Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế
cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay). Từ năm 1978, Clark và Adam đã ứng dụng phƣơng pháp ELISA trong chẩn đoán virus hại khoai tây, thí nghiệm này đã thành công và từ đó phƣơng pháp này đƣợc công nhận là có độ chính xác cao hơn các phƣơng pháp huyết thanh thông thƣờng và đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán nhanh bệnh virus thực vật, phát hiện cây bệnh ẩn (Phạm Văn Ty, 2001).
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau.
Cơ sở khoa học của phƣơng pháp này là: Khi có một protein lạ xâm nhập vào máu của động vật (kháng nguyên) thì trong cơ thể động vật sẽ có một phản ứng mạnh mẽ trở lại và sinh ra ở máu động vật một loại protein đặc hiệu (kháng thể). Kháng thể khi kết hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành kết tủa, làm mất tác dụng của kháng nguyên, vô hiệu hóa kháng nguyên.
Trên cơ sở đó ngƣời ta đã tách virus từ cây bệnh, lấy virus đã đƣợc làm tinh khiết tiêm vào máu động vật làm thí nghiệm (thƣờng là thỏ, chuột bạch hay ngựa) để gây miễn dịch, sau đó thu đƣợc kháng huyết thanh đa dòng (polyclonal antibody). Bằng một số phƣơng pháp khác, ngƣời ta phân ly virus thành các dòng riêng biệt, thực hiện nhân chúng trên tế bào ung thƣ lách chuột bạch trong môi trƣờng vô trùng và thu đƣợc kháng huyết thanh đơn dòng (monoclonal antibody). Đặc điểm quan trọng của phản ứng kháng huyết thanh là tính đặc hiệu của nó: mỗi kháng nguyên chỉ kết hợp với một loại kháng thể tƣơng ứng mà thôi, không kết tủa chéo, do đó phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu khoa học và sản xuất.
Nhƣ vậy, kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là (John R., 2001):
- Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme).
- Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ
kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme).
- Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies).
Kĩ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA
Trong phạm vi đề tài khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kĩ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện. Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng thu nhận từ thỏ kể cả kháng thể bắt và kháng thể phát hiện.
Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA
2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction)
Kĩ thuật PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998)
PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985. Đây là một công cụ khá mới trong
sinh học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kì quan trọng và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng nhƣ nghiên cứu. Thực chất nó là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định.
Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999)
DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt.
Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer hay reverse primer). Từ “xuôi” và “ngƣợc” phải hiểu là “xuôi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen.
PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: - Biến tính phân tử DNA (Denature)
- Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) - Tổng hợp mạch mới (Extension)
Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần.
Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (chẳng hạn nhƣ Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp.
Nested-PCR (Mc Pherson M.J., 2000)
Đây là một dạng cải tiến từ phƣơng pháp PCR, trong đó thí nghiệm sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt với hai hay nhiều cặp mồi. Cặp mồi thứ nhất sẽ khuếch đại trình tự có kích thƣớc lớn hơn, sau đó các mồi “nested” (nested primer) sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu.
Phƣơng pháp nested-PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested-PCR sau đó. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là Heminested- PCR (HN-PCR). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với phƣơng pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu nhƣ tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Song do sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thƣờng. Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR .
RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction)
Do Taq polymerase không hoạt động đƣợc trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kĩ thuật phối hợp là RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR).
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là trƣớc tiên RNA sẽ đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc. Mồi sử dụng cho phƣơng pháp này có thể là mồi “ngƣợc” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuôi poly A của các mRNA) mà cũng có thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA sẽ đƣợc khuếch đại nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục khuếch đại thông qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên.
Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU