Luận văn : NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR part 3 pot

9 b. Triệu chứng Cây bệnh biểu hiện triệu chứng cong lá và biến dạng. Mép lá có xu hƣớng cuốn lên trên và xuất hiện các đốm vàng sáng, đôi khi các viền vàng lan vào trong các vùng mô giữa gân lá. (Bùi Cách Tuyến) 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 2.3.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng, số hoa, tỷ lệ đậu quả. Nhiệt độ ngày/đêm khoảng 25/18 là thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng, phát triển của ớt nói chung, tăng năng suất, tăng số quả thƣơng phẩm. Nhiệt độ ban đêm thấp (8-15 o C) thƣờng làm giảm tỷ lệ đậu quả và sinh quả không hạt, nhiệt độ ban đêm thích hợp nhất là 20 o C trong giai đoạn nở hoa. Ngoài ra nhiệt độ thấp còn làm giảm kích thƣớc dạng quả. Nói chung ớt thích hợp nhiệt độ cao hơn và dao động trong khoảng 20-30 o C. 2.3.2 Ánh sáng Ớt là cây không mẫn cảm lắm với ánh sáng nhƣng là cây ƣa ánh sáng ngày ngắn. Nếu chiếu sáng 9-10 giờ sẽ kích thích sinh trƣởng, tăng sản phẩm khoảng 21-24% và tăng chất lƣợng quả. Trời âm u sẽ làm hạn chế khả năng đậu quả, làm giảm năng suất của cây ớt. 2.3.3 Ẩm độ Ớt rất thích với điều kiện đất ẩm, đất ẩm nhƣng trong điều kiện không khí khô hạn sẽ kích thích quá trình chín của quả. Ớt là cây chịu hạn, nếu ẩm độ đất khoảng 10% tỷ lệ rụng quả tăng đến trên 71%, trong khi ẩm độ từ 55-58% tỷ lệ rụng quả chỉ còn 20-30%. Nếu ẩm độ thấp hơn 70% trong giai đoạn ra hoa, hình thành quả thì quả sẽ bị sần sùi, giảm giá trị thƣơng phẩm. Tốt nhất duy trì độ ẩm đồng ruộng khoảng 70- 80%. Nếu ẩm độ quá cao rễ sinh trƣởng kém, cây còi cọc. 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng Ớt là cây trồng tƣơng đối dễ tính. Đất phù hợp nhất là đất thịt nhẹ, giàu vôi, ớt có thể sinh trƣởng, cho năng suất trên đất cát nhƣng phải bảo đảm đƣợc chế độ nƣớc và dinh dƣỡng đầy đủ. Đất chua và kiềm đều không thích hợp cho ớt sinh trƣởng và phát triển. Ớt có thể sinh trƣởng ở đất chua và màu mỡ nhƣng tỷ lệ nảy mầm và tính chín sớm bị ảnh hƣởng. Ớt là cây chịu mặn, ngƣời ta đã nghiên cứu và thấy rằng ớt có thể nảy mầm ngay cả ở nồng độ muối 4000ppm và pH=7,6. 10 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới. TSWV đƣợc báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi nó gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đó đƣợc mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus. Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu mà nhạy cảm với TSWV thì còn có họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác. Tỉ lệ nhiễm khoảng 59- 90% điều này đƣa đến hậu quả là nó ảnh hƣởng lên các loại hoa màu có giá trị thƣơng mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hƣởng đến các loại hoa màu nhiều nhất. (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.4.2 Cấu trúc TSWV TSWV là thành viên của giống Tospovirus, thuộc họ Bunya viridae là một nhóm lớn virus chứa vật liệu di truyền là các sợi đơn RNA. TSWV là những tiểu phần nhỏ, đƣờng kính 80-120nm. Genome của TSWV gồm một sợi RNA âm tính và hai sợi RNA ambisense. Mỗi RNA của genome thì đƣợc bao bọc bởi nhiều bản copy của Nucleocapside (N) để hình thành nên ribonucleoprotein cũng đƣợc biết nhƣ là nucleocapside. Các nucleocapside đƣợc bao bọc bên trong lớp màng đôi đƣợc tạo ra từ ký chủ và đi kèm với protein L phụ thuộc vào chuỗi RNA. Chúng để lộ các glycoprotein ra ngoài bề mặt 5-10nm mà sau khi đã gắn vào lớp màng đôi lipid dày khoảng 5nm. Tính trên thành phần tổng số thì RNA chiếm 2%; protein chiếm 58%; lipid chiếm 33% và carbohydrate chiếm 7%. Chúng chỉ xuất hiện trong tế bào chất mà không ở bất kỳ tổ chức nào. Theo một nhà khoa học thì có ba thuyết chính giải thích về hình thể tròn của virus. Thứ nhất là nồng độ của khối khuếch tán bình thƣờng là rất cao và đôi khi vỏ nucleoprotein của virus lại xoắn lại. Thứ hai là sự bao bọc các nucleoprotein trần này bằng các màng để tạo nên virus trƣởng thành. Thuyết thứ ba là sự cách ly với các phần của virus trong các buồng bên trong các lỗ trong màng hoặc trong hệ thống lƣới nội chất là một phản ứng của cây ký chủ (cô lập chúng bằng cách bao chúng lại). Tất cả các virus thuộc họ này đều có ba đoạn genome RNA, đƣợc đặt tên là L (long), M (medium), và S (short). Có thể số lƣợng thì không tƣơng đồng trong mỗi loại virion bởi vì sự giống hay khác nhau về số lƣợng của các đoạn này là không có ý nghĩa. 11 Đoạn genome L tạo ra một loại protein, đây là một polymerase. Các đoạn M tạo ra các glycoprotein đƣợc đặt tên là G1 và G2. Đoạn genome S tạo ra các nucleoprotein. Tiến trình tái bản của genome L nền tảng cho TSWV (genome L tạo ra polymerase, đây là một enzyme cần thiết cho sự tái bản để nhân lên của virus trong cơ thể ký chủ). Chính các bản sao của RNA của virus thành cRNA, cRNA sau đó sẽ tạo ra nhiều vRNA, hai tiến trình này thƣờng xuyên tạo ra lẫn nhau. vRNA sau đó thực hiện sao mã và dịch mã thành chuỗi protein. Đây là cách để tái bản genome tốt nhất. Tiến trình này khác với cả các đoạn genome S và M. Đồng thời chính các sao của vRNA cũng chuyển thành cRNA. Tuy nhiên, cRNA sau đó cũng trải qua quá trình sao mã và dịch mã một cách trực tiếp mà không cần sự có mặt của vRNA, song song với cRNA thì vRNA cũng trải qua quá trình sao mã và dịch mã. Khả năng này xảy ra thì đƣợc gọi là “ambisense”. Điều này có nghĩa là các đoạn S và M có cả các chiến lƣợc tái bản mang ý nghĩa “positive” và “negative”. Kết quả là tạo ra protein phi cấu trúc đƣợc gọi là NSs hoặc NSm và nó phụ thuộc vào genome mà ta đang quan sát. Đoạn S cũng tạo ra protein N và đoạn M tạo ra cả hai loại G1 và G2 bằng việc phân cắt protein trong quá trình dịch mã. Cho đến nay thì chức năng của protein NS vẫn chƣa đƣợc biết rõ. Bên cạnh đó một điều đáng quan tâm là giữa các đoạn S, L, M có trình tự kết thúc nhƣ nhau khi ta quan sát trình tự nucleotide của chúng. Vùng đầu tiên của các sợi đều nhƣ nhau, còn vùng cuối cùng thì có sự phân biệt. Có lẽ chính điều này mà không thể tìm thấy sự tƣơng đồng trong các virion. (Lindsey Irons and Emily Sims) Hình 2.1: Cấu trúc virút TSWV 12 Hình 2.2: Sơ đồ sao mã và dịch mã của virút TSWV (Peter Schreier, Prof. Dr. Martin Hülskamp, 2002) 13 Bảng 2.2: Mô tả đặc tính của từng loại genome TSWV (Biowave vol.6 No.23, 2004) 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh Con đƣờng xâm nhập và tái bản virus đƣợc thể hiện nhƣ hình vẽ, các đoạn RNA tái bản từ đầu đến cuối. Đầu tiên là tấn công của hạt virion. Thứ hai là xâm nhập vào và cởi bỏ lớp áo virus bằng sự ẩm thực bào của hạt virus và sự hợp nhất giữa màng virus và màng nhân. Thứ ba là sự sao mã sơ cấp xảy ra. Thứ tƣ là sự dịch mã của các đoạn mRNA L và S bởi các ribosome tự do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M bởi các ribosome gắn trên màng và xảy ra sự glycozyl hoá đầu tiên các protein vỏ mới đƣợc tạo ra. Giai đoạn thứ năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu bằng đoạn nucleotide để thích hợp nhƣ là những khuôn mẫu đối với RNA genome hoặc trong một số trƣờng hợp là những mRNA. Tiếp đến là sự tái bản genome theo sau là sự sao mã thứ cấp, tức là tổng hợp các loại mRNA và xuất hiện sự sao mã ambisense. Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong tiểu thể golgi. Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa khối tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trƣởng thành. 14 Hình 2.3: Chu trình xâm nhiễm của virút TSWV (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV Triệu chứng là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, héo tạo đốm trên cây, thay đổi màu của thân cành, cây cằn cỗi, đốm lấm chấm nhƣ màu rám nắng. Điều này làm cho cây bị biến đổi rất mạnh mẽ cả về hình thái và sức sống. Sự gây hại này phụ thuộc vào việc trồng trọt, cách ly với virus, giai đoạn phát triển của cây khi bị tấn công và điều kiện môi trƣờng. Nếu cây trồng bị nhiễm lúc giai đoạn đang phát triển thì nó sẽ gây hại nghiêm trọng và đôi khi không cho ra quả, nếu cây trồng bị nhiễm sau khi cây đã ra quả thì sẽ làm giảm khả năng quang hợp, xuất hiện các đốm hoại tử hoặc các vòng hoại tử trên cành, thân, lá. Hiện tƣợng rụng hoa và lá cũng xuất hiện trong một số trƣờng hợp. Sự tăng màu diệp lục tố, xuất hiện các đốm hoại tử, các vòng nhẫn hoặc thể khảm có thể tăng trên quả khi cây bị nhiễm. Những triệu chứng này làm mất giá trị cảm quan khi cây trƣởng thành.( Theo Ken Pernezny và ctv, 2003). 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt Triệu chứng bệnh TSWV trên cây ớt rất thay đổi. Lá có thể bị khảm, lốm đốm vàng, đốm vòng vàng và chết hoại, biến dạng. ở một số giống, xảy ra chết hoại toàn bộ chồi ngọn và lá rụng, sau đó các lá mới mọc bị khảm toàn bộ và biến dạng mạnh mẽ. Các triệu chứng trên trái bao gồm đốm vàng và chết hoại, khảm, các hình vòng và méo 15 mó. Cây bị nhiễm ở thời kỳ đầu bị lùn hẳn và không thể hồi phục, mặc dù một số giống có khả năng phục hồi lại sự sinh trƣởng bình thƣờng. Hình 2.4: Ớt bị nhiễm TSWV (Ray Cerkauskas, 2004) 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học Về mặt huyết thanh học thì TSWV thuộc Serogroup I, TSWV có thể đƣợc vận chuyển bằng cơ học vào phòng thí nghiệm, nhƣng trên đồng ruộng thì nó đƣợc truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loại bọ trĩ khác nhau (Thysanoptera, thuộc họ Thripidae). Các loài bọ trĩ trên hoa Western (Frankliniella occidentalis), bọ trĩ trên thuốc lá (F. fusca) là các vectơ chính truyền bệnh. Ngoài ra F. schultzei, F. intonsa, F. bispinosa, Thrips tabaci và Thrips setosus cũng có thể mang virus này. Thông thƣờng thì bọ trĩ ở giai đoạn ấu trùng thƣờng mang TSWV nhƣ một nhu cầu cần thiết, còn bọ trĩ ở giai đoạn trƣởng thành thì lại mang TSWV không thƣờng xuyên lắm. TSWV sinh sản trong bọ trĩ càng tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó. Virus và các 16 vectơ của nó thì càng lan rộng nhanh hơn khi lƣu chuyển cây cảnh và rau quả đi từ vùng này sang vùng khác, các cánh đồng thuốc lá, đậu phụng và cỏ dại là những nguồn thƣờng xuyên và phổ biến nhất cho các loại virus và vectơ truyền bệnh này. Hình 2.5: Các loài bọ trĩ (Lindsey Irons and Emily Sims) 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển Các loài bọ trĩ đƣợc xem là trung gian truyền virút TSWV chính trên cây ớt. Chúng thì nhỏ, sinh sản nhanh chóng, sống ký sinh trên một phổ rộng các loại thực vật và vào các cánh đồng một cách thƣờng xuyên. Các loài bọ trĩ chỉ ăn phần thịt của lá, thân, quả và các bộ phận của hoa. Khi chúng ăn các phần trên sẽ làm phá hủy về hình dạng. Bọ trĩ chƣa trƣởng thành, chƣa có cánh thì đòi hỏi phải có virus ký sinh và chúng di chuyển nhiều hơn các con trƣởng thành và từ đó truyền mầm bệnh giữa các cây với nhau, từ đó dẫn đến mức độ lây lan rất nhanh. Vòng đời của bọ trĩ thƣờng từ 7-10 ngày ở nhiệt độ dao động từ 20 – 37 o C. Thông thƣờng có khoảng ba thế hệ trong suốt mùa phát triển. TSWV cứ nhiễm dai dẳng từ năm này sang năm khác trong các cây bị nhiễm từ những loài bọ trĩ ký sinh trong các mùa vụ kế cận nhau. (Ray Cerkauskas, 2004) 2.10 Khống chế bệnh TSWV TSWV ngày càng mở rộng mạnh mẽ phổ ký chủ và vectơ truyền bệnh, điều này làm cho việc khống chế chúng trở rất nên khó khăn. Thêm vào đó là sự khan hiếm các gen kháng ở cây ký chủ, đồng thời cỏ dại và cây cảnh là những kho dự trữ để lƣu lại virus và truyền bệnh cho vụ mùa sau. Do đó khi bệnh xuất hiện trong một mùa vụ, các cây trồng nên đƣợc loại và tiêu huỷ nhanh chóng cả những cây đang mang mầm bệnh tiềm ẩn và những cây có triệu chứng bệnh biểu hiện ở mức độ nghiêm trọng. Các bột 17 sáp bên ngoài những cây có triệu chứng bệnh thì không phải luôn luôn gây ảnh hƣởng, mà nó là các đối chứng cho việc nhiễm sau này vì TSWV thƣờng mở rộng mức độ lây lan trƣớc khi phát triển triệu chứng bệnh. Sau đây là một số biện pháp phòng bệnh TSWV:  Loại bỏ các loài cỏ dại và những cây mọc tự nhiên, duy trì các khoảng đệm cách ly không chứa cây cối khoảng 10 mét.  Giảm mật độ trồng để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những nguồn bị nhiễm bệnh.  Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3-4 tuần, nhằm cho phép các loại bọ trĩ có thể nổi lên lại từ những phần của hoa màu và từ đó có thể loại bỏ chúng khỏi cánh đồng hoa màu. Nếu tiết kiệm, đất có thể đƣợc xông với methamsodium (Vapam) hoặc 1,3-dichloropropene (Telone) để loại trừ bọ trĩ đang tồn tại trong các phần của hoa màu trong đất.  Nên lựa chọn trồng những cây không dễ dàng mắc bệnh, vì tỉ lệ quần thể TSWV và bọ trĩ ở khắp mọi nơi là rất cao.  Loại bỏ tất cả những nguồn bọ trĩ vào cuối mỗi mùa vụ để tránh chứa chấp một quần thể nhỏ sẵn sàng tấn công vào vụ sau.  Sử dụng những cây trồng sạch bệnh virus.  Dùng các màn lƣới để ngăn chặng hoặc làm trì hoãn sự tấn công của bọ trĩ vào nhà kính.  Khi sử dụng thuốc trừ sâu thì nên dùng vào ngày thứ năm trong giai đoạn ngƣng nghỉ để giảm bớt tỉ lệ nhiễm một cách có ý nghĩa.  Việc sử dụng nhiều loại thuốc là cần thiết để tiêu diệt đƣợc càng nhiều loại bọ trĩ càng tốt.  Khi phun thuốc cũng nên lựa chọn những thiết bị tạo ra những tiểu phần thuốc nhỏ và hiệu quả nhất khi toàn bộ cánh đồng đều đƣợc phun.  Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để trì hoãn sự kháng thuốc. Hứa hẹn trong tƣơng lai là sẽ phân lập các gen kháng để chuyển vào cây ớt cho phép tạo ra tính kháng với TSWV. (Ray Cerkauskas, 2004), (Ken Pernezny và ctv, 2003) 18 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh chóng. Chẩn đoán bằng cây chỉ thị là phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu virus thực vật. Cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: các cây nhiễm bệnh cục bộ và các cây nhiễm bệnh hệ thống. Cây nhiễm bệnh cục bộ thƣờng tạo ra các vết chết trên lá, thân,…còn cây nhiễm hệ thống thƣờng tạo ra triệu chứng toàn thân nhƣ: khảm lá, biến vàng, lùn cây, và một số triệu chứng khác. Để thu đƣợc cây chỉ thị thì chúng ta phải thực hiện các yêu cầu sau:  Các điều kiện chuẩn bị để làm thí nghiệm lây bệnh trên cây chỉ thị: đất thí nghiệm, phân bón.  Phƣơng pháp trồng trọt cây chỉ thị  Phƣơng pháp tiến hành lây bệnh nhân tạo (Vũ Triệu Mân, 2003) 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận Nhƣ cây cúc bách nhật (Gomphrena globosa) virus X gây vết chết hình nhẫn vòng viền đỏ. Cây rau muối (Chenopodium quinoa) virus S gây các đốm vàng trên lá. 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống Cây thuốc lá: Nicotiana tabacum var xanthi virus Y gây khảm lá và gân sáng. Cây tầm bóp Mỹ: Physalis floridana gây hiện tƣợng vàng lùn cây sau khi truyền bằng rệp. Các cây chỉ thị đƣợc sử dụng trƣớc tiên với mục đích để chẩn đoán bệnh hại: ngƣời ta thƣờng dùng những cây có triệu chứng nhiễm bộ phận để thực hiện thí nghiệm này. Các cây nhiễm hệ thống thƣờng đƣợc dùng để giữ nguồn virus phục vụ các thí nghiệm trong phòng. Cây chỉ thị là cách chẩn đoán quan trọng trong các phòng thí nghiệm virus thực vật vì chúng là cơ sở ban đầu để chẩn đoán. Nhƣợc điểm cơ bản của phƣơng pháp này cần có thời gian lây bệnh và phải chờ cây phát bệnh sau một thời kỳ ủ bệnh. . thực vật. Cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: các cây nhiễm bệnh cục bộ và các cây nhiễm bệnh hệ thống. Cây nhiễm bệnh cục bộ thƣờng tạo ra các vết chết trên lá, thân,…còn cây nhiễm hệ thống. khi cây trƣởng thành.( Theo Ken Pernezny và ctv, 20 03) . 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt Triệu chứng bệnh TSWV trên cây ớt rất thay đổi. Lá có thể bị khảm, lốm đốm vàng, đốm vòng vàng và. cũng là cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện nhanh chóng. Chẩn đoán bằng cây chỉ thị là phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu virus