41 Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro Bước 1: Tăng sinh khối mô sẹo Thí nghiệm 3a : môi trường đặc, Thí nghiệm 3b : môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút), Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức: Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ của TDZ (mg/l) 3.1(đối chứng) VW 0 3.2 VW 0,1 3.3 VW 1,0 3.4 VW 2,0 3.5 VW 3,0 Các chất khác : đường (40 g/l) + nước dừa (200g/l) Có hay không có bổ sung agar (8,6g/l) tùy vào thí nghiệm Bước 2: Phát sinh phôi soma Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường đặc ½ VW. 42 Thí nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Hàm lƣợng (g/l) Khoai tây Than 4.1(đối chứng) MS 0 0 4.2 MS 30 0 4.3 MS 30 1 4.4 ½MS 30 1 4.5 VW 0 0 4.6 VW 30 0 4.7 VW 30 1 4.8 ½VW 30 1 Chất khác : đường (30g/l) + agar (8,6g/l) 43 Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Hàm lƣợng sodium alginate (g/l) 5.1(đối chứng) MS 30 5.2 1/2MS 30 5.3 1/5MS 30 5.4 VW 30 5.5 1/2VW 30 5.6 1/5VW 30 Các chất khác : agar (8,6g/l) + đường (30g/l) Dùng dao phẩu thuật tách rời các phôi hình tim. Dùng pince cấy gắp các phôi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Dùng pipette hút môi trường alginate có chứa phôi nhỏ vào dung dịch CaCl 2 .2H 2 O 100mM. Sau 15 phút dùng pince cấy gắp hạt vào đĩa petri có nước cất vô trùng. Rửa hạt bằng nước cất vô trùng làm sạch lượng CaCl 2 .2H 2 O còn sót lại bên ngoài vỏ hạt. Sau khi thực hiện xong giai đoạn tạo vỏ hạt nhân tạo, hạt được cấy vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng). Quan sát khả năng tái sinh thành cây con của hạt. 44 3.2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi Thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB _Thời gian hình thành mô sẹo (NSC): tính từ ngày cấy chuyền đến khi có 50% mẫu cấy xuất hiện mô sẹo. _Màu sắc của mô sẹo. _Độ cứng của mô sẹo. _% mẫu cấy hình thành mô sẹo: (Số mẫu hình thành mô sẹo / Số mẫu cấy)*100 _% mẫu cấy hình thành mô sẹo+PLB: (Số mẫu vừa hình thành mô sẹo vừa hình thành PLB/ Số mẫu cấy) *100. _% mẫu cấy hình thành PLB: (Số mẫu hình thành PLB / Số mẫu cấy) *100. _% mẫu không phản ứng+mẫu chết: (Số mẫu không phản ứng và số mẫu chết/ Số mẫu cấy) *100. Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo _Hệ số tạo phôi: Số phôi tạo ra / Số mẫu cấy. Thí nghiệm tái sinh cây con từ phôi soma _Tỉ lệ mẫu chết (%): (Số mẫu chết / Số mẫu cấy)*100. _Hệ số nhân chồi: Số chồi tạo ra / Số mẫu cấy. _Số lá /chồi: Tổng số lá / Tổng số chồi. _Số rễ /chồi: Tổng số rễ / Tổng số chồi. _Chiều dài lá (mm). _Chiều dài rễ (mm). Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo _Tỉ lệ nảy mầm: (Số hạt nảy mầm / Số hạt được cấy)*100. Các chỉ tiêu được theo dõi 1 tuần/lần. Số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu. 3.2.2.3 Xử lý số liệu Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 7.0 và Excel. 45 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body) Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 2,4-D là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, còn BA là chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin. Sự kết hợp giữa 2 chất này ở một tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho mẫu cấy có hiệu quả tạo mô sẹo rất cao. Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Nghiệm thức 2,4D (mg/l) BA (mg/l) Thời gian hình thành mô sẹo (NSC) Màu sắc của mô sẹo Độ cứng của mô sẹo 1 (ĐC) 0 0 19.88 Trắng xanh Xốp 2 0,01 0 20.88 Trắng xanh Xốp 3 0,1 0 20.55 Trắng xanh Xốp 4 1 0 20.55 Trắng xanh Xốp 5 0 0.01 19.66 Vàng xanh Chắc 6 0 0.1 19.77 Vàng xanh Chắc 7 0 1 20.00 Vàng xanh Chắc 8 0,1 0.01 20.22 Vàng xanh Chắc 9 0.1 0.1 19.44 Vàng xanh Chắc 10 0.1 1 20.44 Vàng xanh Chắc 11 1 0.01 20.44 Trắng xanh Xốp 12 1 0.1 21.00 Trắng xanh Xốp 13 1 1 20.44 Vàng xanh Chắc 46 Nhận xét: Kết quả cho thấy thời gian hình thành mô sẹo ở nghiệm thức 9 (môi trường VW bổ sung thêm 0.1 mg/l 2,4-D và 0.1 mg/l BA) là sớm nhất: 19.44 NSC. Tuy nhiên không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. Về mặt hình thái của mô sẹo, chúng tôi nhận thấy: Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ. Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì mô sẹo thường có màu vàng xanh và khá chắc. Mô sẹo trắng xốp Mô sẹo vàng xanh Hình 4.1 Màu sắc của mô sẹo 47 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Nghiệm thức 2,4D (mg/l) BA (mg/l) %mẫu cấy hình thành mô sẹo %mẫu cấy hình thành mô sẹo + PLB %mẫu hình thành PLB %mẫu không phản ứng+mẫu chết 1 (ĐC) 0 0 24.44 H 15.55 C 33.33 A 26.68 E 2 0,01 0 46.67 E 13.33 D 8.89 DE 31.11 D 3 0,1 0 53.33 D 15.56 C 6.67 EF 24.44 E 4 1 0 68.89 B 11.11 E 8.89 DE 11.11 G 5 0 0.01 62.22 C 15.56 C 15.56 B 6.67 H 6 0 0.1 48.89 E 22.22 A 11.11 CD 17.78 F 7 0 1 48.89 E 13.33 D 4.44 F 33.34 CD 8 0,1 0.01 80.00 A 8.89 F 6.67 EF 4.44 H 9 0.1 0.1 53.33 D 6.67 G 8.89 DE 31.11 D 10 0.1 1 42.22 F 11.11 E 8.89 DE 37.78 B 11 1 0.01 46.67 E 20.00 B 13.33 BC 20.00 F 12 1 0.1 35.56 G 13.33 D 15.56 B 35.55 BC 13 1 1 22.22 H 6.67 G 6.67 EF 64.45 A CV(%) 4,05 7.7 20 9.7 Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhận xét: Sau khoảng thời gian từ 30 – 45 ngày sau khi cấy, sự đáp ứng của mẫu cấy với các loại môi trường đã có sự khác biệt rõ ràng. Nghiệm thức 1 (đối chứng) có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo thấp, vì ở môi trường không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, PLB có khuynh hướng tăng sinh tạo thêm nhiều PLB mới. 48 Riêng nghiệm thức 13 có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cũng rất thấp, mẫu cấy phát triển yếu nên tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng khá cao (64.45%). Ở nghiệm thức 8 (2,4-D=0.1mg/l kết hợp BA=0.01mg/l) là môi trường có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo lớn nhất: 80% và đây cũng là môi trường có tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng ít nhất (4.44%). Kết luận sơ bộ Ở nghiệm thức đối chứng, PLB cũng có khả năng tạo mô sẹo nhưng còn thấp, chủ yếu là tăng sinh PLB hoặc mẫu không phản ứng. Nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất và tỉ lệ mẫu chết thấp nhất nên thích hợp để tạo mô sẹo lan Hồ Điệp từ PLB. Nghiệm thức 5 chứng tỏ việc sử dụng kết hợp 2,4-D và BA ở nồng độ cao cùng lúc đã gây ức chế quá trình phát triển của mẫu cấy PLB lan Hồ Điệp. Qua kết quả thu nhận được ở thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy: Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì từ protocorm sẽ phát triển thành mô sẹo nhiều hơn và mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ. Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì khả năng hình thành mô sẹo sẽ thấp, còn khả năng tăng sinh protocorm và tái sinh chồi tăng lên. Do đó mô sẹo thường có màu vàng xanh và khá chắc. Ở môi trường mà tỉ lệ 2,4-D và BA quá cao thì mẫu rất dễ chết, khả năng tạo mô sẹo thấp. 49 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Đường đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy mô, đây là nguồn cung cấp carbohydrate chủ yếu, giúp cho cây có khả năng sinh trưởng trong điều kiện in vitro. Bên cạnh đó, nước dừa cũng được sử dụng khá phổ biến do nước dừa có chứa Myo- Inositol, Riboflavin, Axit folic…có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu cấy trong quá trình tạo mô sẹo cũng như tái sinh cây. Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Nghiệm thức Đƣờng (g/l) Nƣớc dừa (ml/l) Thời gian hình thành mô sẹo (NSC) 1 (ĐC) 0 0 0.00 B 2 20 100 21.11 A 3 20 150 20.89 A 4 20 200 19.89 A 5 40 100 21.11 A 6 40 150 20.22 A 7 40 200 20.22 A 8 60 200 20.56 A 9 80 200 20.22 A CV(%) 13.8 Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhận xét: Nghiệm thức 4 có thời gian hình thành mô sẹo sớm nhất, có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng do ở nghiệm thức này không có sự xuất hiện mô sẹo. Bên cạnh đó, nghiệm thức 4 lại không có sự sai khác về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức đối chứng). 50 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Nghiệm thức Đƣờng (g/l) Nƣớc dừa (ml/l) %mẫu cấy hình thành mô sẹo %mẫu cấy hình thành mô sẹo + PLB %mẫu hình thành PLB %mẫu không phản ứng+mẫu chết 1 (ĐC) 0 0 0.00 F 0.00 G 71.11 A 28.89 A 2 20 100 60.00 C 15.56 B 11.11 C 13.33 D 3 20 150 55.56 D 17.78 A 8.89 CD 17.78 C 4 20 200 48.89 E 11.11 C 22.22 B 17.78 C 5 40 100 64.44 BC 8.89 D 8.89 CD 17.78 C 6 40 150 55.56 D 11.11 C 8.89 CD 24.44 B 7 40 200 80.00 A 8.89 D 6.67 D 4.44 E 8 60 200 62.22 BC 6.67 E 2.22 B 28.89 A 9 80 200 66.67 B 4.44 F 2.22 B 26.67 AB CV(%) 4,9 12.3 6.8 10 Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05. Nhận xét: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro, 40 ngày sau cấy chúng tôi nhận thấy, trừ nghiệm thức đối chứng, các nghiệm thức còn lại đều xuất hiện mô sẹo. Mô sẹo ban đầu có màu trắng vàng xốp, sau đó chuyển sang màu vàng xanh và chắc. Trong đó, nghiệm thức 7 (VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa) có tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất: 80% mẫu, có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng: không có mẫu nào hình thành mô sẹo. Ngoài ra, nghiệm thức đối chứng còn có tỉ lệ mẫu không phản ứng và mẫu chết cao nhất (28.89%). Ngược lại, nghiệm thức 7 có tỉ lệ mẫu chết thấp nhất (4.44%). . alginate (g/l) 5. 1(đối chứng) MS 30 5. 2 1/2MS 30 5. 3 1/5MS 30 5. 4 VW 30 5. 5 1/2VW 30 5. 6 1/5VW 30 Các chất khác : agar (8,6g/l) + đường (30g/l) Dùng dao phẩu thuật tách. không phản ứng và số mẫu chết/ Số mẫu cấy) *100. Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo _Hệ số tạo phôi: Số phôi tạo ra / Số mẫu cấy. Thí nghiệm tái sinh cây con từ phôi soma _Tỉ lệ. chết (% ): (Số mẫu chết / Số mẫu cấy)*100. _Hệ số nhân chồi: Số chồi tạo ra / Số mẫu cấy. _Số lá /chồi: Tổng số lá / Tổng số chồi. _Số rễ /chồi: Tổng số rễ / Tổng số chồi. _Chiều dài lá (mm).