Luận văn : NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR part 7 pptx

49 Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng  Nhận xét: theo kết quả trên thì các triệu chứng nghi ngờ đều có thể tin cậy đƣợc, bởi vì kết quả chẩn đoán bằng ELISA đều cho thấy tỉ lệ nhiễm TSWV cũng khá cao (57%). Bên cạnh đó còn một điều lƣu ý là hầu nhƣ những lá bị khảm vàng đều có thể đã bị nhiễm TSWV, nhƣng mức độ nặng hay nhẹ thì phải qua chẩn đoán mới có kết luận chính xác. Có những lá nhìn bề ngoài thì không thấy triệu chứng gì nhƣng khi kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Điều này có thể lý giải là bệnh chỉ ở giai đoạn đ ầu khi virút vừa xâm nhập, chƣa đủ thời gian để biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. 37,5 57 53 25 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ (%) Xaõ Khảm vàng xanh, lá cong Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ Đồ thị 4.2: Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng  Nhƣ vậy, chúng ta thấy trong tất cả các triệu chứng trên không xuất hiện triệu chứng là các đốm vòng tròn đồng tâm (đây lại là triệu chứng chính của virút TSWV), nhƣng kiểm tra vẫn phát hiện bệnh. Do đó không thể chỉ dựa vào một triệu chứng là các vòng tròn đồng tâm mà phải kết hợp với các triệu chứng nêu trên mới có thể chẩn đoán trên đồng ruộng một cách khá tốt rằng cây ớt có bị nhiễm bệnh TSWV Triệu chứng Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm % mẫu nhiễm Khảm vàng xanh, lá cong 8 3 37,5 Lá chấm vàng xanh, nhăn, dày,giòn 7 4 57 Khảm nặng, chấm đen, lủng lỗ 15 8 53 Khảm vàng nhạt trên rìa lá, lá nhỏ 8 2 25 50 hay không. Bên cạnh việc xác định bệnh trên lá, chúng tôi cũng tiến hành kiểm tra trên trái ớt, với kết quả nhƣ sau: 67% 33% Không nhiễm Trái nhiễm Đồ thị 4.3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt  Từ những thực tế trên đồng ruộng cho thấy rằng: để phát hiện bệnh mà chỉ dựa vào triệu chứng là những đốm vòng tròn đồng tâm thì khó có thể phát hiện đƣợc. Bởi vì có những trái ớt có triệu chứng là những vòng tròn đồng tâm nhƣng rất giống với triệu chứng của bệnh thán thƣ, nên rất khó phân biệt. 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi Việc đánh giá tỉ lệ bệnh theo độ tuổi là rất khó và không thực hiện đƣợc vì khi tiến hành lấy mẫu ớt thì các vƣờn ớt đều đã vào cuối vụ, đã cho trái đợt hai. Nhƣ chúng ta đã biết, bệnh virút là bệnh không điều trị đƣợc. Cây khi bị nhiễm virút thì bắt buộc phải loại bỏ, nhƣng nếu làm nhƣ vậy thì sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến hiệu quả kinh tế của các nông hộ. Do đó tính cấp thiết của vấn đề là khi bệnh chƣa bùng phát thành dịch thì phải có biện pháp phòng ngừa kịp thời, có chiến lƣợc quản lý nguồn giống trƣớc khi đƣa vào canh tác để đem lại hiệu quả kinh tế cho bà con nông dân. 51 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA Hình 4.7: Kết quả điện di RNA  Chú thích: + Giếng 1: mẫu cDNA 1 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 2: mẫu cDNA 2 đã qua bƣớc reverse transcription + Giếng 3: mẫu RNA 1 tổng số vừa ly trích xong + Giếng 4: mẫu RNA 1 đã qua xử lý RNase, ủ ở 37 o C trong 1 giờ + Giếng 5: mẫu RNA 2 tổng số vừa ly trích + Giếng 6: mẫu RNA 3 tổng số vừa ly trích  Nhận định chung: + Từ giếng số 3 và 4 cho thấy, cũng một mẫu RNA tổng số sau khi ly trích nhƣng khi đƣợc xử lý với RNase thì vệt băng mờ hẳn đi. Điều này có thể phần nào khẳng định rằng trong mẫu ly trích có chứa RNA tổng số nhƣng có thể chƣa khẳng định đƣợc là có tồn tại RNA của virút TSWV nhƣ mong muốn không. Ở đây sẽ có một điều khó hiểu là tại sao RNA sợi đơn lại có thể bắt đƣợc với các phân tử ethidium bromide để phát sáng dƣới tia UV, từ thắc mắt này chúng tôi đã tìm hiểu và biết rằng các phân tử ethidium bromide không có một cơ chế bắt cặp đặc hiệu với sợi đôi DNA, ethidium bromide có thể xen vào các khe hở giữa các phân tử, nó tồn tại ở đó và sẽ phát sáng dƣới tia UV (đòi hỏi hàm lƣợng các phân tử phải khá cao) 52 + Ở giếng 1 và giếng 2 chúng tôi tiến hành chạy sản phẩm cDNA, nhƣng không cho bất kỳ kết quả nào. Điều này có thể giải thích: bƣớc reverse transcription để chuyển RNA thành cDNA với tổng thể tích là 20µl nhƣng chỉ chứa 2µl RNA tổng số, rồi từ 20µl cDNA đó ta chỉ hút 4µl để chạy điện di. Nhƣ vậy có thể hàm lƣợng cDNA quá thấp chƣa tới ngƣỡng phát hiện, do đó không thể phát hiện khi nhuộm với ethidium bromide và chụp dƣới tia UV. + Ở giếng 5 và giếng 6 không thấy vệt băng xuất hiện. Điều này có thể kết luận là quá trình ly trích không thành công hoặc lƣợng RNA quá ít không thể phát hiện đƣợc. 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer Sau khi thực hiện Blast để kiểm tra primer thì có kết quả sau:  Chỉ có một vị trí gắn duy nhất trên gen đích và không hề có vị trí gắn nào khác trên sợi bổ sung  Ngoài cá thể cần khuếch đại thì cặp primer này chỉ có thể khuếch đại với một số cá thể sau: 1: AY070218 Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds gi|27461077|gb|AY070218.1|[27461077] 2: AB190813 Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence gi|52421192|dbj|AB190813.1|[52421192] 3: D10066 Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds gi|222680|dbj|D10066.1|TSWLRPOLM[222680] 4: Z66548 Puumala virus segment L, genomic RNA, strain Sotkamo gi|1292880|emb|Z66548.1|PVLSOTKMO[1292880] 5: AB198742 Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds gi|57635879|dbj|AB198742.1|[57635879] 53  Cặp primer đã chọn L1 TSWV R 5’-AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC-3’ L2 TSWV F 5’-ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA-3’ 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR Kết quả RT – PCR hai bƣớc Tiến trình chạy RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả dƣơng tính đối với virút TSWV. Điều này theo chúng tôi có thể do những nguyên nhân sau:  Genome L (long) của virút TSWV không có đuôi polyA, nhƣ vậy sẽ rất khó khăn trong việc tổng hợp cDNA. Việc tổng hợp cDNA chủ yếu dựa vào các primer (mồi) ngẫu nhiên là các đoạn 6 nucleotide.  Việc tổng hợp cDNA bằng các primer nhẫu nhiên đôi khi không cho kết quả là những sản phẩm có chứa đoạn gen cần khuếch đại  Hàm lƣợng RNA quá thấp, nên lƣợng cDNA đƣợc tạo ra cũng rất thấp. Điều này có thể dẫn đến xác suất hút ra để chạy PCR đôi khi là rất thấp hoặc không có. Kết quả RT – PCR một bƣớc Hình 4.8: Kết quả chạy đối chứng dƣơng Sản phẩm đối chứng 323bp 54  Nhận định chung: Sau khi chạy RT – PCR một bƣớc có kèm đối chứng dƣơng thì chỉ có đối chứng cho sản phẩm chỉ một băng duy nhất còn mẫu bệnh ly trích thì không cho kết quả dƣơng tính. Tới đây chúng tôi mới đề xuất phƣơng án để khắc phục hiện tƣợng số lƣợng RNA khuôn mẫu quá ít là làm sao phải thiết kế đƣợc một cặp primer nữa, cặp primer này sẽ phủ bên ngoài cặp primer hiện đang dùng, mục đích là để chạy Nested PCR. 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR  Sự cần thiết phải chọn giải pháp RT – PCR kết hợp Nested PCR Bƣớc chẩn đoán virút TSWV bằng phƣơng pháp ELISA cho kết quả dƣơng tính rất yếu, điều này có thể do lƣợng virút nhiễm (RNA khuôn mẫu) rất thấp, khó có thể phát hiện bằng PCR với một cặp Primer. Do đó phải dùng phƣơng pháp Nested PCR  Bƣớc thiết kế Primer dùng cho Nested PCR Để đảm bảo sản phẩm PCR sau cùng không thay đổi về kích thƣớc, chúng tôi tiến hành thiết kế một cặp primer mới (ứng dụng phần mềm PCGEN), cặp primer này sẽ phủ bên ngoài cặp primer cũ. Nhƣ vậy qua bƣớc PCR thứ nhất với cặp primer mới sẽ tạo ra sản phẩm có kích thƣớc lớn hơn sản phẩm mong đợi. Từ đây ta trích ra một thể tích để chạy tiếp PCR với cặp primer cũ và có thể thu đƣợc sản phẩm PCR với kích thƣớc mong đợi. Sau khi tiến hành thiết kế primer bằng phần mềm PCGEN cho việc chạy Nested PCR, chúng tôi đã thiết kế đƣợc rất nhiều primer đơn bắt vào sợi sense, primer đơn bắt vào sợi antisense, cặp primer bắt vào cả hai sợi với các thông số đòi hỏi đƣợc đƣa ra nhƣ sau:  Các thông số về primer  Chiều dài primer tối ƣu là 20bp  Chiều dài primer chấp nhận đƣợc là từ 15 – 25bp  Độ lặp lại của các base đơn tối đa là 3 lần  Số lƣợng base GC ở đầu 3’ là 2  % GC chấp nhận đƣợc: 40 – 60%  Các thông số gắn kết của primer  Số lƣợng tối đa các base đối với sự tự bắt cặp của 2 primer là 4 55  Vùng cuộn lại (stem – loop) có thể chấp nhận đƣợc tối đa là 4  % các base tối đa mà có thể bắt cặp bổ sung với các vùng trên các khuôn mẫu khác là 70%  Thông số về nhiệt độ nóng chảy (Tm)  Tm tối ƣu: 64 o C  Dãy Tm chấp nhận đƣợc: 49 – 79 Các primer đơn đạt chuẩn về thành phần và vị trí gắn đối với sợi (+) |STT |Trình tự primer (5' > 3') | bp | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp | P1 | CATGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 25 | 64 | -53 | 56 | 187-211 | | P2 | AGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 24 | 65 | -54 | 58 | 192-215 | | P3 | TAGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 25 | 65 | -55 | 56 | 191-215 | | P4 | TGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 23 | 62 | -50 | 57 | 189-211 | | P5 | ATGTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 24 | 62 | -51 | 54 | 188-211 | | P6 | CGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 22 | 61 | -49 | 59 | 194-215 | | P7 | CATGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 24 | 61 | -50 | 54 | 187-210 | | P8 | GCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 22 | 60 | -49 | 59 | 195-216 | | P9 | AGCGCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 25 | 68 | -57 | 60 | 192-216 | | P10 | GTAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 22 | 59 | -48 | 59 | 190-211 | | P11 | ATGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 23 | 59 | -48 | 52 | 188-210 | | P12 | TGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 24 | 59 | -49 | 42 | 26-49 | | P13 | ATGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 25 | 59 | -50 | 40 | 25-49 | | P14 | GCAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 25 | 59 | -50 | 44 | 21-45 | | P15 | AGCGCAGAGTGATCCATCGG | 20 | 58 | -46 | 60 | 192-211 | | P16 | TAGCGCAGAGTGATCCATCGG | 21 | 58 | -47 | 57 | 191-211 | | P17 | TGTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 22 | 58 | -47 | 55 | 189-210 | | P18 | CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 21 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | | P19 | GCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 21 | 57 | -46 | 57 | 195-215 | | P20 | ACGTTATCTTTGGACACAATCACG | 24 | 56 | -47 | 42 | 256-279 | | P21 | TACGTTATCTTTGGACACAATCACG | 25 | 56 | -48 | 40 | 255-279 | | P22 | CATCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 25 | 56 | -50 | 44 | 206-230 | | P23 | GTAGCGCAGAGTGATCCATCG | 21 | 56 | -45 | 57 | 190-210 | 56 | P24 | GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 23 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | | P25 | CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 24 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | | P26 | CGTTATCTTTGGACACAATCACG | 23 | 55 | -46 | 43 | 257-279 | | P27 | ATCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 24 | 54 | -48 | 42 | 207-230 | | P28 | AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 20 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | | P29 | AGCGCAGAGTGATCCATCG | 19 | 54 | -43 | 58 | 192-210 | | P30 | TAGCGCAGAGTGATCCATCG | 20 | 54 | -44 | 55 | 191-210 | | P31 | TCGGAAGCCATATCTATAAGTGG | 23 | 53 | -47 | 43 | 208-230 | | P32 | CAGAGTGATCCATCGGAAGC | 20 | 53 | -43 | 55 | 196-215 | | P33 | GAGTGATCCATCGGAAGCC | 19 | 52 | -42 | 58 | 198-216 | | P34 | CTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 22 | 52 | -44 | 41 | 28-49 | | P35 | GATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 22 | 52 | -43 | 41 | 24-45 | | P36 | CATGTAGCGCAGAGTGATCC | 20 | 51 | -42 | 55 | 187-206 | | P37 | GTTATCTTTGGACACAATCACG | 22 | 50 | -42 | 41 | 258-279 | | P38 | AGTGATCCATCGGAAGCC | 18 | 50 | -41 | 56 | 199-216 | | P39 | AGAGTGATCCATCGGAAGC | 19 | 49 | -41 | 53 | 197-215 | | P40 | TGAATTTGTCATGTCCAAGG | 20 | 49 | -40 | 40 | 30-49 | | P41 | TGCTTGAATTTGTCATGTCC | 20 | 49 | -40 | 40 | 26-45 Các primer đạt chuẩn về thành phần và vị trí gắn đối với sợi (-) | STT |Trình tự primer (5' > 3') | bp | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp | M1 | GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 25 | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | M2 | TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 25 | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | M3 | TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 25 | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | M4 | CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 24 | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | M5 | GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 24 | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | M6 | GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 24 | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | M7 | GATGTTGCATTATCATCAGAGTGC | 24 | 54 | -45 | 42 | 717-740 | | M8 | CTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 23 | 53 | -46 | 43 | 923-945 | | M9 | CCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 23 | 53 | -46 | 43 | 924-946 | | M10 | TTTATCAACCTCTCCACTGGC | 21 | 52 | -43 | 48 | 748-768 | 57 | M11 | CAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 23 | 52 | -46 | 43 | 920-942 | | M12 | TGCAATAGAGAGGAATAATCGC | 22 | 52 | -45 | 41 | 923-944 | | M13 | TGCACAATCCATCTAGTTTGG | 21 | 51 | -42 | 43 | 699-719 | | M14 | TGTTGCATTATCATCAGAGTGC | 22 | 51 | -42 | 41 | 717-738 | | M15 | GCTTCTAAACAACATTTCTGGC | 22 | 51 | -44 | 41 | 798-819 | | M16 | AATAGAGAGGAATAATCGCTCC | 22 | 49 | -44 | 41 | 920-941 | | M17 | GCAATAGAGAGGAATAATCGC | 21 | 49 | -43 | 43 | 923-943 | | M18 | CTGCAATAGAGAGGAATAATCG | 22 | 49 | -43 | 41 | 924-945 | | M19 | CAGTTTGCTAAATGCCTGC | 19 | 49 | -41 | 47 | 942-960 Các cặp primer đạt chuẩn về vị trí gắn và nhiệt độ Tm | STT Trình tự primer (5' > 3') | Ta | Tm | delG | %GC |Vùng bắt cặp | | |P18 |CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 54 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | |M1 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | | | | | | | | |P8 |GCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 54 | 60 | -49 | 59 | 195-216 | |M3 |TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | | | | | | | | |P6 |CGCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 54 | 61 | -49 | 59 | 194-215 | |M3 |TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | | | | | | | | |P28 |AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | |M6 |GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | | | | | | | | |P19 |GCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 53 | 57 | -46 | 57 | 195-215 | |M3 |TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | | | | | | | | |P18 |CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | |M5 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | | | | | | | | |P18 |CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | |M4 |CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | | | | | | | | |P18 |CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | |M3 |TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | | | | | | | | |P28 |AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | |M5 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | | | | | | | | |P28 |AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | |M4 |CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | | | | | | | | |P19 |GCAGAGTGATCCATCGGAAGC | 53 | 57 | -46 | 57 | 195-215 | |M6 |GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | | | | | | | | |P18 |CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | |M6 |GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | | | | | | | | |P18 |CAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 57 | -46 | 57 | 196-216 | |M2 |TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | | | | | | | | 58 |P28 |AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | |M2 |TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | | | | | | | | |P28 |AGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 54 | -44 | 55 | 197-216 | |M1 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | | | | | | | | |P8 |GCAGAGTGATCCATCGGAAGCC | 53 | 60 | -49 | 59 | 195-216 | |M6 |GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | | | | | | | | |P12 |TGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 54 | 59 | -49 | 42 | 26-49 | |M2 |TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | | | | | | | | |P12 |TGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 54 | 59 | -49 | 42 | 26-49 | |M1 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | | | | | | | | |P12 |TGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 54 | 59 | -49 | 42 | 26-49 | |M3 |TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | | | | | | | | |P24 |GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | |M5 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | | | | | | | | |P24 |GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | |M4 |CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | | | | | | | | |P24 |GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | |M6 |GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | | | | | | | | |P24 |GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | |M3 |TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | | | | | | | | |P24 |GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | |M2 |TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | | | | | | | | |P24 |GCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 56 | -47 | 43 | 27-49 | |M1 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | | | | | | | | |P25 |CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 53 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | |M5 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | | | | | | | | |P25 |CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 53 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | |M4 |CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | | | | | | | | |P25 |CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 53 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | |M6 |GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 55 | -49 | 46 | 920-943 | | | | | | | | | |P25 |CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 53 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | |M3 |TGCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC | | 58 | -51 | 44 | 920-944 | | | | | | | | | |P25 |CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 53 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | |M2 |TGCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 59 | -51 | 44 | 924-948 | | | | | | | | | |P25 |CAGATGCTTGAATTTGTCATGTCC | 53 | 56 | -47 | 42 | 22-45 | |M1 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 59 | -53 | 48 | 923-947 | | | | | | | | | |P13 |ATGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 59 | -50 | 40 | 25-49 | |M5 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | | | | | | | | |P13 |ATGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 59 | -50 | 40 | 25-49 | |M4 |CCTGCAATAGAGAGGAATAATCGC | | 56 | -50 | 46 | 923-946 | | | | | | | | | |P12 |TGCTTGAATTTGTCATGTCCAAGG | 53 | 59 | -49 | 42 | 26-49 | |M5 |GCCTGCAATAGAGAGGAATAATCG | | 56 | -50 | 46 | 924-947 | | | | | | | | | . kiểm tra trên trái ớt, với kết quả nhƣ sau: 67% 33% Không nhiễm Trái nhiễm Đồ thị 4. 3: Tỷ lệ nhiễm TSWV trên trái ớt  Từ những thực tế trên đồng ruộng cho thấy rằng: để phát hiện bệnh mà. chứng nêu trên mới có thể chẩn đoán trên đồng ruộng một cách khá tốt rằng cây ớt có bị nhiễm bệnh TSWV Triệu chứng Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm % mẫu nhiễm Khảm vàng xanh, lá cong 8 3 37, 5 . cds gi| 274 61 077 |gb|AY 070 218.1|[ 274 61 077 ] 2: AB190813 Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence gi|52421192|dbj|AB190813.1|[52421192] 3: D10066 Tomato spotted wilt virus