1 1 Phần 1. Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Từ lâu hoa Lan đã được tôn vinh là “Mỹ Nữ Sơn Lâm” của các loài hoa, đây không chỉ là một loại hoa vương giả có vẻ đẹp lộng lẫy, mê hồn mà còn tượng trưng cho bản tính hướng thiện của con người. Trong dân gian, đã lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến loài hoa này. Người đầu tiên ca ngợi hoa Lan là đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa Lan là loài hoa quân tử Và trước đó nữa, vua Thần Nông (Trung Quốc - 2800 B.C) đã dùng hoa Lan trị bệnh như là một liều thuốc tiên, nên từ đó dân gian đã âm thầm gọi hoa Lan là vua của các loài hoa Tương truyền nước ta cũng có kể rằng: khi vua Trần Nhân Tông rời kinh thành về Yên Tử, Quảng Ninh trong đêm ngủ mộng Ngài thấy có người đến yết kiến và dâng tặng một giò hoa rất đẹp. Sáng ra, nghi nghi hoặc hoặc hoặc nhà vua đi sâu vào trong núi thì bắt gặp tại một khe sâu có một loài hoa lạ, đẹp và vô cùng thuần khiết. Đời sau người ta gọi loài hoa này là lan Trần mộng (giấc mộng của vua Trần) để chỉ điển tích rũ sạch bụi trần bước vào cõi thiền thuần khiết của Ngài. Do đó, thú chơi Lan mang một ý nghĩa rất đặc biệt, bởi khi chăm Lan người ta không chỉ chăm chút cái đẹp cho hoa mà còn đang dưỡng một cái Tâm trong sáng cho mình. Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu muôn vẻ của các loài lan như Cattleya, Hồ Điệp , Dendrobium, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium Hoa lan được ưa chuộng phải chăng bởi đó là biểu tượng của niềm khát khao cuộc sống phong lưu và hạnh phúc bền bỉ. Hoa lan là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh trong nước cũng như xuất khẩu. Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển rất mạnh, Thái Lan là nước xuất khẩu lan nhiều nhất thế giới (có đến 1.000 giống hoa lan), tại Malaysia thì chính 2 phủ đã qui hoạch hẳn 300 ha đất ở Johor và giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan ở Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu hằng năm hơn 9,3 tỷ đài tệ. Ở Việt Nam, nghề trồng Lan phát triển chậm hơn các nước rất nhiều. Việc trồng lan trên địa bàn TP.HCM lâu nay chủ yếu là do tự phát nên diện tích trồng còn nhỏ và trình độ tay nghề nông dân chưa đồng đều, ngoài ra người trồng lan vẫn chưa chủ động được nguồn giống, vì vậy việc trồng lan rất khó khăn, đặc biệt là trồng lan Hồ Điệp. Loại lan này trồng rất khó và phải đầu tư lớn, từ việc cung cấp dưỡng chất và giữ ẩm cho cây đến thiết bị nhà ươm, chăm sóc… đều phải nhập ngoại và chịu thuế khá cao. Đặc biệt, sau 2 năm trở đi cây mới cho thu hoạch thì có thể lúc đó thị trường đã bão hòa, lợi nhuận thu được không tương xứng với vốn và công sức bỏ ra. Theo tình hình đó đã có nhiều công trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp nhằm tạo ra nguồn hoa mới ổn định. Từ nuôi cấy mô, nguồn gene từ các dòng lan sưu tập sẽ được lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống, đồng thời tổ chức nhân nhanh để cung cấp cho nhu cầu thị trường trong và ngoài nước. Tuy đã có một số thành tựu đáng kể nhưng thực tế vẫn còn nhiều hạn chế như chất lượng giống không đồng đều và không thể thực hiện trên quy mô lớn. Dựa vào thực tế đã nêu trên, với đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. )”, chúng tôi mong muốn góp một phần vào nền công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp. Trong đề tài này, lan Hồ Điệp được sản xuất bằng phương pháp nhân giống in vitro tốc độ cao tạo cây giống có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó, có thể cho ra đời nhiều giống cây hoa lan Hồ Điệp mới có chất lượng tốt để ngày càng đáp ứng được nhu cầu của những người yêu hoa Lan. Hiện nay trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phôi soma đã đạt được những thành công nhất định trên thực vật hai lá mầm, trong khi ở những cây một lá mầm vẫn còn gặp nhiều khó khăn. Vì những ứng dụng tốt đẹp mà phôi soma có thể mang lại, trong đề tài này chúng tôi thử nghiệm một phương pháp tạo phôi soma trên cây hoa lan Hồ Điệp sao cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản và hiệu quả. Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp, chúng tôi đi xa hơn nữa, bằng cách sử dụng các phôi soma ấy để tạo hạt nhân tạo. Công nghệ hạt 3 nhân tạo là phương pháp tạo một dạng hạt mô phỏng hạt tự nhiên, có một phôi sinh dưỡng hoặc "chồi ngủ" được bọc trong một lớp dung dịch alginate (một chất có tác dụng tạo lớp vỏ cứng bên ngoài cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phôi này sau đó nảy mầm thành cây con hoàn chỉnh. Đây là một vấn đề đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm trong ứng dụng bảo quản phôi vô tính, chất mầm thực vật dài hạn. Đồng thời mở ra một hướng mới cho việc sử dụng những hạt vô tính thay cho các hạt hữu tính có khả năng nẩy mầm thấp và không đồng loạt. Khi thực hiện đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ mang đến những hiểu biết mới về quá trình hình thành phôi vô tính trên cây lan Hồ Điệp nói riêng và hoa lan nói chung, đồng thời đem lại những ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật tại Việt Nam. 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Tìm hiểu vai trò tác động của chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành mô sẹo cũng như phát sinh phôi soma của cây lan Hồ Điệp. - Tạo hạt nhân tạo có ý nghĩa trong công tác duy trì nguồn mẫu, nguồn gen thực vật quí hiếm trong một thời gian dài phục vụ cho những mục đích sử dụng khác trong tương lai. - Làm cơ sở cho việc kiểm chứng sự khác nhau giữa cây hoa lan Hồ Điệp in vitro có nguồn gốc từ phôi soma với cây hoa lan Hồ Điệp từ các nguồn mô khác. - Làm cơ sở để nghiên cứu tiếp khả năng tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma của các loại cây thân thảo một lá mầm khác. 1.2.2 Yêu cầu - Tạo được cây hoa lan Hồ Điệp có đặc điểm về kiểu gen và kiểu hình đồng nhất với nguồn mẫu ban đầu. Từ đó, có thể tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành cây con. - Hình thành quy trình nhân giống vô tính in vitro và tạo hạt nhân tạo cây hoa lan Hồ Điệp, để góp phần nghiên cứu giải quyết nhu cầu giống phục vụ cho việc tiêu thụ hoa trong nước và xuất khẩu. 4 Phần 2 Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu về cây lan Hồ Điệp Cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) là loại cây đơn trục sống biểu sinh, thuộc : Ngành : Hạt kín (Angiospermae). Lớp : Một lá mầm (Monocotyledoneae). Bộ : Lan (Orchidales). Họ : Phong lan (Orchidaceae). Cây phong lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện khí hậu Việt Nam. Hồ Điệp có hoa đẹp, đa dạng, màu sắc phong phú lại lâu tàn, trung bình trên mỗi phát hoa có từ 7 – 15 hoa, thời gian hoa tươi trên cây kéo dài từ 3 – 4 tháng. Đó là tính chất hơn hẳn của phong lan Hồ Điệp so với các loại phong lan khác, giúp cho lan Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nước ngoài. Khả năng tự sinh cây lan con trong thiên nhiên rất thấp. Thông thường để tạo số lượng lớn cây con của giống lan này, người ta dùng phương pháp gieo hạt trong nuôi cấy in vitro. Tuy nhiên những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều, lâu trổ hoa, các đặc điểm của hoa không thuần nhất. Nhân giống bằng con đường tạo mô sẹo và phát sinh phôi soma có thể khắc phục các nhược điểm trên. 2.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố Cây phong lan Hồ Điệp có nguồn gốc ở Tây Nam Châu Á, trải rộng trên những vùng núi cao ở Trung Quốc và Tây Tạng đến Châu Úc, trên vùng kinh tuyến bao gồm giữa Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương. Người ta còn gặp giống này ở Sumatra, Bornéo, Célèbes, Nouvelle Calédonie (Marry Noble, 1971). Đây là những cây sống biểu sinh, trên những cây cao trong rừng dầy có ẩm độ cao hoặc rất gần đất, trên những cây nhỡ (arbuter), hay sống bám trên những hốc đá, hay trên những đám rêu dày, một vài loài sống ở vùng ven biển. Lan Hồ Điệp ít thích hợp với nắng hơn so với những loại phong lan có giả hành. Nhiệt độ thích hợp cho sự 5 tăng trưởng và phát triển là 15 o C – 38 o C và giống này thường sống ở cao độ 200m- 400m (William và Kramer, 1983). Tên Phalaenopsis có nguồn gốc từ Phalaina (phalène) và d’Opsis (apparence), được Blume (nhà thực vật học người Hà Lan) đặt vào năm 1852 khi ông khám phá một loài lan đặc biệt có hoa giống cánh bướm, đó là Phalaenopsis amabilis. Đa số các tác giả đều đồng ý xếp chi Hồ Điệp có một nhụy, kiểu phát hoa bên và có cấu tạo đơn trục. Trong chi này có khoảng 70 loài, được phân bố trong những vùng và khu vực khác nhau. Các loài này thường xuyên lai chéo với nhau, do đó phả hệ của những cây nhận được cũng rất phức tạp. Thế hệ con cháu của chúng cũng không thuần nhất. Tuy nhiên sự lai tạo đưa đến một lợi ích lớn để cung cấp những cá thể luôn đổi mới và những đặc tính quyến rũ của hoa (Perlz, 1974). 2.1.2 Vị trí lan Hồ Điệp trên thị trường So với đa số các loại lan trên thị trường hiện nay, thì lan Hồ Điệp nổi bật hơn, bởi các đặc tính của hoa đa dạng, màu sắc phong phú, hoa lâu tàn, trung bình hoa tươi trên cành có thể kéo dài từ 3-4 tháng (Broly, 1982). Trục phát hoa dài, đường kính to, mang nhiều hoa to, trung bình 7-15 hoa, do đó rất thuận lợi cho việc trang trí, và có thể cắt cành xuất khẩu, chuyên chở xa mà không ảnh hưởng đến chất lượng hoa. Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao hơn một số giống lan khác. Nếu biết dùng biện pháp kỹ thuật để thúc đẩy việc ra hoa sớm thì sẽ có lợi nhiều trong việc kinh doanh. 6 Hình 2.1 Một số loại lan Hồ Điệp phổ biến. 7 2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Khái niệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 2.2.2 Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai cây khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum). 8 Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện. Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá. Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơnđã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. 2.2.3 Ứng dụng Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar. Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng: - Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh. - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh. - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến. - Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn. - Lai xa. - Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast. - Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai. - Cố định nitrogen. - Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp. - Bảo quản nguồn gen quý. 9 2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra trong môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là những tế bào vô tổ chức có màu trắng. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao. Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô sẹo này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ. Nuôi cấy protoplast- chuyển gen Protoplast (tế bào trần ), thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi trường thích hợp các protoplast 10 có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài. Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác. Nuôi cấy tế bào đơn bội Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này xử lý colchicin để tạo thành cây đa bội. 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trong nuôi cấy in vitro 2.3.1 Chất điều hoà sinh trưởng Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật. Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng: (1) Auxin Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. . đề tài Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp. ) , chúng tôi mong muốn góp một phần vào nền công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp. Trong. (Phalaenopsis sp. ) là loại cây đơn trục sống biểu sinh, thuộc : Ngành : Hạt kín (Angiospermae). Lớp : Một lá mầm (Monocotyledoneae). Bộ : Lan (Orchidales). Họ : Phong lan (Orchidaceae). Cây phong lan. lan Hồ Điệp sao cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản và hiệu quả. Từ kết quả thu nhận được trong việc tạo phôi soma cây lan Hồ Điệp, chúng tôi đi xa hơn nữa, bằng cách sử dụng các phôi