Phân lập và tuyển chọn một số chủng bacillus thuringiensis có độc tính cao đối với côn trùng hại cây trồng

LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Thị Thu Hằng – Bộ môn Giống Công nghệ Sinh học – Khoa Lâm học – Trường Đại học Lâm nghiệp tận tình trực tiếp hướng dẫn bảo trình thực khóa luận Tơi xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp giảng dạy cho tảng kiến thức vững để tiếp thu tốt kiến thức khoa học tạo cho hội học hỏi quý giá Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gứi tới toàn thể thầy, cô anh, chị Bộ môn Giống Cơng nghệ sinh học, gia đình, bạn bè, người giúp đỡ động viên suốt trình học tập Hà Nội, tháng năm 2010 Sinh viên Trần Văn Tiến ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, khơng khí với độ ẩm cao điều kiện thuận lợi cho loài sâu hại Nông - Lâm nghiệp phát triển Khi muốn bảo vệ suất trồng, ngƣời nông dân thƣờng sử dụng thuốc hoá học với nồng độ cao để phun sau dịch sâu hại bùng phát Đối với lâm nghiệp, dịch xuất vƣờn ƣơm, cánh rừng trồng số lƣợng hố chất phải dùng lớn Trung bình trồng phải phun từ – kg thuốc Điều thực vấn đề nghiêm trọng địi hỏi nhà khoa học nói chung nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiên cứu xem xét cách đầy đủ, thuốc hoá học dập tắt đƣợc nạn dịch nhanh nhƣng dao hai lƣỡi, trực tiếp phá huỷ mơi trƣờng sống khu sản xuất đó, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khoẻ ngƣời, làm giảm số lƣợng sinh vật có lợi cho ngƣời nhƣ chim chóc, tơm, cá, ký sinh thiên địch nhƣ bọ rùa, ong ký sinh… Trong việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus, côn trùng, thảo mộc đƣợc chứng minh an toàn ngƣời gia súc, không gây ô nhiễm môi trƣờng, không giết chết thiên địch sâu hại sinh vật có ích, trì cân sinh thái, khơng ảnh hƣởng đến chất lƣợng nông, lâm sản Thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (đƣợc tiêu thụ nhiều số loại thuốc trừ sâu sinh học) chƣa phổ biến Nguyên nhân thói quen sử dụng thuốc trừ sâu hố học ăn sâu vào tiềm thức ngƣời nông dân nƣớc ta; thuốc trừ sâu sinh học sản suất nƣớc có hiệu lực chƣa cao, tính ổn định cịn thấp; thuốc trừ sâu sinh học nhập ngoại có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học vừa tiết kiệm chi phí, vừa đạt đƣợc hiệu tiêu diệt sâu nhanh hơn… Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vật giữ vai trò định suất, chất lƣợng, sản lƣợng giá thành sản phẩm nên công tác phân lập, tuyển chọn bảo quản chủng giống có ý nghĩa quan trọng Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hƣớng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu nhƣ thúc đẩy sử dụng thuốc trừ sâu Bt Nông – Lâm nghiệp Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tà nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus thuringiensis có độc tính cao trùng hại trồng” CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) đời phát triển với phát triển khoa học kỹ thuật nhân loại, Bt đƣợc nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực khác [21], [6] Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học ngƣời Nhật - thực điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto gây chết đột ngột, giết chết nhiều quần thể tằm, phân lập đƣợc loại vi khuẩn (chính Bacillus thuringiensis) nguyên nhân gây bệnh, ông đặt tên loại vi khuẩn Bacillus sotto Đây lần ngƣời phát vi khuẩn Bt Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học ngƣời Đức - phân lập đƣợc vi khuẩn giết hại mối Mediterranean flour Ông phát lồi vi khuẩn mà Ishiwatari Shigetane cơng bố, đặt tên lại cho loài vi khuẩn Bacillus thuringiensis (hay Bt), xuất phát từ địa danh Thurigia thị trấn nhỏ Đức, nơi phát mối Năm 1915, Ernst Berliner tiếp tục đƣa báo cáo loại độc tố có chất protein đƣợc Bt sản sinh thể, theo ơng ngun nhân khiến mối bị giết hại Tuy nhiên, tác dụng chế hoạt động loại protein chƣa đƣợc khám phá Năm 1920, ngƣời nông dân trang trại lớn nƣớc phát triển bắt đầu sử dụng sinh khối vi khuẩn Bt phun cho trồng nhƣ loại thuốc phòng trừ sâu bệnh Đặc biệt nƣớc Pháp, sớm bắt đầu chế tạo loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử xác Bt, gọi Sporine Năm 1956, Hannay, Fitz-James Angus nghiên cứu phát tác nhân định khả tiêu diệt mối sâu bọ Bt phân tử protein đƣợc sản sinh thể vi khuẩn Bt, từ mở hƣớng nghiên cứu nhà khoa học tác nhân, chế diệt sâu di truyền Bt Từ năm 1958, chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu đƣợc sử dụng rộng rãi Mỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt đƣợc đánh giá loại thuốc trừ sâu thân thiện với ngƣời môi trƣờng chiến lƣợc phát triển nông nghiệp tổ chức bảo vệ môi trƣờng EPA (Environmental Protection Agency) Mỹ Năm 1977, có 13 lồi vi khuẩn Bt đƣợc phát công bố Các nghiên cứu khám phá phổ kháng Bt cho thấy Bt không gây độc với giai đoạn định ấu trùng cánh vảy, mà gây độc với ấu trùng cánh cứng Từ năm 1980 trở đi, ý thức ngƣời với vấn đề môi trƣờng sống tăng cao, khả kháng độc sâu bệnh với loại thuốc hoá học kể loại cực độc nhƣ DDT 666… ngày gia tăng Đồng thời, ngƣời phát đƣợc lƣợng tồn dƣ hố chất phịng trừ sâu hại đƣợc tích luỹ gia tăng dần môi trƣờng sống gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới hệ sinh thái sức khoẻ ngƣời Để giải vấn đề đó, chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày đƣợc sử dụng rộng rãi tinh thể độc Bt tiết có chất loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanh chóng môi trƣờng, không ảnh hƣởng đến sức khoẻ ngƣời, vật nuôi Ngày nay, nhà khoa học phát 1000 biến dạng độc tố thể Bt Bên cạnh đó, phát triển nhanh chóng sinh học phân tử giúp nhà khoa học ứng dụng công nghệ GMO (Genetically Modifie Organisms) chuyển gen điều khiển sản sinh độc tố Bt vào thể trồng, giúp trồng chuyển gen tiết độc tố diệt sâu ăn đục thân Ngô lúa hai giống trồng đƣợc chuyển gen Bt tổ chức EPA Mỹ thực năm 1995 Cho tới nay, công nghệ GMO chuyển gen kháng sâu ứng dụng thành công cho nhiều loại trồng khác nhƣ: Khoai tây, bông, khoai lang, đậu [7], [6] 1.2 Đại cƣơng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Đặc điểm hình thái Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis vi khuẩn đất, gram (+), hô hấp hiếu khí hiếu khí khơng bắt buộc Tế bào hình que, kích thƣớc khoảng - 6µm, có tiêm mao phủ mỏng, có khả di động, tế bào đứng đơn độc xếp thành chuỗi Bacillus thuringiensis có khả sinh nội bào tử tinh thể độc Bào tử hình trứng với kích thƣớc khoảng 1,5 – µm Tinh thể độc có kích thƣớc khoảng 0,6 x 0,02 µm có nhiều hình dạng nhƣ hình ô van, hình lập phƣơng, hình sao, hình trứng, hình kim Khi tế bào sinh dƣỡng bị phá vỡ, nội bào tử thể vùi đƣợc giải phóng (xem Hình 1.1) Giống nhƣ bào tử loại vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus, bào tử Bt bền, có khả kháng lại nhiệt, xạ, hố chất cao Có thể quan sát thấy bào tử, tinh thể độc, tế bào sinh dƣỡng Bt dƣới kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang học [5], [8] 1.2.2 Đặc tính sinh hóa Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis sinh trƣởng tối ƣu nhiệt độ 28 – 30oC, pH từ 6,8 đến 7,2 Trong trình sinh trƣởng, vi khuẩn chuyển hoá thành phần đƣờng mơi trƣờng thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau chất lại đƣợc thể sử dụng tiếp Do pH mơi trƣờng lúc đầu tăng (pha logarit), sau giảm Khả sinh bào tử Bacillus thuringiensis phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà đặc biệt yếu tố dinh dƣỡng Vi khuẩn có khả nitrit hố, khơng có khả lên men đƣờng arabinoza, xiloza, manitol phát triển yếu mơi trƣờng kị khí [8], [1] Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.3 Các độc tố Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis có khả tạo loại độc tố: + Ngoại độc tố α (α - exotoxin) + Ngoại độc tố β ( β - exotoxin) + Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin) + Nội độc tố δ (δ - endotoxin) Trong loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh đến nhiều loại côn trùng đƣợc ứng dụng rộng rãi bảo vệ thực vật nhƣ loại thuốc sâu không độc hại với môi trƣờng, ngƣời động vật [4], [6] 1.2.3.1 Ngoại độc tố α Ngoại độc tố α đƣợc phát năm 1950 từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis vanenlesti C Toumaroff Ngoại độc tố α cịn gọi enzyme Leucintinase, có hoạt tính phospholipase - tác động chủ yếu lên gốc phospholipit màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập vào xoang thể côn trùng Do vậy, enzyme Leucintinase trực tiếp tham gia vào việc công, gây tổn thƣơng tế bào thành ruột Ngoại độc tố α có trọng lƣợng phân tử thấp, tan tốt nƣớc, hoạt động pH từ 6,6 đến 7,2 không bền nhiệt nên cịn đƣợc gọi ngoại độc tố khơng bền nhiệt, tác động đặc hiệu đến loài nhƣ: ong cắn lá, sâu thuộc cánh cứng, cánh vẩy [3], [9] 1.2.3.2 Ngoại độc tố β Do Hall Arkavc phát năm 1959 nuôi ấu trùng muỗi thức ăn chứa Bt Đây độc tố bền nhiệt có chất nucleotide Khi xử lý 120oC 15 phút giữ đƣợc hoạt tính Cơ chế tác động ngoại độc tố β cạnh tranh ATP với enzyme ARN polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạt động enzyme, ngừng tổng hợp ARN, gây rối loạn sinh tổng hợp protein Mặt khác, ngoại độc tố β cộng hƣởng tác động với nội độc tố δ khiến trùng chết nhanh chóng Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc cánh cứng, hai cánh, đặc biệt côn trùng giai đoạn ấu trùng, sâu non Ngoại độc tố β gây cản trở lột xác côn trùng Nếu đƣợc sử dụng nồng độ cao, độc tố β cịn tiêu diệt trứng trùng [8] 1.2.3.3 Ngoại độc tố γ Ngoại độc tố γ phospholipase, có chất mạch peptide ngắn số axit amin tự Độc tố tan tốt nƣớc, mẫn cảm với khơng khí, ánh sáng, nhiệt độ ơxi nên hữu dụng thực tế đồng ruộng Cơ chế tác dụng ngoại độc tố γ tƣơng tự nhƣ ngoại độc tố α [10] 1.2.3.4 Nội độc tố δ Nội độc tố δ đƣợc hình thành khoảng 3h pha cân Tinh thể bền nhiệt (tới 80oC), không tan nƣớc, dung môi hữu nhƣng tan tốt mơi trƣờng có pH kiềm Mỗi tế bào Bt sinh hai tinh thể độc Khối lƣợng tinh thể độc chiếm tới 30% khối lƣợng tế bào mang δ – endotoxin cịn đƣợc gọi protein tinh thể độc tồn dạng tinh thể với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua liên kết kị nƣớc Về chất độc tố protein với 1180 gốc axit amin chủ yếu gồm loại nhƣ glutmic, asparaginic axit amin chịu trách nhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp tinh thể Cystein chiếm tỷ lệ thấp nhƣng góp phần quan trọng việc giữ vững cấu trúc tinh thể, làm tinh thể khơng có khả hồ tan Ngồi ra, tinh thể tạp lẫn số hydrocacbon với tỷ lệ khoảng 5,6% Về thành phần nguyên tố, toxin chứa chủ yếu nguyên tố C, H, O, N, S Các nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe chiếm tỷ lệ nhỏ Ni, Ti, Zn, Mn, Cu… chiếm tỷ lệ nhỏ, cịn P hầu nhƣ khơng có [11], [13], [6] 1.2.4 Tính đa dạng Bt Cho đến nhà khoa học phân lập, phân loại đƣợc số lƣợng lớn chủng Bt dựa theo đặc điểm sau: - Khả hình thành enzyme leucitinase - Cấu trúc tinh thể, khả gây độc - Đặc tính huyết học (kháng huyết tiêm mao H) - Phản ứng ngƣng kết tế bào sinh dƣỡng với kháng huyết Phƣơng pháp phân loại theo đặc tính huyết phổ biến Theo phƣơng pháp này, dựa vào 50 type huyết chuẩn ngƣời ta chia chủng Bt phân lập đƣợc làm 63 loài phụ (subspecies) [14], [1], [6] Một số type huyết chủng đại diện tƣơng ứng (xem Bảng 1.1) Bảng 1.1: Một số type huyết chủng đại diện tƣơng ứng Type huyết Chủng đại diện B thuringiensis Viết tắt THU Ngƣời nghiên cứu Bliner (1915); Heimpel& Angus (1958) 3a, 3b B kurstaki KUR De Barjac & Lemill (1970) 4a, 4b B sotto SOT Ishiwata (1905); Heimpel & Angus (1958) 5a, 5b B candensis CAN De Barjac & Bonnefoi (1972) 8b, 8d B nigeriensis NIG Weiser and prasertphon (1984) 14 B israelensis ISR De Barjac & Cs (1992) 30 B medellin MED Orduz & Cs (1992) 33 B leesis LEE Lee & Cs (1944) 46 B chanpaisis CHA Chainpaisang (1994) 48 B balearica BAL Iriate Garcia (1995) 49 B muju MUJ Park (1995) 50 B navarrersis NAV Iriate Garcia Gần đây, nhờ phát triển mạnh công nghệ gen, nhà khoa học giải mã đƣợc hầu hết gen mã hóa cho tinh thể độc Từ sở đó, phƣơng pháp phân loại khác đƣợc đƣa ra: phƣơng pháp phân loại dựa vào lớp gen Cry Với phƣơng pháp này, nhà khoa học đƣa 20 lớp gen với đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, côn trùng đích khác tinh thể độc hình trám mặt, dạng bột đƣợc hoà tan với nƣớc cất vô trùng tạo thành dạng lỏng, đảm bảo số lƣợng bào tử khoảng 109 bào tử/ml Kết xác định hoạt lực diệt sâu thời điểm sau 24h, 48h 72h (tính theo cơng thức Abbott), (xem Bảng 3.6 xem Hình 3.3) Bảng 3.6: Tỉ lệ phần trăm sâu Spodoptera litura chết chế phẩm Bt TT Kí hiệu 10 11 ĐC BtAn huy BtK BtT H1.2 H1.5 T5.1 T5.2 G6.1 G6.2 MS8.1 Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian 24h 48h 72h 0 50 100 43 53 53 30 40 60 23 30 50 63 83 100 37 63 80 30 40 60 33 57 80 30 53 57 20 33 43 TT Kí hiệu 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 MS11.1 MS15.3 MS16.2 MS16.3 MS17.1 MS19.2 MS21.1 MS23 MS26.1 MS27.1 MS27.4 Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian 24h 48h 72h 33 30 80 30 63 70 43 57 83 20 33 53 30 60 60 23 53 60 37 90 93 27 53 63 23 33 60 27 47 90 43 70 93 Xem kết bảng thấy: Công thức đối chứng âm (nhúng dƣa với môi trƣờng lên men vơ trùng) có tỉ lệ sâu chết 0% sau ngày thí nghiệm Cơng thức đối chứng dƣơng (BtAnhuy) sử dụng chế phẩm Bt thƣơng mại Trung Quốc hiệu lực diệt sâu Spodoptera litura cao Sau 48h 100% sâu thí nghiệm chết Trong số 20 chủng Bt sinh nhiều bào tử/tinh thể độc phân lập, đáng ý hiệu diệt sâu Spodoptera litura chủng sau: - Chủng H1.5 có hiệu diệt sâu ăn dƣa chuột dƣa hấu cao, tƣơng đƣơng hiệu diệt sâu Spodoptera litura chủng Bt thƣơng mại Trung Quốc Sau 24h 63% sâu thí nghiệm chết; sau 48h 83% sâu thí nghiệm chết; sau 72h 100% sâu thí nghiệm chết - Chủng MS21.1; MS27.4 ; MS27.1 có hiệu diệt sâu Spodoptera litura cao gần hiệu diệt sâu Spodoptera litura chủng H1.5 Hiệu diệt sâu Spodoptera litura chủng nhƣ sau : Sau 24h - MS21.1 (37%), MS27.4 (40%), MS27.1 (27%); sau 48h - MS21.1 (90%), MS27.4 (70%), MS27.1(47%); sau 48h MS21.1 (93%), MS27.4 (93%), MS27.1( 90%) 41 - chủng có hiệu diệt sâu Spodoptera litura đạt ≈ 80% sau 72h thí nghiệm T5.1, MS11.1, MS16.2, G6.1 Các chủng Bt cịn lại có hiệu diệt sâu Spodoptera litura thấp Khi xem xét kích cỡ sâu lƣợng dƣa tiêu thụ lơ thí nghiệm nhận thấy: Do sâu Spodoptera litura ngày ăn hết lƣợng dƣa đáng kể, tƣơng ứng với lƣợng dƣa sâu ăn, dễ dàng quan sát thấy kích cỡ sâu to lên sau ngày Do vậy, lƣợng dƣa chúng tơi tiếp cho sâu ăn trƣớc thí nghiệm đầy đĩa petri nhƣng đủ cho sâu ăn 24h, sau lơ thí nghiệm sâu ăn hết thức ăn phải nhúng thêm dƣa tƣơi với dịch khuẩn tƣơng ứng với lô thí nghiệm để tiếp thêm cho sâu Ở lơ đối chứng âm, lƣợng tiêu thụ hết sau 24h Do vậy, sau khoảng 18h - 24h lại thực nhúng dƣa tƣơi với môi trƣờng lên men vô trùng để tiếp thêm thức ăn cho sâu Sâu sinh trƣởng phát triển bình thƣờng nên có lớn lên kích cỡ trọng lƣợng Ở cơng thức thí nghiệm bố trí với chủng Bt có hiệu diệt sâu thấp (nhƣ MS23, MS26.1, MS19.3 ), phải tiếp thêm thức ăn nhúng dịch khuẩn cho sâu, nhiên lƣợng thức ăn cần tiếp thêm không nhiều nhƣ lô đối chứng âm kích cỡ, trọng lƣợng sâu cịn sống sót tăng lên Lơ thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu chủng Bt Anhuy, H1.5 , MS21.1, MS27.4 , MS27.1 , T5.1, MS11.1, MS16.2, G6.1 Sau 24h thí nghiệm, lƣợng thức ăn dành cho sâu giảm đáng kể, phải tiếp thêm thức ăn cho sâu (tuy không cần lƣợng nhiều lô đối chứng âm lơ thí nghiệm khác) Tuy nhiên, từ 24h trở đi, số lƣợng sâu cịn sống sót khơng nhiều, sâu cịn sống sót yếu nên lƣợng dƣa đĩa hầu nhƣ không đƣợc tiêu thụ thêm Sâu lơ thí nghiệm hầu nhƣ khơng tăng lên kích cỡ trọng lƣợng Tƣơng tự, lơ thí nghiệm khác có tiêu thụ lƣợng dƣa nhiều khác tƣơng ứng với hiệu diệt sâu chủng Bt tƣơng ứng với lơ thí nghiệm Hiệu diệt sâu thấp, lƣợng dƣa sâu tiêu thụ nhiều Hiệu diệt sâu cao lƣợng dƣa cần tiếp cho sâu ăn 42 A B Hình 3.3: Hình ảnh hiệu diệt sâu Spodoptera litura 3.3-A : Hình ảnh lơ thí nghiệm với chủng H1.5 3.3-B: Hình ảnh lơ đối chứng âm 3.3.3.2 Sâu ăn cải bắp su hào (Plutella xylostella) Sâu ăn cải bắp su hào Plutella xylostella Linnaeus phát triển mạnh vào vụ Đông – Xuân Bƣớm dài từ - 10 mm, sải cánh rộng từ 10 - 15 mm Cánh trƣớc màu nâu, lƣng có dải gợn sóng, màu trắng bƣớm đực màu vàng bƣớm cái, chạy dài đến cuối cánh Bƣớm sống đến tuần đẻ độ 200 trứng Ấu trùng màu xanh lục, nở to giữa, đầu nhọn, thân chia đốt rõ ràng có cặp chân giả từ đốt bụng thứ năm, lớn đủ sức sâu dài từ đến 11mm Sâu có tuổi với thời gian phát triển lâu độ - 10 ngày Thời gian làm nhộng lâu - ngày Khi hình thành nhộng có màu xanh nhạt, khoảng ngày sau thành màu vàng nhạt, chiều dài nhộng từ - 7mm, chung quanh nhộng có kén tơ bao phủ 43 Thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu đƣợc bố trí đĩa petri giống nhƣ với sâu Spodoptera litura, đĩa 10 sâu (tƣơng đối đồng kích thƣớc) Cơng thức đối chứng âm mơi trƣờng lên men vô trùng Công thức đối chứng dƣơng chế phẩm thuốc trừ sâu Bt nhãn hiệu Anhuy Trung Quốc sản xuất Kết xác định hoạt lực diệt sâu thời điểm sau 24h, 48h 72h (tính theo cơng thức Abbott), (xem Bảng 3.7 xem Hình 3.4) Bảng 3.7: Tỉ lệ phần trăm sâu Plutella xylostella chết chế phẩm Bt TT Kí hiệu ĐC BtAn huy BtK BtT H1.2 H1.5 T5.1 T5.2 G6.1 10 G6.2 11 MS8.1 Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian 24h 48h 72h 0 70 97 100 20 53 67 37 43 67 20 30 50 57 87 100 20 63 70 53 63 80 27 40 93 23 30 37 27 27 53 TT 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Kí Tỉ lệ (%) sâu chết sau hiệu thời gian 24h 48h 72h MS11.1 37 63 83 MS15.3 30 67 63 MS16.2 43 57 93 MS16.3 23 33 77 MS17.1 30 53 67 MS19.2 20 53 57 MS21.1 47 77 90 MS23 27 67 70 MS26.1 20 40 50 MS27.1 43 73 93 MS27.4 53 87 100 Xem kết bảng thấy: Công thức đối chứng âm (nhúng cải bắp với môi trƣờng lên men vô trùng) có tỉ lệ sâu chết 0% sau ngày thí nghiệm Công thức đối chứng dƣơng (BtAnhuy) sử dụng chế phẩm Bt thƣơng mại Trung Quốc hiệu lực diệt sâu Plutella xylostella cao Sau 48h 100% sâu thí nghiệm chết Trong số 20 chủng Bt sinh nhiều bào tử/tinh thể độc phân lập, đáng ý hiệu diệt sâu Plutella xylostella chủng sau: - Chủng H1.5, MS27.4 có hiệu diệt sâu Plutella xylostella cao tƣơng đƣơng hiệu diệt sâu Plutella xylostella chủng Bt thƣơng mại Trung Quốc Hiệu diệt sâu Plutella xylostella chủng nhƣ sau: Sau 24h - H1.5 44 (57%), MS27.4 (53%); sau 48h - H1.5 (87%), MS27.4 (87%); sau 72h – 100% sâu thí nghiệm hai lơ chết Chủng MS27.1, G6.1, MS16.2, MS21.1 có hiệu diệt sâu Plutella xylostella cao gần chủng H1.5, MS27.4 Hiệu diệt sâu Plutella xylostella chủng nhƣ sau: Sau 24h - MS27.1 (43%), G6.1 (27%), MS16.2 (43%), MS21.1(47%); sau 48h - MS27.1 (73%), G6.1 (40%), MS16.2 (57%), MS21.1 (77%); Sau 72h MS27.1 (90%), G6.1 (93%), MS16.2 (93%), MS21.1(90%) - chủng có hiệu diệt sâu Plutella xylostella đạt ≈ 80% sau 72h thí nghiệm MS11.1, T5.2, MS16.3 Các chủng Bt cịn lại có hiệu diệt sâu Plutella xylostella thấp Khi xem xét kích cỡ sâu lƣợng cải bắp tiêu thụ lô thí nghiệm tơi nhận thấy: Sâu Plutella xylostella ngày lƣợng sâu ăn giảm nửa, tƣơng ứng với lƣợng cải bắp sâu ăn, ta thấy kích thƣớc sâu tăng chậm Do vậy, lƣợng tơi tiếp cho sâu ăn trƣớc thí nghiệm đầy đĩa petri đủ cho sâu ăn 24h – 36h , sau lơ thí nghiệm sâu ăn hết thức ăn phải nhúng thêm cải bắp tƣơi với dịch khuẩn tƣơng ứng với lơ thí nghiệm để tiếp thêm cho sâu Ở lô đối chứng âm, lƣợng tiêu thụ hết sau 36h Do vậy, sau khoảng 24h lại thực nhúng cải bắp tƣơi với môi trƣờng lên men vô trùng để tiếp thêm thức ăn cho sâu Sâu sinh trƣởng phát triển bình thƣờng nên có lớn lên kích cỡ trọng lƣợng Ở cơng thức thí nghiệm bố trí với chủng Bt có hiệu diệt sâu thấp (nhƣ MS19.2, MS26.1, MS23 ), phải tiếp thêm thức ăn nhúng dịch khuẩn cho sâu, nhiên lƣợng thức ăn cần tiếp thêm không nhiều nhƣ lô đối chứng âm kích cỡ, trọng lƣợng sâu cịn sống sót tăng lên Lơ thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu chủng Bt Anhuy, H1.5 , MS27.4 , MS21.1, MS27.1, G6.1 Sau 24h thí nghiệm, lƣợng thức ăn dành cho sâu giảm đáng kể, phải tiếp thêm thức ăn cho sâu (tuy không cần lƣợng nhiều lô đối chứng âm lô thí nghiệm khác) Tuy nhiên, từ 24h trở đi, số lƣợng sâu cịn sống sót khơng nhiều, sâu cịn sống sót yếu nên lƣợng đĩa hầu nhƣ không đƣợc tiêu thụ thêm Sâu lơ thí nghiệm hầu nhƣ khơng tăng lên kích cỡ trọng lƣợng 45 Tƣơng tự, lơ thí nghiệm khác có tiêu thụ lƣợng nhiều khác tƣơng ứng với hiệu diệt sâu chủng Bt tƣơng ứng với lơ thí nghiệm Hiệu diệt sâu thấp, lƣợng cải bắp sâu tiêu thụ nhiều Hiệu diệt sâu cao lƣợng cần tiếp cho sâu ăn Từ số liệu thống kê phần trăm hoạt lực diệt sâu Plutella xylostella ta thấy sâu Plutella xylostella loài ký chủ đặc hiệu vi khuẩn Bt Kết thử hoạt tính với hoạt lực diệt sâu Plutella xylostella chủng không thay đổi nhiều so với kết thử hoạt tính sâu Spodoptera litura Điều chứng tỏ kết thử hoạt tính tƣơng đối xác, từ ta thấy chủng vi khuẩn Bt phân lập có hoạt lực cao chọn đƣợc chủng tốt cần lƣu giữ nghiên cứu sâu loài, chi hoạt lực chúng loại côn trùng khác, nhƣ tìm cách nâng cao hoạt lực chủng B A Hình 3.4 : Hình ảnh hiệu diệt sâu Plutella xylostella 3.4-A: Hình ảnh lơ thí nghiệm với chủng MS27.4 3.4-B: Hình ảnh lơ đối chứng âm 46 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa vào kết thu đƣợc từ thí nghiệm, tơi rút số kết luận nhƣ sau: - Đã phân lập đƣợc 66 chủng vi khuẩn Bt - Đã xác định đƣợc đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc 66 chủng vi khuẩn Bt - Đã xác định đƣợc hình dạng tế bào, bào tử tinh thể độc 66 chủng vi khuẩn Bt - Đã xác định đƣợc hoạt lực diệt sâu 20 chủng vi khuẩn Bt sản sinh nhiều bào tử tinh thể độc số 66 chủng phân lập + Đối với sâu Spodoptera litura, số 20 chủng Bt xác định đƣợc: * Có 1/20 chủng có hoạt lực diệt sâu mạnh, chủng H 1.5 có hoạt lực diệt sâu cao (tỉ lệ sâu chết) 100% sau 72h * Có 7/20 chủng có hoạt lực diệt sâu đạt 80% - 90% sau 72h; chủng T5.1, MS16.2 , MS27.1, MS11.1, G6.1, MS21.1, MS27.4 + Đối với sâu Plutella xylostella, số 20 chủng Bt xác định đƣợc : * Có 2/20 chủng có hoạt lực diệt sâu mạnh, chủng H1.5, MS27.4 có hoạt lực diệt sâu cao (tỉ lệ sâu chết) 100% sau 72h * Có 7/20 chủng có hoạt lực diệt sâu đạt 80% - 90% sau 72h; chủng MS16.2 , MS27.1, MS11.1, T5.2,G6.1, MS21.1, MS16.3 - Đã bảo quản đƣợc 66 chủng vi khuẩn Bt phân lập đƣợc Trung tâm Giống & CNSH – Trƣờng ĐHLN Tồn Do thời gian thực khố luận, trang thiết bị, số lƣợng sâu thí nghiệm có hạn, nhƣ trình độ thân nên: - Chƣa xác định xác đƣợc chủng vi khuẩn Bt phân lập thuộc loài, chi chúng có bị trùng lặp hay khơng - Chƣa thử đƣợc hoạt lực diệt sâu với số loại sâu hại Nông - Lâm nghiệp khác 47 Kiến nghị - Tiếp tục phân lập thêm vi khuẩn Bt địa điểm khác quanh khu vực Trƣờng ĐHLN (đây địa điểm có tiềm xuất Bt với tần suất cao có hoạt lực diệt sâu mạnh) - Thử hoạt lực diệt số loài sâu khác (ngoài sâu dƣa) - Định tên chủng (nhƣ H1.5, MS21.1, MS27.4) - Tìm mơi trƣờng ni cấy phù hợp chủng, để chúng có khả phát triển sinh tinh thể độc tốt 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngơ Đình Bính (2005), “Thuốc trừ sâu vi sinh” Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr 10 – 43 Nguyễn Thị Chính, Nguyễn Đình Quyến (1998), “Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu Bt ứng dụng phòng trừ sâu hại”, Báo cáo nghiệm thu nhánh đề tài thuộc dự án hợp tác Việt Nam – CHLB Đức VNM 9510-017 Nguyễn Lân Dũng, (1981) Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng, nhà xuất KHKT Ngơ Đình Quang Đính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thƣởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Hoài Trâm, Trịnh Thế Cƣờng (2000), “Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thurigiensis phân lập số tỉnh Việt Nam”, Những vấn đề nghiên cứu công nghệ sinh học, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr 484 – 488 Lê Thị Thu Hiền, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình, Nơng Văn Hải (1998), “Gen kháng côn trùng ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật” Kỉ yếu viên công nghệ sinh học Lƣu Đình Thúy (2005), Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bacillus thruringiensis ứng dụng phịng trừ sâu hại (Khóa luận tơt nghiệp) Phạm Thị Thuỳ (2004) Công nghệ sinh học bảo vệ thực vật, NXB Đại học quốc gia Hà Nội, tr 235 - 243 Nguyễn Thị Thanh Vân (1996), Nghiên cứu điều kiện đơn giản nhân giống Bacillus thurigiensis, lựa chọn phƣơng pháp sản xuất giống để cung cấp cho vùng trồng rau (Luận văn thạc sĩ sinh học) Tài liệu tiếng Anh Amos Navon (1993), “Control of Lepidoteran pets with Bacillus thurigiensis ", Bacillus thurigiensis an environment biopestiside theory and practide, tr 126 – 146 49 10 Chilcot C.N and P J Wigley (1994), “Insecticidal activity of Bacillus thurigiensis crystal protein", Proceeding of the 2nd Canberra meeting on Bacillus thurigiensis, tr 43 – 52 11 Choma C T W K surewicz, P R Carey, M Pozsgay, T Raynor and H Kaplan (1990), Unusual proteolysis of the protoxin and toxin Bacillus thurigiensis”, Eur.J Biochem189: tr 523 – 527 12 Deluca A.J, Simonson J.G and larson A D (1981), “Bacillus thurigiensis distribution on soil of the United States”, Microbiol, 27: tr 865 – 870 13 Hofte H and H R Whitelog (1989) “Insecticidal crystal protein of Bacillus thurigiensis", Microbiol Rev 53: tr 242 – 255 14 Iizuka T (1999), “Historical review on Bacillus thurigiensis", Biotechnology of Bacillus thurigiensis, Vol 3: tr 3-5 15 Laurent P H, Ripauteau H, Dumamoir V.C, Frachon E, Lecadet M-M (1996), “A micromethod for serotyring Bacillus thurigiensis”, Microbiol 22: tr 259-261 16 Pries F G (1992), “Biological control of Mosquitoes and other bitting flies by Bacillus thurigiensis and B sphaericus”, Journal of Applied Bacteriology, 72: tr 357- 369 17 Powel, C.A Charlton and T Yanamoto (1994), “Recent advences in structure and fuction reseach on Bacillus thurigiensis crystal protein”, Bacillus thurigiensis biotechnology and environmental benefits, Vol 1: tr 1-20 18 Sakhi V F P Parenti, G.M.Hanazet, B.Giordara, P Lluthy (1986), “Bacillus thurigiensis toxin inhibits K+ - gradient dependent amino acid transport across the brush border membrane of pieris brassicae midgut cell”, Microbiol Rev.53: tr 213 – 218 19 Thiery and E Frachon (1997), “Indentification, isolation culture and preservation enbromo pathogenic Biologocal techniques manual of technology in Insect pathology”, A academicpress, tr 55 – 56 Các trang web 20 http\\: www.agbiotech.com.vn 21 http\\: www.ebook.edu.vn 22 http\\: www.thiennhien.net 50 DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHĨA LUẬN STT Kí hiệu bảng Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Tên bảng Một số type huyết chủng đại diện tƣơng ứng Một số chủng Bt thƣờng đƣợc ứng dụng sản xuất chế phẩm Bt Việt Nam Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng Nguồn thu thập Bt từ mẫu đất khu vực Trƣờng Bảng 2.2 Bảng 3.1 Bt phân lập đƣợc từ mẫu sâu Bảng 3.2 Bt phân lập đƣợc từ mẫu đất ĐHLN Hình dạng, màu sắc đƣờng kính khuẩn lạc Bảng 3.3 chủng Bt Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc chủng Bảng 3.4 Bt Số lƣợng bào tử/ml dịch lên men (thu hồi sau 50h lên Bảng 3.5 men) Tỉ lệ phần trăm sâu Spodoptera litura chết chế 10 Bảng 3.6 phẩm Bt Tỉ lệ phần trăm sâu Plutella xylostella chết chế 11 Bảng 3.7 12 Bảng 3.8 phẩm Bt Kết bảo quản chủng vi khuẩn Bt phân lập 51 Trang DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHĨA LUẬN STT Kí hiệu viết tắt Giải thích Bt Bacillus thuringiensis G6 Hội trƣờng G6 T5 Nhà thực hành T5 KTX Ký túc xá KHV Kính hiển vi Đk Đƣờng kính ĐC Đối chứng H Giờ 52 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG KHĨA LUẬN STT Kí hiệu Tên hình hình Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Bacillus thuringiensis Hình 1.2 Quá trình xâm nhập gây độc Bt Hình 2.1 Hình ảnh nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt Hình 2.2 Hình ảnh sâu thử hoạt tính Hình 3.1 Một số hình ảnh q trình phân lập Bt Hình 3.2 Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc chủng Bt Hình 3.3 Hình ảnh hiệu diệt sâu Spodoptera litura Hình 3.4 Hình ảnh hiệu diệt sâu Plutella xylostella 53 Trang MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis 1.2 Đại cƣơng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Đặc điểm hình thái Bacillus thuringiensis 1.2.2 Đặc tính sinh hóa Bacillus thuringiensis 1.2.3 Các độc tố Bacillus thuringiensis 1.2.4 Tính đa dạng Bt 1.3 Các yếu tố hình thành tinh thể độc 10 1.4 Cơ chế tác động tinh thể độc lên côn trùng 10 1.4.1 Q trình hoạt hố tinh thể độc 10 1.4.2 Cơ chế hoạt động toxin tế bào biểu mô ruột côn trùng 11 1.4.3 Tác động chọn lọc độc tố vi khuẩn Bt lên côn trùng 11 1.5 Ƣu nhƣợc điểm thuốc trừ sâu Bt 12 1.6 Ảnh hƣởng thuốc trừ sâu Bt đến ngƣời, động vật thực vật 13 1.6.1 Ảnh hƣởng chế phẩm Bt đến sức khoẻ ngƣời 13 1.6.2 Ảnh hƣởng vi khuẩn Bt tới loài động vật 14 1.6.3 Ảnh hƣởng vi khuẩn Bt đến loài thực vật 16 1.7 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng thuốc trừ sâu Bt 17 1.7.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng thuốc trừ sâu Bt giới 17 1.7.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất sử dụng thuốc trừ sâu Bt Việt Nam 17 CHƢƠNG 19 MỤC TIÊU – ĐỐI TƢỢNG - NỘI DUNG – PHƢƠNG PHÁP 19 NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Đối tƣợng giới hạn nghiên cứu 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.4 Vật liệu thiết bị 20 2.4.1 Nguồn vi sinh vật 20 2.4.2 Sâu thí nghiệm 22 54 2.4.3 Hóa chất 22 2.4.4 Thiết bị - dụng cụ 23 2.4.5 Các loại môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 23 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.5.1 Phƣơng pháp luận 26 2.5.2 Phƣơng pháp nghiên cứu cụ thể 26 CHƢƠNG 31 KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ 31 3.1 Kết phân lập Bacillus thuringiensis 31 3.2 Kết quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc 35 3.3 Tuyển chọn chủng Bt có độc tính cao côn trùng 38 3.3.1 Kết nhân giống cấp I, II lên men 38 3.3.2 Kết xác định số lƣợng bào tử 38 3.3.3 Kết thử khả diệt sâu chủng Bt phòng thí nghiệm 39 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 47 Kết luận 47 Tồn 47 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 55 ... đƣợc số đặc điểm chủng Bt phân lập: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, tế bào, bào tử, tinh thể độc + Thử hoạt lực diệt sâu hại trồng chủng Bt phân lập + Chọn lọc đƣợc chủng Bt có độc lực cao côn trùng. .. cứu ? ?Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus thuringiensis có độc tính cao côn trùng hại trồng? ?? CHƢƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis Lịch sử... đƣợc chủng vi khuẩn Bt phân lập thuộc loài, chi việc xem xét cách xác khác chủng Bt phân lập có trùng lặp khơng tƣơng đối Khóa luận tập trung vào phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bt có hoạt lực cao