giới

Đối với một vườn cây đu đủ bình thường, một cây có thể cho 2 - 4 trái chín/ tuần trong suốt mùa thu hoạch

Cây khỏe mạnh, nếu được chăm sóc tốt, năng suất trung bình là 34 kg/cây/năm; một số cây cá biệt có thể cho đến 136 kg/cây/năm

Ở Nam Phi, năng suất trung bình vào năm thứ 4 là 100 kg/cây Với mật độ 1000 cây/ha cho năng suất trung bình là 30 tấn

Ở khu vực Hilo của đảo Hawaii, năng suất trung bình là 37 tấn/ha

Với một diện tích là 100 ha, Princess Orchards ở Maui cho 68 kg/tuần trong suốt mùa thu hoạch

Ở khu vực Kapoho của Hawaii, năng suất trung bình là 38000 kg/ha trong năm đầu tiên, 25000 kg/ha vào năm thứ 2

Cây đu đủ cho khoảng 50 % sản lượng papain vào năm đầu tiên, 30 % và năm thứ hai và 20 % vào năm thứ ba Năng suất thu hoạch trung bình 70 - 130 kg/ha

Theo thống kê, năng suất papain thô/ha vào năm đầu tiên là 20 - 25 kg; năm thứ hai là 90 - 100 kg; năm thứ ba là 60 - 90 kg/ha; 30 - 40 kg/ha vào năm thứ tư; 20 hoặc ít hơn vào năm thứ năm Người ta cũng ước lượng rằng 1 kg papain thô tương ứng với khoảng 5 kg nhựa tươi (James A Duke, 1983)

Bảng 2.2 Sản lượng trung bình đu đủ trên thế giới (

*) (Trần Thế Tục, 1998) Năm 1979 - 1981 1991 1992 1993

Đồng thời ở Việt Nam, đu đủ chỉ được trồng với mục đích thu hoạch trái phục vụ cho mục tiêu thực phẩm (ăn tươi, sản xuất nước ép hoa quả, bánh kẹo,…) và cũng chỉ sản xuất với quy mô nhỏ và vừa, phục vụ cho nhu cầu trong nước mà thôi

2.1.7 Sâu bệnh

Theo Nguyễn Thành Hối (1996), các loại sâu bệnh trên đu đủ bao gồm:

2.1.7.1 Các loài côn trùng gây hại chính

a) Rệp sáp (gồm 5 họ Asterolecanniidae

Coccidae Diaspididae Margarodiae

Pseudococcidae) (Nguyễn Mạnh Chinh, 2002)

Thường là loại rệp có màu trắng xám, phát triển nhiều trong mùa nắng Rệp có kích thước 2 - 3 mm, bám sát vào ngọn thân, lá, trái, bông… chích hút nhựa cây, lá làm trái kém phát triển và dễ bị nấm bồ hóng tấn công gây bệnh

b) Rệp dính (rầy mềm- Aphididae)

Đeo bám, chích hút ở trái, đọt non hoặc ở mặt dưới lá

c) Nhện đỏ (rầy lửa-Tetranychus seximaculatus)

Nhện có màu hồng nhạt đến đỏ đậm, rất nhỏ (dưới 1 mm) nên phải quan sát kĩ mới phát hiện được, thường bám ở phía mặt dưới lá và trên trái

Nơi bị chích hút nặng lá bị vàng loang lổ từng đốm nhỏ, sau đó bị cháy đi Khi bị nặng lá có thể bị cháy hoàn toàn

d) Ruồi đục trái (Toxotrypana curvicauda)

Thường chỉ gây hại nặng khi trái để chín cây Ruồi đục vào trái để đẻ trứng, giòi nở ra sẽ gây thối trái

2.1.7.2 Các bệnh phổ biến trên đu đủ (Nguyễn Thành Hối (1996), Nguyễn

Văn Thành (1997))

a) Bệnh thối gốc ( do nấm Pythium spp)

Bệnh chủ yếu do loài Pythium aphanidermatum gây ra Nấm bệnh tồn lưu trong

xác bã cây bệnh có trong đất và sinh sản rất nhiều noãn bào tử để lây lan

Bệnh phát triển mạnh nhất khi trời nóng ẩm Ẩm độ quanh gốc cây càng cao, bệnh phát triển càng mạnh

b) Bệnh đốm lá (do nấm Phyllosticta sulata)

Trên lá, đốm bệnh có hình tròn, hình trứng, thon dài hay có hình dạng bất kì Vùng giữa vết bệnh có màu bạc trắng, viền có màu vàng hay nâu Vùng bệnh khô và mỏng dần rồi rách đi

Mầm bệnh tồn lưu rất lâu trong xác lá cây bệnh và phát tán theo gió để lây lan Do đó nên tiêu hủy xác lá bệnh để tránh lây lan

c) Bệnh cháy lá (do nấm Helminthosporium rostratum)

Phần chóp của các lá bên dưới có các đốm úng nước, lan dần vào bên trong lá làm lá bị nâu và khô đi Nếu nhiễm nặng, cuống lá bị héo, mềm và lá bị rụng

d) Bệnh phấn trắng (do nấm Oidium caricae)

Mặt dưới lá bị đóng phấn màu trắng, nếu nhiễm nặng lá sẽ phát triển kém, có thể bị biến dạng chút ít Trái cũng bị các đốm phấn trắng tròn hay bầu dục và phát triển kém

e) Bệnh khảm (do Papaya mosaic virus)

Bệnh phổ biến và quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới Ở Việt Nam, bệnh gây thiệt hại nặng ở Đồng bằng sông Cửu Long Cây con mới trồng cũng có thể nhiễm bệnh song thường thấy ở cây đã được 1 - 2 năm tuổi

e) Bệnh đốm vòng (do Papaya ringspot virus)

Cùng với bệnh khảm, bệnh đốm vòng cũng khá phổ biến và nghiêm trọng cho đu đủ ở Đồng bằng sông Cửu Long

f) Bệnh do tuyến trùng (Meloidogyne incognita và Rotylenchulus reniformis)

Cả hai loại tuyến trùng đều phá hoại rễ và gây thiệt hại cho đu đủ Cây con nhiễm nặng có thể chết, còn cây trưởng thành có thể giảm sức sinh trưởng

2.2 Sơ lược về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ

2.2.1 Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật Sự phát hiện ra virus hại thực vật

Từ hàng ngàn năm về trước, khi xã hội loài người phát triển còn rất thấp, thiên nhiên và môi trường đang được bảo tồn hầu như giữ nguyên trạng thái hoang sơ ban đầu, con người đã nhận ra sự phá hoại của virus hại thực vật, điều này được thể hiện trong kinh thánh và những văn bia còn lưu lại cho đến ngày nay Tuy nhiên phải đến những năm 1600 - 1660, lịch sử mới ghi chép lại nhóm bệnh này qua những bức họa mô tả triệu chứng bệnh virus trên hoa tulip của các danh họa Tây Âu (mà nay hiện còn được lưu giữ trong các bảo tàng) Sau đó mãi đến cuối thế kỉ XIX, virus hại thực vật mới chính thức được phát hiện với công lao của nhiều nhà khoa học như: Mayer A (1886), Ivanopski D (1892), Baijerinck M (1898), Loeffler và Frosh (1898) Đến đầu

thế kỉ XX, các virus gây bệnh cho thực vật lần lượt được phát hiện như: virus khảm thuốc lá, virus thoái hóa khoai tây… Nhưng mãi tới năm 1939 khi Kaushe Pflankuch và Ryska sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy virus TMV (virus khảm thuốc lá) thì việc nghiên cứu và phát hiện nhóm nguyên nhân gây bệnh này mới phát triển nhanh chóng và thu nhiều thành tựu to lớn Ngày nay, virus học (Virology) là môn khoa học hiện đại, ứng dụng rất nhiều thành tựu của sinh học phân tử

Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus

(Potyvirus, Spring, 2001)

Thiệt hại của bệnh virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999)

- Bệnh virus thực vật gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây trồng chết nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây bị thoái hóa, giảm sức sống, dần dần tàn lụi Tuy nhiên, virus cũng có thể gây nên những thiệt hại nặng nề và nhanh chóng ngay trong các vụ trồng cây hằng năm như virus gây bệnh vàng lụi lúa, xoăn lá cà chua, thoái hóa khoai tây, khảm sọc lá hành tây,…

- Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp Chẳng hạn, hạt lúa bị bệnh vàng lụi thường bị lép không thu hoạch được, hoặc sẽ rất nhỏ, hạt gạo bị đen, ăn có vị đắng

- Bệnh virus còn nguy hiểm ở chỗ: virus kí sinh bắt buộc trong tế bào cây chủ vì vậy virus chỉ bị chết hay mất hoạt tính khi nào tế bào cây bị chết, hủy hoại

Đối với những cây trồng nhân giống vô tính như cam, quýt, khoai tây, khoai lang…

virus là nguy cơ hủy diệt rất lớn Chúng rất khó phát hiện và loại trừ

Đặc tính chung của virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999)

Virus thực vật là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát dưới kính hiển vi điện tử

Virus có cấu tạo rất đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein và acid nucleic Lõi nucleic ở bên trong và được bao bọc bằng một lớp vỏ protein (vỏ capsid) Thường acid nucleic của virus thực vật là RNA và chỉ khoảng hơn 25 loài virus có lõi là DNA Virus gây bệnh cây thường chỉ có một loại protein

Virus kí sinh ở mức độ tế bào Một virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus khác nhau Trong tế bào chủ, nó sẽ điều khiển tế bào chủ dùng vật chất từ chính tế bào chủ để tạo thành nhiều virus mới Cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết

Triệu chứng bệnh virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999)

Việc phân loại triệu chứng bệnh virus hại thực vật có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán, phòng trừ và nghiên cứu bệnh hại Tuy nhiên, sự phân loại triệu chứng bệnh chỉ có tính chất tương đối vì diễn biến bệnh rất phức tạp Virus sau khi xâm nhiễm vào cây trồng và gây ra nhiều triệu chứng khác nhau mà chúng ta có thể quan sát bằng mắt thường, song cũng có nhiều trường hợp không thấy biểu hiện gì khác thường mà người ta gọi là “bệnh ẩn”

Qua nghiên cứu, nhiều nhóm tác giả đã chia triệu chứng bệnh thành các nhóm sau: Khảm lá

Đây là triệu chứng phổ biến nhất với hầu hết các bệnh virus hại cây Virus xâm nhiễm vào lá gây ra hiện tượng lá bị loang lổ, chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng Ví dụ như virus khảm thuốc lá, khảm lá ớt, khảm dưa chuột

Khảm đốm có hình nhẫn

Thường gặp là khảm và tạo ra đốm chết hoại hình nhẫn (đốm vòng) như bệnh đốm hình nhẫn trên đu đủ, cây mận, thuốc lá, hoa cẩm chướng

Triệu chứng hại gân lá

Là hiện tượng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân lá sáng, gân chết, biến dạng,… như virus Y hại thuốc lá, khoai tây

Khảm lá, lùn cây

Đây là hiện tượng khá phổ biến của bệnh virus như khảm lùn cây ngô, vàng lùn cây lúa

Như bệnh đốm héo cà chua, bệnh vàng lùn khoai tây, bệnh virus ở táo, mận

Sự truyền bệnh ở virus thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999)

Virus có cơ chế truyền bệnh rất thụ động do virus là vật kí sinh tuyệt đối ở mức độ tế bào Vì vậy, sự lan truyền của bệnh có những đặc điểm riêng, khác các nhóm vi sinh vật khác

Sự truyền bệnh không nhờ môi giới

- Truyền bệnh qua nhân giống vô tính thực vật: Chẳng hạn truyền qua nuôi cấy mô tế bào; qua hom giống chiết từ cây bị bệnh, qua mắt ghép, cành ghép, chồi ghép, gốc ghép bị nhiễm bệnh Các cây trồng nhân giống vô tính bằng củ như khoai tây, cây cảnh, cũng có nguy cơ truyền nhiễm virus rất lớn

- Truyền bệnh qua hạt giống và phấn hoa: Virus thường truyền qua hạt giống song cũng có khoảng 100 virus lan truyền được qua hạt giống Phần lớn nhóm này là các virus ở những cây họ bầu bí, họ đậu

- Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Thường xảy ra với các bệnh virus có tính chống chịu cao với điều kiện môi trường

Lá cây trồng ở mật độ dày và giao tán có thể lây lan lẫn nhau khi lá cây bệnh cọ sát vào lá cây khỏe Các vết thương gây nên do côn trùng, các động vật khác, máy móc, dụng cụ canh tác, thu hái cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền cơ học, tiếp xúc nhờ giọt dịch

Một số virus có sức chống chịu kém hơn trong điều kiện môi trường thiên nhiên thường vừa lây bằng cơ học tiếp xúc lại vừa lây bằng côn trùng

Sự truyền bệnh nhờ môi giới

- Côn trùng là nhóm môi giới truyền bệnh virus quan trọng nhất Có thể chia các kiểu truyền bệnh qua côn trùng và các động vật thành 3 nhóm virus

+ Nhóm truyền theo kiểu bền vững: Là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn trùng một thời gian dài từ một vài tiếng đến một tuần lễ mới có

khả năng lây bệnh cho cây Ví dụ gây bệnh xoăn lá cà chua (Tomato leafcurl

virus), virus gây bệnh cuốn lá khoai tây (Potato leafrool virus)

+ Nhóm truyền bệnh theo kiểu không bền vững: Gồm những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ một vài phút đến một giờ Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây đến 30 phút chích hút ở cây bệnh sau đó có thể lây lan ngay Điển hình là các virus thuộc nhóm

potyvirus như: virus đốm vòng đu đủ (Papaya ringspot virus), khảm lùn ngô (Maize dwarf mosaic virus)

+ Nhóm truyền bệnh nửa bền vững: Gồm các virus có đặc tính truyền trung

gian giữa hai nhóm trên Điển hình là virus Tungro hại lúa, virus Triteza hại cam

chanh,…

- Nhện thuộc họ tám chân, chúng có mật độ khá cao trên các cây kí chủ nhưng phạm vi kí chủ của nhện hẹp hơn các loài côn trùng khác, có thể truyền được khoảng hơn 9 loài virus gây hại ở thực vật

- Tuyến trùng có thể truyền được khoảng 20 loài virus gây hại cây Các loài tuyến trùng thường truyền những virus không bền vững (non-persistant), một số tuyến trùng có thể giữ virus trong cơ thể chúng trong một thời gian khá dài, một vài

tháng thậm chí cả năm (chẳng hạn tuyến trùng Xiphinema truyền bệnh virus hại

nho)

- Nấm trong quá trình gây bệnh và xâm nhập vào cây khỏe có khả năng mang theo virus gây hại cho cây Đặc biệt là các loài nấm sống dưới đất

- Cây tơ hồng (Cuscuta sp.)- là loài thực vật dại rất phổ biến ở nước ta Đây là

một loài thực vật thượng đẳng kí sinh tạo rễ ăn sâu vào thân các cây sống để hút nhựa Chính vì vậy có khá nhiều loài virus thực vật có thể di chuyển theo thân cây tơ hồng và lây lan từ cây này sang cây khác

2.2.2 Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV)

Tác nhân gây bệnh

Phân loại:

Họ: Potyviridae Giống: Potyvirus

Loài: Papaya ringspot virus

Tên viết tắt: PRSV Dòng: type P Nguồn gốc:

PRSV-p được phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên vào năm 1949 trên cây đu đủ ở Hawaii (Jensen, 1949), sau đó bắt đầu xuất hiện nhiều báo cáo về loài virus này từ khắp các khu vực trồng đu đủ trên thế giới Còn về vùng địa lý đầu tiên xuất hiện loài virus này vẫn chưa được xác định chính xác

Đặc điểm:

Papaya ringspot virus (PRSV)- thuộc nhóm potyvirus Là một virus với acid nhân

là RNA, sợi đơn (ssRNA, positive-strand viruses), xoắn ngoằn ngoèo, kích thước sợi 760 - 800 nm, đường kính 12 nm với bộ gen có kích thước tổng cộng là 12 kb Ở cây bị nhiễm, virus được tìm thấy trong tất cả các phần của cây, chúng tạo nên các thể vùi hình trụ (cylindrical incusions- CI) hoặc vô định hình (amorphous inclusion- AI) trong tế bào chất, không bào của mô cây bị nhiễm Song những tế bào này không chứa các virion, trong khi đó nhựa cây thường chứa rất nhiều virion Mỗi một virion gồm khoảng 5,5 % nucleic acid và 94,5 % protein (Marc Fuchs, 1997)

Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây (Mark A Ross, 2002)

PRSV được chia làm hai dạng PRSV-w và PRSV-p Trong đó, PRSV-p xâm nhiễm và gây hại trên hầu hết các loài đu đủ và cây thuộc họ bầu bí trên thế giới, còn

PRSV-w chỉ xâm nhiễm trên những cây thuộc họ bầu bí, không xâm nhiễm trên cây đu đủ (Gonsalves, 1998 và Tennant et al., 1994) Tuy nhiên, trên thực tế rất ít khi phát hiện thấy PRSV-p trên các cây họ bầu bí trên đồng ruộng mà chỉ có thể thấy trên các cây họ bầu bí trong điều kiện thí nghiệm mà thôi Một vài nghiên cứu đưa ra giả thuyết rằng PRSV-p là một dạng đột biến từ dạng PRSV-w; song những nghiên cứu cụ thể về sự tiến hoá này vẫn chưa được xác định rõ ràng Do theo những khảo sát về trình tự DNA mã hoá protein vỏ (coat protein- CP) của virus ở Australia, trình tự này rất giống nhau giữa hai loài P và W; song loài PRSV-w đã được tìm thấy ít nhất là 20 năm trước khi phát hiện thấy loài PRSV-p

PRSV-p bao gồm một số loài, loài tìm thấy ở Hawaii khác với loài tìm thấy ở Thái Lan hay Florida Do đó, phương pháp khống chế mầm bệnh ở mỗi vùng cũng không giống nhau (Marison F, 2002)

Phân bố địa lý

Phân bố rộng khắp vùng Trung Đông, Nam và Trung Mỹ; Trung Quốc, Pháp, Đức, Ấn Độ, Ý, Mexico, Đài Loan, và đặc biệt là ở Mỹ

Triệu trứng (Vũ Triệu Mân (1999) và Duke J (1983))

Đặc điểm chính của bệnh là làm lùn cây, sản lượng trái bị giảm, lá bị khảm và biến dạng

Ở lá, bệnh thường tạo ra các đốm sáng màu vàng nhạt lúc đầu, lá hơi co và khảm nhẹ Sau dần, vết đốm phát triển thành những đốm hình nhẫn, xuất hiện rất nhiều trên bề mặt lá Ở mặt trên của các lá đọt, vùng mô lá ở giữa gân phụ và gân nhánh bị nhăn phồng Bìa lá non bị uốn cong vào theo mặt dưới lá Bìa lá già thì cuốn lên Khi cây bị bệnh nặng, lá non thường bị mất thùy, chỉ còn cuống, đôi khi cả cuống cũng bị biến dạng, co quắp

Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá

Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) (Mark A Ross, 2002)

Ở quả, lúc đầu vết bệnh là những đốm thâm xanh thẫm, sau đó lớn dần thành các đốm hình nhẫn màu xanh thẫm Vết bệnh thường tập trung ở nửa trên của quả, gần về phía cuống Khi quả già, chính các vết thâm này sẽ thối sâu vào bên trong quả gây hỏng quả

Bệnh còn tạo các sọc dầu, màu xanh trên ngọn thân và cuống lá

Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả (Denis Persley, 2004)

Trái bệnh bị nhạt do virus làm giảm lượng đường trong trái

Cây đu đủ ở bất kì độ tuổi nào cũng đều rất nhạy cảm với virus này, song đối với các cây còn non, khi bị nhiễm sẽ không chết, vẫn sống nhưng còi cọc và không có khả năng cho trái

Đường lây nhiễm (Vũ Triệu Mân, 1999)

PRSV là một loài vi sinh vật sống kí sinh Chúng lây truyền từ cây chủ này sang cây

chủ khác thông qua một vector Đó là hai loài aphids (rầy mềm hay rệp muội), Aphis

gossypii (rệp bông) và Myzus persicae (rệp đào), chúng mang theo virus trên cơ thể và

truyền sang cây khi chúng chích hút cây, và truyền theo phương thức không bền vững

(non-persistant) Trong sự lây truyền bệnh, virus cần sự hiện diện của một protein là AI (amorphous inclusion protein) đóng vai trò như một nhân tố hỗ trợ cho sự lây truyền thông qua côn trùng

Ngoài ra, bệnh còn có thể bị lây truyền từ cây bệnh sang cây lành nếu con người chạm vào cây bệnh rồi sau đó chạm vào cây lành hoặc lây truyền trực tiếp qua các vết thương cơ học Bệnh lây lan nhanh nhất là ở các cây từ 5 - 6 tháng tuổi

Virus không truyền qua hạt của trái bệnh Đồng thời virus không có khả năng tồn tại trong môi trường đất và trong các mô cây đã bị chết

Ở Philippines, đu đủ là loại trái cây xếp thứ 6 trong tổng sản lượng trái cây (Philippines Recommends for Papaya, 1977) Vào 1984, khi PRSV bắt đầu xâm nhiễm vào 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite, đã làm thiệt hại năng suất lên đến 300000 USD Sau đó bệnh lan truyền rất nhanh sang những vùng trồng đu đủ khác ở Cavite và một số tỉnh thuộc phía Nam Tagalog, đặc biệt là ở Laguna và Batangas Tương tự, nền sản xuất đu đủ ở phía nam Luzon, Philippines đã từng là một nền sản xuất mang lại nhiều lợi nhuận cho đến khi có sự bùng nổ của dịch bệnh do PRSV Nó đã làm thiệt hại đến 80 % sản lượng đu đủ nơi này, và hiện nay nó đã lan rộng khắp Luzon, Visayas và một số nơi thuộc Mindanao (Swain, 2001)

Biện pháp phòng trừ tổng hợp

- Cần tìm kiếm, khảo nghiệm cũng như nhập nội các giống đu đủ kháng bệnh - Tạo nguồn cây con sạch bệnh trong vườn ươm, cách ly chống rệp

- Sử dụng các biện pháp hóa học để diệt côn trùng truyền bệnh nhất là đối với rệp

bông (Aphis gossypii) và rệp đào (Myzus persicae)

- Thực hiện chọn lọc, vệ sinh đồng ruộng thường xuyên để loại bỏ cây bệnh, bảo vệ cây đu đủ tới 12 tháng tuổi, sau đó thu hoạch chậm nhất tới 18 tháng tuổi thì chặt bỏ để xây dựng vườn mới

2.2.3 Những phương pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV (Vũ Triệu Mân, 2003) 2.2.3.1 Phương pháp quan sát triệu chứng

Dựa trên những mô tả sẵn có về các dạng bệnh virus để phân biệt bệnh virus thực vật với các triệu chứng do viroid, mycoplasma, tuyến trùng, bệnh không truyền nhiễm (do môi trường không thuận lợi) gây ra

Triệu chứng bệnh virus bao gồm hai nhóm chính là: Nhiễm hệ thống (còn gọi là nhiễm toàn cây) và nhiễm bộ phận (còn gọi là chết hoại cục bộ) Nhóm nhiễm hệ thống thường tạo hiện tượng khảm lá (mosaic), còn nhóm nhiễm bộ phận thường tạo vết chết cục bộ (nécrotic local lésion) Một điều cần chú ý là bệnh virus thường có hiện tượng mất triệu chứng (latent periode) Hiện tượng này đôi lúc gây ra sự nhầm lẫn giữa cây bệnh và cây khỏe

2.2.3.2 Phương pháp cây chỉ thị

Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây kí chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh Đây là một

phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật

Cây chỉ thị cũng được chia làm hai nhóm: Cây nhiễm bệnh cục bộ (tạo ra các vết chết trên lá, thân…) và cây nhiễm bệnh hệ thống ( thường tạo ra triệu chứng toàn thân như khảm lá, biến vàng, lùn cây…)

2.2.3.3 Phương pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử

Trong tế bào kí chủ, virus thường tạo thành các dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trưng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau Các tinh thể này không phải lúc nào cũng có thể quan sát thấy, song ta có thể nhuộm màu rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học thông thường với độ phóng đại 80 lần

- Phương pháp đơn giản là sử dụng dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã được làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử Đây là phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất

- Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trường hợp nghi ngờ mẫu lẫn virus khác Phương pháp này giúp ta xác định hai virus là khác nhau trong một mẫu Phương pháp này được gọi là IEM method

- Người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu được cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong mẫu được cắt

2.2.3.4 Phương pháp huyết thanh học

Là phương pháp sử dụng rộng rãi, đặc hiệu và nhanh chóng để chẩn đoán virus thực vật

Ba phương pháp chính thử huyết thanh

- Phương pháp kết tủa: Dựa trên cơ sở hỗn hợp virus và kháng huyết thanh, tạo sự kết tủa trong dung dịch hay trong gel

- Phương pháp liên kết: Trong phương pháp này virus tiểu thể hoặc kháng thể cho hấp thụ Phản ứng dương gây nên các tiểu thể lớn liên kết thành khối với nhau, tăng phản ứng virus-kháng thể

- Liên kết miễn dịch men

+ ELISA: Thử nghiệm ELISA có nhiều dạng, tuy nhiên tất cả đều liên quan đến đĩa nhựa nhiều lỗ đã được xử lý đặc biệt, do đó bề mặt đĩa sẽ liên kết được với protein (virus hoặc kháng thể) Do tính đặc hiệu, kháng thể sẽ bắt các kháng nguyên đặc hiệu Kế tiếp cho chất nền thích hợp vào thì màu sắc sẽ biến đổi nơi có kháng thể gắn với enzyme được giữ lại trên đĩa, nghĩa là có virus bệnh cần chẩn đoán

+ DIBA hoặc FIPSA: Phân tích miễn dịch điểm giống như ELISA, nhưng mẫu dịch cây được đưa vào từng điểm trực tiếp trong màng nitrocellμlose hoặc nylon Màng này liên kết tất cả protein bao gồm cả virus Sau đó, sự có mặt của virus được xác định bằng kháng huyết thanh có gắn với enzyme

2.2.3.5 Phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử

Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, từ năm 1980 các phương pháp sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chẩn đoán, phát hiện và nghiên cứu bản chất virus gây bệnh như phương pháp DNA probe, hybridation, PCR Nhờ các phương pháp này chỉ cần với một lượng nhỏ DNA hay RNA thu từ cây chủ, ta có thể khuếch đại chúng lên, qua bản gel điện di ta có thể xác định sự tồn tại của chúng

2.2.3.6 Các phương pháp khác (Vũ Khắc Nhượng, 1983)

Đối với một số loại bệnh cây còn dùng phương pháp hóa học để chẩn đoán dựa vào sự xuất hiện màu sắc như dùng dung dịch CuSO4 3% để chẩn đoán bệnh virus Cucumis virus 2

Phương pháp huỳnh quang để chẩn đoán mô quả, hạt bị bệnh dựa vào đặc tính của mô bệnh và của kí sinh vật có khả năng phát sáng trong khi chiếu nguồn tia sáng có đủ độ dài sóng nhất định (nguồn sáng thường dùng là đèn thạch anh)

Phương pháp đo độ nhớt của dịch cây cũng là phương pháp có thể dùng để chẩn đoán bệnh lý của một số trường hợp cây bị bệnh

2.2.4 Sơ lược về phương pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Phương pháp này được thiết kế

cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay) Từ năm 1978, Clark và Adam đã ứng dụng phương pháp ELISA trong chẩn đoán virus hại khoai tây, thí nghiệm này đã thành công và từ đó phương pháp này được công nhận là có độ chính xác cao hơn các phương pháp huyết thanh thông thường và được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán nhanh bệnh virus thực vật, phát hiện cây bệnh ẩn (Phạm Văn Ty, 2001)

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau

Cơ sở khoa học của phương pháp này là: Khi có một protein lạ xâm nhập vào máu của động vật (kháng nguyên) thì trong cơ thể động vật sẽ có một phản ứng mạnh mẽ trở lại và sinh ra ở máu động vật một loại protein đặc hiệu (kháng thể) Kháng thể khi kết hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành kết tủa, làm mất tác dụng của kháng nguyên, vô hiệu hóa kháng nguyên

Trên cơ sở đó người ta đã tách virus từ cây bệnh, lấy virus đã được làm tinh khiết tiêm vào máu động vật làm thí nghiệm (thường là thỏ, chuột bạch hay ngựa) để gây miễn dịch, sau đó thu được kháng huyết thanh đa dòng (polyclonal antibody) Bằng một số phương pháp khác, người ta phân ly virus thành các dòng riêng biệt, thực hiện nhân chúng trên tế bào ung thư lách chuột bạch trong môi trường vô trùng và thu được kháng huyết thanh đơn dòng (monoclonal antibody) Đặc điểm quan trọng của phản ứng kháng huyết thanh là tính đặc hiệu của nó: mỗi kháng nguyên chỉ kết hợp với một loại kháng thể tương ứng mà thôi, không kết tủa chéo, do đó phương pháp này được ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu khoa học và sản xuất

Như vậy, kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Có 3 phương pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là (John R., 2001):

- Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

- Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ

kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

- Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies)

Kĩ thuật này cũng được phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA

Trong phạm vi đề tài khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kĩ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng thu nhận từ thỏ kể cả kháng thể bắt và kháng thể phát hiện

Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA

2.2.5 Sơ lược về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction)

Kĩ thuật PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985 Đây là một công cụ khá mới trong

sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến cực kì quan trọng và hiện đang được sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng như nghiên cứu Thực chất nó là một phương

pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một một lượng lớn bản

sao của một trình tự xác định

Nguyên tắc của phương pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999)

DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt

Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngược (antisens primer hay reverse primer) Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi” và “ngược” so với chiều phiên mã của gen

PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bước sau: - Biến tính phân tử DNA (Denature)

- Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) - Tổng hợp mạch mới (Extension)

Ba bước này hợp thành một chu kì và được lặp lại nhiều lần

Những phản ứng này được thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (chẳng

hạn như Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho

quá trình biến tính và bắt cặp

Nested-PCR (Mc Pherson M.J., 2000)

Đây là một dạng cải tiến từ phương pháp PCR, trong đó thí nghiệm sẽ được thực hiện lần lượt với hai hay nhiều cặp mồi Cặp mồi thứ nhất sẽ khuếch đại trình tự có kích thước lớn hơn, sau đó các mồi “nested” (nested primer) sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu

Phương pháp nested-PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested-PCR sau đó Phương pháp này được gọi là Heminested-PCR (HN-PCR)

Với phương pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu như tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên Song do sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thường Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR

RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction)

Do Taq polymerase không hoạt động được trên RNA nên người ta sử dụng kĩ thuật

phối hợp là RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR)

Nguyên tắc của phương pháp này là trước tiên RNA sẽ được chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Mồi sử dụng cho phương pháp này có thể là mồi “ngược” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuôi poly A của các mRNA) mà cũng có thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự ngắn trên RNA Sau đó, cDNA

sẽ được khuếch đại nhờ hoạt động của Taq polymerase Ngoài ra, người ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase Sau khi tạo được nguồn

cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ được tiếp tục khuếch đại thông qua phản ứng PCR như trình bày ở phần trên

Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lượng rất thấp không thể phát hiện bằng các phương pháp thông thường như Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

PHẦN III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005

Địa điểm lấy mẫu: - Xã Mỹ Hiệp, xã Bình Thạnh, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp - Xã Phú Lộc, xã Phú An, huyện Tân Phú, tỉnh Đồng Nai

- Xã Phú Tân, huyện Định Quán, tỉnh Đồng Nai

Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Phương pháp lấy mẫu

Do đu đủ ở các vườn được chọn chỉ là một loại cây trồng xen, bổ sung để tận dụng những khoảng đất trống khi cây trồng chính còn nhỏ, chưa giao tán (như các vườn mãng cầu, cam quýt, bưởi, xoài mới trồng) hoặc trồng thành đường biên bao quanh các ruộng trồng cây ngắn ngày như đậu tương, lạc nên chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu như sau:

- Trong các vườn trồng xen, thường đu đủ được trồng thành hàng xen kẽ với cây trồng chính và các hàng đu đủ này cách nhau khoảng 2 - 4 m Đối với những vườn này, lấy mẫu theo hình ziczắc sao cho việc lấy mẫu đảm bảo được tính chất ngẫu nhiên

Đối với dạng trồng theo đường biên của ruộng, nếu đường biên này bao gồm nhiều hàng đu đủ hợp thành thì chúng tôi cũng tiến hành lấy mẫu theo đường zic zắc; còn nếu đường biên chỉ gồm một hàng đu đủ, lấy mẫu ngẫu nhiên theo khoảng cách (tức là cứ 5 - 10 cây thì lấy một mẫu)

- Trên mỗi cây được chọn, cắt lấy lá ở phần ngọn (cách đỉnh khoảng 2 - 3 lá) cho vào một bao nilon riêng có ghi nhãn cẩn thận với đầy đủ thông tin về địa điểm, chủ vườn, giống cây, triệu chứng, điều kiện canh tác (xem Bảng điều tra ở phần Phụ lục)

Mẫu sau đó được đem về phòng thí nghiệm và trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20o

C

Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm

3.3.1 Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ

- Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu - Kéo

- Cân phân tích

- Eppendoff 1,5 ml để chứa mẫu sau khi nghiền - Eppendoff 0,2 ml

- Hộp đựng eppendoff - Micropipette P1000 - Micropipette P100 - Đầu tip 1000 μl - Đầu tip 100 μl

- Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng và keo dán đĩa ELISA (adhesive film) - Ống đong