Thiết kế thí nghiệm
Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ lá đu đủ bằng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) của công ty Bio- Rad. Từ dung dịch RNA thu đƣợc, tiến hành phản ứng sao chép ngƣợc thành DNA với bộ kit iScriptTM
cDNA Synthesis Kit cũng do Bio- Rad cung cấp. Sau đó, từ nguồn cDNA thu đƣợc, thực hiện phản ứng khuếch đại PCR với cặp mồi 1 (nêu ở phần vật liệu và phƣơng pháp). Sản phẩm nhân bản đƣợc phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1,5 % cùng với thang 100 bp, nhuộm bằng ethium bromide, đọc kết quả bằng máy đọc gel. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
a) b)
Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn
b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2
LD: Ladder ĐQ: Mẫu lấy ở huyện Định Quán MH: Mẫu lấy ở xã Mỹ Hiệp TP: Mẫu lấy ở huyện Tân Phú BT: Mẫu lấy ở xã Bình Thạnh 300 bp 100 bp 650 bp 400 bp 300 bp 100 bp
Nhận xét:
Khi thực hiện phản ứng PCR trên quy trình nhiệt chuẩn, chúng tôi thấy chỉ xuất hiện 1 band duy nhất có kích thƣớc 300 bp, không thấy band 900 bp. Để hoạt động của mồi đặc hiệu hơn, chúng tôi tiến hành thay đổi thông số về nhiệt độ (chu kì nhiệt 1 và 2) song sản phẩm thu đƣợc lại có nhiều band, và cũng không thấy xuất hiện band mong muốn. Do nhiệt độ thay đổi khá nhiều và gần đến nhiệt độ biến tính của mồi mà không thu đƣợc kết quả nên chúng tôi tiến hành giữ nguyên chu kì nhiệt chuẩn và chuyển sang thay đổi các thông số hóa chất trong phản ứng PCR. Qua nghiên cứu tài liệu về các chất có tác dụng hỗ trợ cho phản ứng PCR (enhancers of PCR), nhận thấy chất DMSO (Dimethylsulfoxide) là một chất có tác dụng duy trì sự tách mạch của DNA trong giai đoạn biến tính, qua đó hỗ trợ cho phản ứng khuếch đại hoàn toàn trình tự DNA, nhất là đối với những trình tự khá dài (Sambrook; Newton C.R., 1997). Nồng độ DMSO trong hỗn hợp phản ứng là 2 %. Kết quả thu đƣợc từ nghiệm thức với chu kì nhiệt chuẩn và thành phần hóa chất có bổ sung DMSO:
Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1
Nhận thấy, sản phẩm PCR xuất hiện nhiều band bao gồm band 900 bp (band có kích thƣớc mong muốn), 350 bp và 100 bp. Nhƣ vậy, DMSO đã phát huy tác dụng trong nghiệm thức này.
Tuy nhiên, sản phẩm thu đƣợc đa kích thƣớc và band mong muốn khá mờ, nhƣ vậy chứng tỏ cặp mồi đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là không đặc hiệu. Thật vậy, qua
900 bp
350 bp 100 bp
tra cứu các thông tin về độ đặc hiệu của cặp mồi 1 trên trang web NCBI- BLAST thấy chỉ mồi antisense là bắt cặp với đoạn gene CP của PRSV, còn mồi sense thì không thấy sự bắt cặp nào với gene CP.
Độ đặc hiệu của mồi xuôi 1
Query = Sense 5‟- ATC ATT CCA TGG GCG TGT TCC ATG AAT CAA- 3‟ (30 letters)
Taxonomy reports
Distribution of 5 Blast Hits on the Query Sequence
Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1
Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi xuôi 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)
gi|21627138|gb|AE003811.3| Drosophila melanogaster chromosome 2R, section 39 of 74 of the complete sequence
gi|49609491|emb|BX950851.1| Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043, complete genome
gi|24653840|ref|NM_166092.1| Drosophila melanogaster CG16801-PA, isoform A (CG16801) mRNA, complete cds
gi|24653838|ref|NM_137188.1| Drosophila melanogaster CG16801-PB, isoform B (CG16801) mRNA, complete cds
gi|13430987|gb|AC008342.12|AC008342 Drosophila melanogaster, chromosome 2R, region 51F-51F, BAC clone BACR33K06, complete sequence
Độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1
Query = Antisense 5‟- AGC TAA CCA TGG GCG AGT ATT CAG TTG CGC- 3‟ (30 letters)
Taxonomy reports
Distribution of 40 Blast Hits on the Query Sequence
Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1
Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi ngƣợc 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)
gi|29469899|gb|AY231130.1| Papaya ringspot virus Mex-VrPO, complete genome
gi|3882013|emb|AJ012649.1|PRI012649 Papaya ringspot virus CP gene, isolate Veracruz (VTB-6), partial cds
gi|247640|gb|S89893.1| 3' region: coat protein [papaya ringspot virus PRSV, type W Australian isolate, Cucurbita pepo cv. Green Ruffles (Northrup King), Genomic RNA, 1070 nt]
gi|6694283|gb|AF196839.1|AF196839 Papaya ringspot virus isolate H1K coat protein gene, partial cds
gi|6694281|gb|AF196838.1|AF196838 Papaya ringspot virus isolate Puerto Rico coat protein gene, partial cds
gi|3511154|gb|AF063220.1| Papaya ringspot virus isolate P polyprotein gene, partial cds
gi|12744709|gb|AF319507.1|AF319507 Papaya ringspot virus isolate VrCo-7 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744707|gb|AF319506.1|AF319506 Papaya ringspot virus isolate VrCa-15 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744705|gb|AF319505.1|AF319505 Papaya ringspot virus isolate VrAc-27 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744703|gb|AF319504.1|AF319504 Papaya ringspot virus isolate TbC-43 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744701|gb|AF319503.1|AF319503 Papaya ringspot virus isolate TbC-42 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744699|gb|AF319502.1|AF319502 Papaya ringspot virus isolate SpT-27 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744697|gb|AF319501.1|AF319501 Papaya ringspot virus isolate CpPM- 40 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744695|gb|AF319500.1|AF319500 Papaya ringspot virus isolate CpPM- 39 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744693|gb|AF319499.1|AF319499 Papaya ringspot virus isolate YcY-15 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744689|gb|AF319497.1|AF319497 Papaya ringspot virus isolate VrCo-1 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744687|gb|AF319496.1|AF319496 Papaya ringspot virus isolate VrAl-18 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744685|gb|AF319495.1|AF319495 Papaya ringspot virus isolate TmLC- 70 coat protein (CP) gene,partial cds
gi|12744683|gb|AF319494.1|AF319494 Papaya ringspot virus isolate TmCM- 25 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744681|gb|AF319493.1|AF319493 Papaya ringspot virus isolate QrFC-3 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744679|gb|AF319492.1|AF319492 Papaya ringspot virus isolate QrFC-2 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744677|gb|AF319491.1|AF319491 Papaya ringspot virus isolate QrFC-1 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744675|gb|AF319490.1|AF319490 Papaya ringspot virus isolate OxT-80 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744673|gb|AF319489.1|AF319489 Papaya ringspot virus isolate OxT-66 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744671|gb|AF319488.1|AF319488 Papaya ringspot virus isolate OxT-27 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744667|gb|AF319486.1|AF319486 Papaya ringspot virus isolate McFJ-57 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744665|gb|AF319485.1|AF319485 Papaya ringspot virus isolate McFJ-18 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12744659|gb|AF319482.1|AF319482 Papaya ringspot virus isolate JlPV-13 coat protein (CP) gene, partial cds
gi|12584306|gb|AY017190.1| Papaya ringspot virus clone CpT-30 polyprotein gene, partial cds
gi|12584304|gb|AY017189.1| Papaya ringspot virus clone GrCy-9 polyprotein gene, partial cds
gi|11141739|gb|AF309968.1|AF309968 Papaya ringspot virus isolate Colima coat protein (CP) mRNA, partial cds
gi|63034424|gb|DQ008449.1| Papaya ringspot virus P isolate VER75-pr.8-5 coat protein gene, partial cds
gi|63034422|gb|DQ008448.1| Papaya ringspot virus P isolate VER74-pr.8-12 coat protein gene, partial cds
gi|63034420|gb|DQ008447.1| Papaya ringspot virus P isolate VER73-pr.8-8 coat protein gene, partial cds
gi|63034418|gb|DQ008446.1| Papaya ringspot virus P isolate VER72-pr.8-25 coat protein gene, partial cds
gi|58531193|dbj|AP008212.1| Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 6, complete sequence
gi|58197799|gb|AC154401.2| Mus musculus BAC clone RP23-166O7 from 13, complete sequence
429 bp
gi|4582483|gb|AC006312.8|AC006312 Homo sapiens chromosome 9, clone hRPK.401_G_18, complete sequence
gi|21202838|dbj|AP003489.2| Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 6, PAC clone:P0568D10
gi|40539136|gb|AC126426.3| Mus musculus BAC clone RP24-291G13 from chromosome 13, complete sequence
Sau khi tra cứu độ đặc hiệu của cặp mồi 1, nhận thấy có một nghi vấn đặt ra đó là sản phẩm kích thƣớc 900 bp thu đƣợc này có phải đã đƣợc khuếch đại từ trình tự của gene CP trên PRSV hay không? Hay đó chỉ là sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi với một đoạn gene lạ, tạp nhiễm cũng có kích thƣớc 900 bp.
Để khẳng định độ đặc hiệu của cặp mồi 1 cũng nhƣ khẳng định sản phẩm kích thƣớc 900 bp trên là đƣợc khuếch đại từ gene CP của PRSV, với sự giúp đỡ của thầy Đinh Duy Kháng- Viện Công Nghệ Sinh Học Hà Nội, chúng tôi đã thiết kế hai cặp mồi đặc hiệu hơn cho đoạn gene CP của PRSV, gồm P7-M30 và P14-M31 (với trình tự đƣợc nêu ở phần Vật liệu và phƣơng pháp). Với hai cặp mồi này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nested- PCR, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Từ sản phẩm khuếch đại của cặp mồi 1, sử dụng 1μl sản phẩm này làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo với cặp mồi P7-M30 (mọi thông số để thực hiện phản ứng đƣợc giữ nguyên nhƣ cũ).
Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên sản phẩm thu đƣợc từ cặp mồi 1
Nhận xét:
Kết quả phản ứng PCR trên cặp mồi P7-M30 chỉ cho 1 band duy nhất với kích thƣớc 429 bp, điều này đã giải tỏa đƣợc nghi ngờ về sản phẩm 900 bp thu đƣợc từ cặp mồi 1. Chứng tỏ sản phẩm 900 bp này đúng là đã đƣợc khếch đại từ trình tự gene CP của PRSV.
- Để kiểm chứng lại độ tin cậy của thí nghiệm Nested-PCR trên hai cặp mồi 1 và P7-M30, chúng tôi tiến hành thí nghiệm Nested-PCR một lần nữa trên hai cặp mồi P7- M30 và P14-M31 (trình bày ở phần Vật liệu và phƣơng pháp).
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi P14-M31 trên khuôn mẫu là sản phẩm cDNA thu đƣợc từ phản ứng sao chép ngƣợc RNA tổng số từ kit ly trích (với quy trình và hóa chất PCR đƣợc giữ nguyên nhƣ chuẩn ban đầu).
Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31
Nhận xét:
Sản phẩm khuếch đại chỉ gồm một band duy nhất với kích thƣớc 658 bp, chứng tỏ cặp mồi P14-M31 là đặc hiệu.
Từ sản phẩm 658 bp này, ta lấy 1μl sản phẩm để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo với cặp mồi trong là P7-M30 (với quy trình chuẩn ban đầu).
Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30
Nhận xét:
Từ hai thí nghiệm Nested-PCR trên đã khẳng định chắc chắn về độ đặc hiệu của các cặp mồi 1, P7-M30, P14-M31 và sự hiện diện của trình tự CP gene của PRSV trong mẫu bệnh thu đƣợc.
Nhƣ đã nêu ở phần Vật liệu và Phƣơng pháp, các mẫu sử dụng trong thí nghiệm RT-PCR là các mẫu dƣơng tính chọn lọc từ kết quả của test kit ELISA. Với kết quả dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp RT-PCR đã củng cố và bổ sung cho kết quả thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA. Nhận thấy, dù chẩn đoán bệnh bằng phƣơng pháp nào đi nữa thì độ tin cậy đều nhƣ nhau. Tuy nhiên, mỗi phƣơng pháp có những ƣu nhƣợc điểm riêng và do đó tùy thuộc điều kiện, yêu cầu cụ thể mà ta chọn phƣơng pháp ứng dụng cho phù hợp.
Những ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp ELISA và RT-PCR Ƣu điểm
- Phƣơng pháp ELISA cho phép phát hiện đồng thời một lƣợng mẫu lớn hơn rất nhiều so với phƣơng pháp RT-PCR (thƣờng một kit PLANTEST ELISA® chuẩn có thể chẩn đoán cùng một lúc 135 mẫu).
- Phƣơng pháp RT-PCR lại có độ nhạy cao hơn.
Nhƣợc điểm
- Phƣơng pháp RT-PCR do cần phải có giai đoạn tách chiết RNA nên tốn nhiều thời gian hơn; mẫu RNA sau đó phải đƣợc bảo quản ở điều kiện lạnh, sạch, an toàn. Nếu không, mẫu để lâu sẽ không đảm bảo, dễ nhiễm RNase từ môi trƣờng làm phân hủy RNA mẫu, gây hiện tƣợng âm tính giả; hoặc dễ nhiễm RNA lạ từ môi trƣờng làm nhiễu kết quả thí nghiệm, đôi khi còn gây hiện tƣợng dƣơng tính giả.
- So với ELISA, RT-PCR đòi hỏi điều kiện thực hiện thí nghiệm nghiêm ngặt hơn, phải có hóa chất và dụng cụ chuyên dùng khi thao tác với RNA. Điều kiện thí ngiệm phải luôn đảm bảo ở nhiệt độ lạnh hoặc mát; luôn đeo găng tay để tránh Rnase trên đầu ngón tay dính vào mẫu, eppendoff…
- Hóa chất sử dụng cho tách chiết và thực hiện RT-PCR phải có độ tinh khiết cao, do đó giá thành cũng cao hơn so với ELISA. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh bằng kĩ thuật RT-PCR khó thực hiện và phổ biến rộng rãi đối với các nƣớc có nền kinh tế còn khó khăn, đang phát triển. Từ đó nó cản trở khả năng phổ biến, ứng dụng vào thực tiễn của phƣơng pháp RT-PCR.
Nhìn chung ELISA có độ nhạy thấp hơn song xét về mặt kinh tế và tính dễ thực hiện nó có nhiều ƣu điểm hơn so với kĩ thuật RT-PCR.