Luận văn : NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR part 1 ppsx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể Quý Thầy Cô trong Bộ môn đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này. TS. Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này. KS. Phạm Đức Toàn đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này. Các anh, chị đang công tác tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Cô Lê Thị Thu Hà công tác tại trạm Bảo vệ Thực vật huyện Củ Chi đã giúp tôi trong quá trình tìm hiểu tình hình canh tác nông nghiệp trong huyện. Các cô, chú bác nông dân đã tận tình giúp đỡ trong quá trình điều tra thu thập mẫu. Cùng các bạn bè chung lớp đã giúp đỡ tôi. Thành kính ghi ơn Ông bà đã dạy bảo cho con thành người có ích. Cha mẹ đã sinh con, nuôi dạy cho con ăn học để con đạt được kết quả như ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đình Trường iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH TRƢỜNG, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG NHIỄM BỆNH TSWV (Tomato spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG RT – PCR”. Hội đồng hƣớng dẫn: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN Đề tài đƣợc tiến hành tại các xã trong huyện Củ Chi, Trảng Bàng, Châu Thành  Điều tra mức độ nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt, tại các xã trong huyện  Tiến hành lấy mẫu bệnh TSWV tại vùng điều tra và chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA và RT – PCR tại Trung tâm phân tích Thí Nghiệm, Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Nội dung thực hiện:  Điều tra, đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV ngoài đồng bằng sự đánh giá về hình thái.  Lấy mẫu, tiến hành chẩn đoán bằng phƣơng pháp ELISA và RT - PCR, từ đó rút ra kết luận về triệu chứng điển hình của TSWV trên cây ớt. Kết quả đạt đƣợc:  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra - Nhuận Đức: 12,1% - Phƣớc Thạnh: 12,5% - Lộc Hƣng: 0%  Tỷ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng - Lá khảm vàng xanh, cong, héo rũ: 37,5% - Lá chấm vàng xanh, nhăn nheo, co lại, dày, giòn: 57% - Lá khảm nặng có chấm đen, lủng lỗ:53% v - Khảm vàng nhạt trên lá và cả rìa lá: 25%  Tỷ lệ nhiễm trên trái - Trái nhiễm: 33% - Không nhiễm: 67% vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus dDAS-ELISA: direct Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT-PCR: Reverse Transciptase-Polymerase Chain Reaction Genome L: Genome long Genome M: Genome medium Genome S: Genome short N: Nucleocapside cRNA: Complementary RNA vRNA: Virion RNA Tm: Melting temperature Ta: Annealing temperature GSP: Gen Special Primer cDNA: Complementary DNA p-NPP: p-Nitrophenyl phosphate RNAbc: RNA binding column PVP: Polyvinylpyrolydol vii MỤC LỤC Trang Trang tựa ii Cảm tạ iii Tóm tắt iv Danh sách các chữ viết tắt vi Mục lục vii Danh sách các bảng xi Danh sách các đồ thị xi Danh sách các hình xii Danh sách các sơ đồ xii Phần I. Mở Đầu 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục Đích - Yêu cầu 1 1.2.1 Mục đích nghiên cứu 1 1.2.2 Yêu cầu 1 Phần II. Tổng Quan Tài Liệu 2 2.1 Giới thiệu về cây ớt 2 2.1.1 Sơ lƣợc về cây ớt 2 2.1.2 Nguồn gốc cây ớt 2 2.1.3 Đặc điểm thực vật học của cây ớt 2 2.1.3.1 Thân 2 2.1.3.2 Rễ 2 2.1.3.3 Lá 2 2.1.3.4 Hoa 3 2.1.3.5 Quả 3 2.1.3.6 Hạt 3 2.1.4 Giá trị dƣợc liệu của cây ớt 3 2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của ớt 4 2.2 Một số bệnh trên cây ớt gây ra bởi các virút khác 4 2.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây ớt 9 viii 2.3.1 Nhiệt độ 9 2.3.2 Ánh sáng 9 2.3.3 Ẩm độ 9 2.3.4 Đất và dinh dƣỡng 9 2.4. Giới thiệu về Tomato spotted Wilt Virus (TSWV) 10 2.4.1 Sơ lƣợc nguồn gốc TSWV 10 2.4.2 Cấu trúc TSWV 10 2.5 Hình thức tấn công và gây bệnh 13 2.6 Triệu chứng chung trên các loại cây trồng bị nhiễm TSWV 14 2.7 Triệu chứng cụ thể trên cây ớt 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển 16 2.10 Khống chế bệnh TSWV 16 2.11 Chẩn đoán bệnh TSWV 18 2.11.1 Phƣơng pháp cây chỉ thị 18 2.11.1.1 Cây nhiễm bộ phận 18 2.11.1.2 Cây nhiễm hệ thống 18 2.11.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 19 2.12 ELISA 19 2.12.1 Khái niệm về ELISA 19 2.12.2 Phân loại ELISA 20 2.12.2.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 20 2.12.2.2 ELISA gián tiếp 21 2.12.2.3 Sandwich ELISA 21 2.12.2.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 22 2.12.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA 23 2.12.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả ELISA 23 2.13 Giới thiệu về kỹ thuật PCR 23 2.13.1 Nguyên tắc của kỹ thuật PCR 23 2.13.2.Tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 25 2.13.3 Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR 30 2.13.4 Các vấn đề thƣờng gặp trong phản ứng PCR và hƣớng giải quyết 31 ix 2.13.4.1 Có nhiều sản phẩm không chuyên biệt có kích thƣớc dài hơn 31 2.13.4.2 Có nhiều sản phẩm không đặc hiệu với kích thƣớc ngắn hơn 32 2.13.4.3 Không thu đƣợc bất kỳ sản phẩm nào 32 2.13.4.4 Sản phẩm quá yếu 33 2.13.4.5 Hai primer có nhiệt độ Tm khác nhau 33 2.14 Phƣơng pháp RT-PCR 33 2.14.1 Phân loại RT – PCR 33 2.14.1.1 Phản ứng RT – PCR một bƣớc 33 2.14.1.2 Phản ứng RT – PCR hai bƣớc 34 2.14.2 Các phƣơng pháp đƣợc thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA 34 2.15 Những nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới về mức độ gây hại của TSWV 35 2.15.1 Những nghiên cứu tại Việt Nam 35 2.15.2 Những nghiên cứu trên thế giới 35 Phần III. Vật Liệu và Phƣơng Pháp Nghiên Cứu 36 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36 3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu 36 3.3 Phƣơng pháp lấy mẫu 36 3.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán TSWV 37 3.4.1 Chẩn đoán bằng dDAS – ELISA 37 3.4.1.1 Dụng cụ và hoá chất cần thiết cho việc chẩn đoán bằng ELISA 37 3.4.1.2 Các bƣớc thực hiện 37 3.4.2 Chẩn đoán TSWV bằng RT – PCR 39 3.4.2.1 Giai đoạn ly trích RNA theo Kit ly trích của Biorad 39 3.4.2.2 Kiểm tra sự hiện diện của RNA bằng điện di 40 3.4.2.3 Lựa chọn cặp Primer chạy RT – PCR 40 3.4.2.4 Khuếch đại bằng RT – PCR 41 3.4.2.5 Phƣớng pháp đổ gel agarose điện di 43 Phần IV. Kết quả Thảo luận 45 4.1 Mức độ nhiễm bệnh TSWV ở 3 xã đại diện cho 3 huyện qua chẩn đoán ELISA 45 4.1.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo địa bàn điều tra 45 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm TSWV theo từng giống ớt 46 4.1.3 Tỷ lệ nhiễm virút TSWV theo triệu chứng 47 x 4.1.4 Tỷ lệ nhiễm bệnh TSWV theo độ tuổi 50 4.2 Kết quả tiến trình RT – PCR 51 4.2.1 Kết quả kiểm tra RNA 51 4.2.2 Kết quả kiểm tra Primer 52 4.2.3 Kết quả tiến trình RT – PCR 53 4.2.4 Kết quả tiến trình thiết kế primer cho Nested PCR 54 Phần V. Kết luận và đề nghị 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Đề nghị 60 Phần VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHẦN VII. PHỤ LỤC 64 . spotted wilt virus) TRÊN CÂY ỚT BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 200 1- 2 005 Sinh viên thực hiện: . 18 2 .11 .1. 1 Cây nhiễm bộ phận 18 2 .11 .1. 2 Cây nhiễm hệ thống 18 2 .11 .2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 19 2 .12 ELISA 19 2 .12 .1 Khái niệm về ELISA 19 2 .12 .2 Phân loại ELISA. thể trên cây ớt 14 2.8 Con đƣờng lây bệnh và dịch tễ học 15 2.9 Điều kiện cho bệnh phát triển 16 2 .10 Khống chế bệnh TSWV 16 2 .11 Chẩn đoán bệnh TSWV 18 2 .11 .1 Phƣơng pháp cây chỉ thị 18