31 2.6 Công nghệ tạo hạt nhân tạo 2.6.6 Khái niệm về hạt nhân tạo Hình 2.9 Hạt nhân tạo 32 Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để nói đến các phôi vô tính hoặc các thể nhân giống khác được bao lấy bởi một lớp gel mang chất dinh dưỡng, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài, vận chuyển trở nên dễ dàng hơn. Khái niệm được đưa ra lần đầu tiên bởi Murashige vào năm 1978. Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phôi vô tính có vai trò rất quan trọng trong việc trồng trọt ở những loài thực vật : (1) Không tạo được hạt (2) Hạt được tạo thành với một số lượng thấp (3) Khả năng hạt sống sót thấp (4) Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản được. 2.6.2 Mục đích của sự ra đời công nghệ hạt nhân tạo Sự biểu hiện thành công của việc tái sinh cây thông qua sự hình thành phôi vô tính ở một vài loài thực vật đã mở ra một phạm vi ứng dụng mới đó là tạo hạt nhân tạo nhằm tạo một hệ thống vận chuyển dễ dàng cho việc gieo trực tiếp phôi lên đất trồng. Khả năng tái sinh cây của một số loài thực vật từ phôi vô tính và sự thích hợp khí hậu sau đó của cây là một trong những yếu tố khó khăn nhất nhằm đạt đến thành công trong việc tạo hạt này. Phôi vô tính được tạo thành in vitro thiếu một vỏ bao ngoài và có khuynh hướng nẩy mầm ngay tức khắc (nếu phôi đã trưởng thành) dưới những điều kiện tối ưu hoặc có thể chuyển vào trạng thái thụ động nếu bị thiếu nước (Litz và Gray, 1992). Ngược lại phôi hợp tử với vỏ bao bên ngoài có một khả năng chịu hạn rất cao (Senaratna và csv, 1990, 1995; Teng và Hor, 1997). Do đó, cần có một hệ thống để cảm ứng phôi vô tính sao cho nó hoạt động giống phôi hợp tử, và từ đó có thể chịu đựng được những tổn hại ở mức tối thiểu. 33 2.6.3 Qui trình tạo hạt nhân tạo Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu tạo hạt nhân tạo Với nguyên liệu là chồi (shootbud) Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thước 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro. Với nguyên liệu là phôi vô tính Dùng dao tách rời các phôi hình tim. 34 Bước 2. Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Bước 3 Dùng pipette 10ml hút môi trường alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào dung dịch CaCl 2 .2H 2 O 100mM trong 15 phút. Somatic embryos formed from cultured plant parts are ideal for artificial seed production. Bước 4. Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nước cất vô trùng để làm sạch lượng CaCl 2 .H 2 O còn sót lại. Bước 5. Cấy hạt nhân tạo vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng). 35 2.6.4 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém. Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ. Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ phôi đến cây con cao. Quá trình làm vỏ bọc cho phôi chỉ quan trọng trong sự vận chuyển phôi, nó không phải là một nhân tố làm giới hạn sự phát triển của hạt nhân tạo. Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993). Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn thương bên ngoài. 2.6.5 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998). 36 Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl 2 .2H 2 O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na + có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca 2+ có trong hỗn hợp CaCl 2 .2H 2 O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion Na + trao đổi với ion Ca 2+ . Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl 2 .2H 2 O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất. Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. 37 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Sinh học của Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thí nghiệm từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. 3.2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu Dụng cụ Tủ cấy, nồi hấp vô trùng, máy lắc, bình tam giác dung tích 300 ml, đĩa inox và các dụng cụ khác. Dụng cụ nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1,2 atm, 121 o C trong 25 phút. Mẫu cấy PLB (protocorm like body) cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) in vitro. Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm được thực hiện trên 2 môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) và VW (Vacin và Went, 1949). Môi trường được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP, 2,4D, TDZ, và các chất khác (khoai tây, nước dừa, đường, than hoạt tính) tùy theo mỗi nghiệm thức thí nghiệm. pH môi trường 5,7. Thể tích môi trường là 70ml/bình tam giác. Bột sodium alginate, agar được dùng tạo gel và dung dịch CaCl 2 .2H 2 O 100mM giúp tạo vỏ cứng cho hạt. Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2 atm, nhiệt độ 121 0 C trong 20 phút. Điều kiện nuôi cấy Phòng dưỡng cây có nhiệt độ 25 0 C± 2 0 C, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ chiếu sáng 2.500 lux, ẩm độ 75-80%. 38 3.2.2 Phương pháp 3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm Thực hiện 5 thí nghiệm theo các giai đoạn sau : - Giai đoạn 1 : tạo mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 2 : tạo phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 3 : tạo cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh từ phôi soma. - Giai đoạn 4 : tạo hạt nhân tạo từ phôi soma và tạo cây hoàn chỉnh từ hạt nhân tạo. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 mẫu. Tổng số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu. 39 Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body) Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm gồm 13 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ (mg/l) 2,4-D BAP 1.1(đối chứng) VW 0 0 1.2 VW 0,01 0 1.3 VW 0,1 0 1.4 VW 1 0 1.5 VW 0 0,01 1.6 VW 0 0,1 1.7 VW 0 1 1.8 VW 0,1 0,01 1.9 VW 0.1 0.1 1.10 VW 0.1 1 1.11 VW 1 0.01 1.12 VW 1 0.1 1.13 VW 1 1 Các chất khác agar (8,6g/l) + sucrose (40g/l) + nước dừa (200ml/l) + than (1g/l) 40 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức: Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ Đƣờng (mg/l) Nƣớc dừa (ml/l) 2.1(đối chứng) VW 0 0 2.2 VW 20 100 2.3 VW 20 150 2.4 VW 20 200 2.5 VW 40 100 2.6 VW 40 150 2.7 VW 40 200 2.8 VW 60 200 2.9 VW 80 200 Các chất khác 2,4-D (0,1 mg/l) + BAP (0.01 mg/l) + agar (8,6 g/l) + than(1 g/l) . giai đoạn sau : - Giai đoạn 1 : tạo mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 2 : tạo phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 3 : tạo cây lan Hồ Điệp in vitro. 2.6 Công nghệ tạo hạt nhân tạo 2.6.6 Khái niệm về hạt nhân tạo Hình 2.9 Hạt nhân tạo 32 Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là một thuật ngữ được dùng để nói đến các phôi vô tính. đoạn 3 : tạo cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh từ phôi soma. - Giai đoạn 4 : tạo hạt nhân tạo từ phôi soma và tạo cây hoàn chỉnh từ hạt nhân tạo. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn