37 CFU/g từ dịch gan chuột. Sau khi tái xâm nhiễm chúng có khả năng duy trì trong dạ dày đến 14 ngày. Sau 6 ngày có thể tìm thấy vi sinh vật này nhiễm trong khắp các cơ quan đã khảo sát như gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già. Chúng không bị đào thải trong suốt 14 ngày theo dõi. Mật độ chúng nhiễm vào các cơ quan này cao hơn so với khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo BHI. Mật độ Salmonella tái nhiễm trong gan và lách cao hơn với mật độ tế bào gây nhiễm vào ban đầu, chứng tỏ Salmonella đã tăng trưởng lên sau khi xâm nhiễm vào các cơ quan này. Từ các kết quả trên có thể kết luận rằng chủng S. enteritidis 99.303 khi phát triển trong môi trường in vivo có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh mạnh hơn so với khi nuôi cấy chúng trên môi trường nhân tạo (in vitro). Nói cách khác là độc lực của nó đã được tăng lên khi chúng được một lần sống sót và thích nghi với các các điều kiện chống cự của cơ thể vật chủ. Hiện tượng này có thể là do: (1) Chủng Salmonella đã thích nghi với khả năng xâm nhiễm, (2) Môi trường in vivo đã hoạt hóa các gen gây độc ở Salmonella trong khi các gen này bị kìm hãm khi nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo, (3) Chủng S. enteritidis 99.303 gốc có độc lực đã giảm do thời gian bảo quản và cấy chuyền nhiều lần. 4.3.2.2. Khả năng tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột của chủng Salmonella từ thực phẩm Cách tiến hành thí nghiệm tương tự như chủng Salmonella từ bệnh phẩm. Chủng Salmonella từ thực phẩm được dùng trong khảo sát là Salmonella SP1a. Chủng Salmonella này cũng được cho xâm nhiễm vào chuột, nuôi chuột bị nhiễm sau 3 – 4 ngày, dịch gan chuột bị nhiễm được định lượng Salmonella và được tái gây nhiễm vào chuột . Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 4.8 và Biểu đồ 4.4. Bảng 4.8. Mật độ Salmonella SP1a tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột theo thời gian Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Thời gian sau khi nhiễm Mật độ Salmonella (CFU/g) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già 5,5 x 10 3 3 ngày 0 0 2,0 x 10 2 0 0 6 ngày 5,5 x 10 1 1,5 x 10 2 90 0 0 9 ngày 4,2 x 10 3 9,8 x 10 3 0 0 0 12 ngày 0 0 0 0 0 38 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 3 6 9 12 NGÀY MẬT ĐỘ XÂM NHIỄM (logN) Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già Biểu đồ 4.4. Khả năng tái xâm nhiễm của chủng Salmonella SP1a từ dịch gan vào hệ tiêu hóa Qua kết quả thể hiện ở Bảng 4.8 và Biểu đồ 4.4 cho thấy chủng Salmonella SP1a có khả năng tái nhiễm thì có khả năng sống sót trong dạ dày đến ngày thứ 6 và duy trì trong gan và lách đến ngày thứ 9. Mật độ nhiễm vào gan vào lách cao hơn so với khi nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo BHI, thậm chí cao hơn mật độ tế bào đã nhiễm ban đầu. Như vậy, chúng đã có khả năng tăng trưởng bệnh trong các cơ quan này. Song chúng vẫn không được tìm thấy trong ruột non và ruột già. Qua 12 ngày, Salmonella xâm nhiễm trong các cơ quan này bị đào thải hoàn toàn. Về biểu hiện bệnh lý, mặc dù Salmonella được tái nhiễm vào gan và lách mạnh hơn so với ban đầu nhưng vẫn không có khả năng biểu hiện bệnh ở chuột. Qua kết quả này cho thấy rằng, mặc dù chủng Salmonella SP1a đã được trải qua sự thích nghi trong môi trường vật chủ (in vivo) nhưng độc lực của chúng cũng rất kém, chúng vẫn bị hệ thống phòng vệ của vật chủ loại bỏ khỏi cơ thể. 4.3.2.3. So sánh khả năng tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột của S. enteritidis 99.303 và Salmonella SP1a Căn cứ vào kết quả ở Bảng 4.7 và Bảng 4.8 cho thấy chủng S. enteritidis 99.303 có khả năng xâm nhiễm vào toàn bộ các bộ phận ta khảo sát như gan, lách, dạ 39 dày, ruột non và ruột già với mật độ tương đối cao so với mật độ tế bào đã nhiễm vào ban đầu. Trong khi đó, chủng Salmonella SP1a chỉ có thể nhiễm vào gan, lách và không có khả năng bám vào thành ruột non, ruột già. Ở dạ dày, chủng S. enteritidis 99.303 từ bệnh phẩm có thời gian tồn tại lâu hơn so với chủng Salmonella SP1a từ thực phẩm. Sau 12 ngày gây nhiễm, chủng Salmonella SP1a bị đào thải hoàn toàn. Trong khi đó chủng S. enteritidis 99.303 vẫn duy trì được mật độ xâm nhiễm cao trong các cơ quan của hệ tiêu hóa chuột. Các kết quả trên cho thấy cả 2 chủng Salmonella từ bệnh phẩm và thực phẩm sau khi tái nhiễm đều có khả năng xâm nhiễm vào gan và lách mạnh hơn so với ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo BHI. Từ đó có thể kết luận rằng các chủng Salmonella có nguồn gốc từ môi trường in vivo có khả năng xâm nhiễm và thích nghi mạnh hơn so với khi phân lập từ môi trường in vitro. 4.4. SỰ TÁC ĐỘNG CỦA MÔI TRƢỜNG XUNG QUANH ĐẾN CÁC KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Để khẳng định Salmonella nhiễm và gây bệnh cho chuột có nguồn gốc từ sự gây nhiễm, không có sự nhiễm bẩn từ các yếu tố bên ngoài, trong các lô thí nghiệm chúng tôi đều tiến hành phân tích Salmonella trong thức ăn và nước uống của chuột. Bên cạnh đó, trong mỗi lô thí nghiệm đều có chuột dùng làm đối chứng âm, là chuột được cho uống nước đã hấp vô trùng thay cho dịch vi khuẩn. Chuột dùng làm đối chứng âm được nuôi cách biệt với các chuột được gây nhiễm, các điều kiện và khảo sát đều được thực hiện tương tự như lô thí nghiệm. Kết quả cho thấy các yếu tố bên ngoài như thức ăn, nước uống, môi trường nuôi chuột đều không bị nhiễm Salmonella. Các chuột trong lô đối chứng âm đều không có dấu hiệu bệnh lý, chúng vẫn khỏe mạnh, nhanh nhẹn và tăng trọng. Kết quả khảo sát ở các cơ quan của hệ tiêu hóa như gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già cũng cho thấy không có sự hiện diện của Salmonella. Qua kết quả trên, chúng ta có thể loại bỏ khả năng xâm nhiễm Salmonella do các yếu tố bên ngoài như thức ăn, nước uống, môi trường xung quanh. 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Những nghiên cứu đã thực hiện như trên là bước đầu so sánh sự khác nhau về khả năng xâm nhiễm, gây bệnh và gây chết chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Từ kết quả đã nhận được cho phép chúng tôi rút ra những kết luận như sau: - Có sự khác biệt rõ rệt về khả năng xâm nhiễm, gây bệnh và gây chết giữa các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả năng gây bệnh và gây chết chuột. Trong khi đó ở 10 chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì có 2/10 chủng có khả năng gây bệnh còn 8/10 chủng là không có khả năng gây bệnh, không có chủng nào có khả năng gây chết chuột. Như vậy các chủng Salmonella từ bệnh phẩm có độc lực mạnh hơn chủng từ thực phẩm. - Có sự khác biệt về khả năng xâm nhiễm vào gan và lách của chuột ở các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng từ bệnh phẩm đều có khả năng xâm nhiễm vào cả gan và lách chuột. 5/10 chủng từ thực phẩm mới có khả năng xâm nhiễm vào. Hầu như không có sự khác biệt về khả năng xâm nhiễm vào dạ dày, ruột non và ruột già giữa các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. - Các chủng Salmonella nuôi cấy trong môi trường tổng hợp nhân tạo có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh kém hơn so với khi chủng đã qua giai đoạn sinh trưởng ở môi trường tự nhiên trong nội tạng của chuột. 5.2. ĐỀ NGHỊ Nếu nghiên cứu này được thực hiện tiếp tục, chúng tôi đề nghị được tiến hành với các nội dung sau: - Nghiên cứu thời gian Salmonella bị đào thải hoàn toàn ra khỏi cơ thể chuột nếu chủng đó không gây bệnh và chưa đủ liều gây chết chuột. - Tiến hành khảo sát các chủng Salmonella với số lượng lớn hơn, đặc biệt là các chủng Salmonella từ thực phẩm và môi trường. 41 - Nghiên cứu sự khác biệt di truyền, sự biểu hiện của các gen tham gia trong quá trình xâm nhiễm và gây bệnh ở các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và Salmonella từ thực phẩm, môi trường. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Mai Chí Cần, 2002. Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli, Salmonella và nấm phổi trên gà một ngày tuổi. Khóa luận tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 2. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh và Nguyễn Quang Tuyên, 2001. Kết quả phân lập và xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella spp. gây bệnh phó thương hàn lợn ở một số tỉnh miền núi phía Bắc. Khoa học kỹ thuật Thú y, 8 (3): 10 – 19. 3. Nguyễn Hoàng Dũng, 2004. Bước đầu nghiên cứu so sánh khả năng gây bệnh của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm và bệnh phẩm. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Tiến Dũng, 2002. Phát hiện phân biệt Salmonella spp., Salmonella enterica I trong thủy sản, nước tự nhiên. Luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Vi sinh, Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh. 5. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Hoàng Dũng và Trần Linh Thước, 2005. Nghiên cứu độc lực trên chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2 (2): 157-168. 6. Vương Thị Việt Hoa, 2002. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Khoa Công Nghệ Thực Phẩm - Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 7. Đinh Nam Lâm, 1999. Nghiên cứu vi khuẩn học tình hình nhiễm Salmonella trên vịt. Luận án Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 8. Dương Thanh Liêm và Dương Thị Lê Hà, 2003. Dinh dưỡng và sức khỏe vệ sinh an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thị Oanh và Phùng Quốc Chướng, 2003. Tình hình ô nhiễm Salmonella và một số đặc tính gây bệnh của Salmonella phân lập trên trâu bò tại Đak Lak. Khoa học kỹ thuật Thú y, 10 (2): 26 – 32. 10. Trần Thanh Phong, 1996. Bệnh truyền nhiễm do vi trùng trên heo. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 11. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật học thú y. Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 12. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục, TP. Hồ Chí Minh. 43 13. Võ Thị Bích Thủy, Trần Thị Hạnh và Lưu Quỳnh Hương, 2002. Tình trạng ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm nguồn gốc động vật trên địa bàn Hà Nội. Khoa học kỹ thuật Thú y, 9 (1): 18 - 23. 14. Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức và Nguyễn Văn Dịp, 2003. Kỹ thuật kiểm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 15. Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 16. Bộ Y tế, 2001. Vi sinh vật y học. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 17. Trần Cẩm Vân, 2002. Giáo trình vi sinh học môi trường. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. TÀI LIỆU TỪ MẠNG INTERNET 18. Centers for Disease Control. Salmonellosis. USA, September 2004 http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/salmonellosis_g.htm 19. Centers for Disease Control. How can I prevent Salmonella infection?. USA, 1996. http://www.marlerclark.com/ 20. Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm: vẫn rất đáng lo ngại! http://www.tuoitre.com.vn/Tianyon/Index.aspx?SearchQuery=%22S.%22&search Submit%3AcboInputMethod=0 21. Haghjoo E, Galan JE. Salmonella typhi encodes a functional cytolethal distending toxin that is delivered into host cells by a bacterial-internalization pathway. Section of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, New Haven, CT 06536, USA, March 2004. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_ uids=10531212&dopt=Abstract 22. Hands Hedrich. The laboratory mouse. Institute for Laboratory Animal Science, Hanover Medical School, Germany, Jun 2005. http://books.elsevier.com/bookscat/links/details.asp?isbn=0123364256 23. Houston CW, Koo FC, Peterson JW. Characterization of Salmonella toxin released by mitomycin C-treated cells. American Society for microbiology, may 1981. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_ uids=6788702&dopt=Abstract 24. Intestinal Bacteria- Salmonella http://www.saintfrancicare.com/13624.cfm 44 25. Kenneth Todar . Salmonella and Salmonellosis. University of Wisconsin- Madison Department of Bacteriology, 2005. http://texbookofbacteriology.net/Salmonella.html 26. Lu S, Manges AR, Xu Y, Fang FC, Riley LW. Analysis of virulence of clinical isolates of Salmonella enteritidis in vivo and in vitro. November, 1999. http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&term=”Ma nges+AR” 27. Malik P, Sharma VD, Thapliyal DC. Partial purification and characterization of Salmonella cytotoxin. University of Agriculture and Technology, India. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8 861639&dopt=Abstract 28.Murugkar HV, Rahman H, Dutta PK. Distribution of virulence genes in Salmonella serovars isolated from man & animals. Indian Joural o Medical Research, Feb 2003. http://www.findauticleu.com/p/auticleu/mi_qa3867/i_200302 28. Ralph A. Giannella. Salmonella. Walter Reed Army Institute of Research, Washington, USA. Medmicro Chapter 21.htm 29. Rosalyn Carson-DeWitt MD. Salmonella food poisoning. CDC, USA, December, 2002 http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol10no4/03-0417.htm 30. Wallace H. Andrews and Thomas S. Hammack. Salmonella spp. Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook, January 1992. http://vm.cfsan.fda.gov/ ebam/bam-5.html TIẾNG ANH 31. Daniel P. S., John D. S., and J. Vivian Wells, 1987. Basic & Clinical Immunology. Prentice-Hall International, Inc, USA. p. 555. 32. Jay J. M., 2000. Modern food Microbiology. An Arpen publication, Maryland. p. 511 - 528. 33. Quinn P. J., Carter M. E., Markey B. K., and Carter G. R. Clinical veterinary microbiology. p. 226 - 234. 34. William B., Robert M. L., and John W. R., 1968. The enteric Bacilli - The Salmonella group. The pathogenic microorganisms. W.B Saunders Company, USA. p. 495 – 513. . giữa các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả năng gây bệnh và gây chết chuột. Trong khi đó ở 10 chủng Salmonella có. có nguồn gốc từ thực phẩm thì có 2/10 chủng có khả năng gây bệnh còn 8/10 chủng là không có khả năng gây bệnh, không có chủng nào có khả năng gây chết chuột. Như vậy các chủng Salmonella từ bệnh. bệnh phẩm có độc lực mạnh hơn chủng từ thực phẩm. - Có sự khác biệt về khả năng xâm nhiễm vào gan và lách của chuột ở các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng từ bệnh phẩm