Tuyển chọn chủng có khả năng chịu axit và muối mặn cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế

Tuyển chọn chủng có khả năng chịu axit và muối mặn cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế

DANH SÁCH BẢNG Hình Tên hình Trang

Bảng 1.1 Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic 4

Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt một số loài của chi Lactobacillus 6

Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt một số loài Pediococcus 10

Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm .23

Bảng 3.2 Thành phần môi trường MRS rắn/Lít 27

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tên hình Trang

Hình 1.1 Hình thái tế bào của Lb axitophilus và Lb plantarum 5 Hình 1.2 Hình thái tế bào của Leuconostoc mesenteroides 8 Hình 1.3 Hình thái tế bào của Pediococcus halophilus và Aerococcus urinaeequi 9 Hình 1.4 Hình thái tế bào của Bifidobacterium 11

Hình 3.1 Hình thái tế bào và nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic sửdụng trong thí nghiệm 24Hình 4.1 Thời gian tăng OD 0,3 của các chủng vi khuẩn lactic trong môitrường MRS có 0,3% muối mật 33Hình 4.2 Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic ở pH 2 36Hình 4.3 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC1 trên đĩapeptri .38Hình 4.4 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng DC2 trên đĩapeptri 39Hình 4.5 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC5 trên đĩapeptri 40Hình 4.6 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC9 trên đĩapeptri 41Hình 4.7 Hình ảnh minh họa khả năng chịu axit của chủng MC10 trên đĩapeptri 42Hình 4.8 Đường cong tăng trưởng của chủng MC9 43

Hình 4.9 Trình tự một đoạn gen rDNA 16S của chủng MC9 và Lactobacillus fermentum SFCB2-3 45

Hình 4.10 Cây phân loại dựa trên trình tự rRNA 16S 46

CÁC TỪ VIẾT TẮT

Lb Lactobacillus

Lc Lactococcus

MRS Man, Rogosa, Sharpe

CFU Colony Forming Unit

WHO World Health Organization

FAO Food and Agriculture Organization

OD Optical Density

MỤC LỤC

PHẦN 1 : MỞ ĐẦU 1

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 3

2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn 3

2.1.2 Các nhóm vi khuẩn lactic 3

2.1.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 12

2.2 Hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của người 12

2.2.1 Đặc điểm chung của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người 12

2.2.2 Chức năng các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường tiêu hóa người 13 2.3 Tổng quan về probiotics 14

2.3.1 Khái niệm probiotics 14

2.3.2 Những tính chất có lợi của probiotics 16

2.3.3 Các tiêu chuẩn sàng lọc một chủng vi khuẩn làm probiotics 19

2.4 Khả năng tồn tại và sinh trưởng của vi khuẩn lactic trong đường tiêu hóa người 20

2.5 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic trên thế giới 21

2.6 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic ở Việt Nam 21

PHẦN 3 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23

3.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.2 Thiết bị, hóa chất sử dụng 26

3.2.1 Thiết bị 26

3.2.2 Hóa chất 26

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.31 Phương pháp hoạt hóa giống .26

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh 27

3.3.3 Phương pháp bảo quản giống 27

3.3.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào trong môi trường lỏng 28

3.3.5 Phương pháp khảo sát khả năng chịu muối mật 29

3.3.6 Phương pháp khảo sát khả năng chịu axit 30

3.3.7 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng 30

3.3.8 Phương pháp xử lí số liệu 31

PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

4.1 Kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật 32

4.2 Kết quả khảo sát khả năng chịu axit 34

4.3 Xác định khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của MC9 43

4.4 Kết quả định danh 44

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

Probiotic là chế phẩm gồm các vi sinh vật sống, chủ yếu là vi khuẩnlactic Đây là những vi khuẩn sống tự nhiên trong đường tiêu hóa của conngười và các loài động vật khác Chúng có nhiều tác động có lợi cho sức khỏenhư giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh trongđường ruột, hỗ trợ tiêu hóa, giảm nồng độ cholesterol trong máu và giảmnguy cơ bị ung thư

Để thường xuyên duy trì những tác động này, có thể bổ sung thêm từnguồn thực phẩm lên men có chứa chúng như sữa chua, tôm chua, nem chuahoặc từ các chế phẩm chuyên dụng Hiệu quả của chúng sẽ càng được tăngcường khi các chủng vi khuẩn lactic trong đó đã qua những nghiên cứu sànglọc để đảm bảo chúng có tiềm năng probiotic mạnh

Một trong những tính chất quyết định tiềm năng probiotic của cácchủng vi khuẩn này là khả năng tồn tại, thích nghi được với môi trường trongđường tiêu hóa động vật Chúng phải chịu được môi trường axit ở dạ dày vàthích nghi được với nồng độ muối mật ở ruột và các tác động của các enzymetrong đường tiêu hóa

Những năm gần đây, các loại thực phẩm có các vi sinh vật probiotic rấtđược ưa chuộng ở Việt Nam Tuy nhiên, chưa có nhiều các nghiên cứu phânlập và khảo sát tiềm năng probiotic của hệ vi sinh vật lên men lactic ở nước

ta Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tuyển chọn chủng có khả năng chịu axit và muối mật cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế”, nhằm xác định được một số

chủng có khả năng tồn tại và thích nghi trong đường tiêu hóa động vật, làm

tiền đề cho các nghiên cứu tuyển chọn các dòng vi khuẩn lactic có tiềm năngprobiotic để ứng dụng vào sản xuất.

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.

2.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

2.1.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn là những những vi sinh vật đơn bào, có cấu tạo đơn giản.Chúng có thể hô hấp hiếu khí hoặc yếm khí, trong cấu tạo tế bào của chúngkhông có diệp lục tố [5] Ngoài những đặc điểm chung trên thì đối với mỗinhóm vi khuẩn khác nhau luôn có những đặc điểm riêng đặc trưng cho nhóm

đó Vi khuẩn lactic cũng vậy chúng cũng có những đặc điểm sinh lí sinh hóakhác so với các nhóm vi khuẩn khác và trong mỗi loài sự khác nhau đó càngthấy rõ hơn Mặc dù nhóm vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình tháinhưng nhìn chung tất cả những vi khuẩn lactic đều có những đặc điểm sau

- Chúng không chứa các cytochrom, catalase và nitratoredutase âm tính

2.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa

- Dinh dưỡng của nhóm vi khuẩn lactic khá phức tạp do khả năng tổnghợp các chất cần cho sự sống của chúng rất yếu Không một đại diện nàothuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiếtchứa glucose và NH4+ Đa số chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin,tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin), và các axit amin, cácbazơ purin và pirimidin [5]

- Chúng có khả năng lên men tạo axit lactic bằng cách phân giải nguồnhydrat cacbon có trong môi trường

2.1.2 Các nhóm vi khuẩn lactic

Năm 1857 Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kếtquả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn lactic Năm 1878

Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là Bacterium lactics.Về sau các nhà khoa học đã liên tiếp phân lập được nhiều loài vi khuẩn

lactic khác nhau [1] Và các loài vi khuẩn này được xếp chung vào họ

Tài liệu dẫn Hình Sắp

Cầu Que

Khácnhautùyloài

ChuỗiChuỗi

Tứcầu Chuỗi

Nhiềudạng

46 36-43

34 42

32 53

55 67

-Schleifer 1986Farrow và cộng

sự 1989Schleifer 1986

Sự tập hợp của 5 chi này vào cùng một nhóm vi khuẩn lactic đã đượckhẳng định qua phương pháp phân loại phân tử [2] Ngoài ra có một số loài vi

khuẩn sinh nội bào tử có khả năng lên men tạo axit lactic thuộc chi Bacillus,

Tuy nhiên, các loài này không được xem là vi khuẩn lactic do các đặc điểm

2.1.2.1 Lactobacillus

Giống Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic, gồm

khoảng 80 loài [27] Với mức độ khác nhau rất nhiều về hình thái, đặc điểmsinh hóa và sinh lý Sự không đồng nhất thể hiện ở phổ tỉ lệ mol G+C rấtrộng, từ 32-55% [27] Chúng là những trực khuẩn không sinh bào tử thuộclớp vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong điều kiện kỵkhí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí Những trực khuẩn này thường đứngriêng lẻ hoặc thành chuỗi, thủy phân đường saccharosa mạnh tạo axit lactic,không khử nitrat, chúng phân giải gelatin, indole và H2S Chúng phát triểnmạnh trong môi trường có tính axit, tùy loài mà pH dao động từ 4,5 đến 6,4

Đây là những vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axitamin Người ta

có thể tìm thấy Lactobacillus trong các sản phẩm sữa, thịt, hoặc trong nước

sạch, bùn, bề mặt thực vật, trái cây Các loài thuộc chi này cũng là một phầnquan trọng trong hệ thống vi sinh đường ruột ở người và động vật bậc cao, cótrong khoang miệng, đường ruột và âm đạo

Nhiều kết quả nghiên cứu phân loại sinh hóa và lai DNA cho thấy

Lactobacillus là một nhóm rất đặc biệt.

INCLUDEPICTURE "http://bp0.blogger.com/_FlhB437Wa_U/SClyFlwHv7I/AAAAAAAAArc/TeX5R_U81vA/s400/acidp.jpg" \* MERGEFORMATINET

Hình 1.1 Hình thái tế bào của (a) Lb axitophilus và (b) Lb plantarum

Bảng 1.2 Đặc điểm phân biệt một số loài của chi Lactobacillus [2]

(Theo Bottazzi, 1988)

% AD N

Loại peptido Glycane

Dạn g axit lacti c

49-Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp

D D D DL DL DL

Mặt thực vật Sữa chua Fomat Miệng, âm đạo Miệng, âm đạo Fomat

II

Lb.casei subsp Casei

pseudoplantarum

Lb casei subsp Tolereas

Lb.casei subsp rhamnosus

Lb sake

Lb.bavaricus

Lb Plantarum

47 45- 47 45- 47 45- 47 42- 44 42- 44

45-Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp m-ADP

L DL L L DL L DL

Dạ dày đv nhai lại Fomat, rơm rạ ủ Mồm, âm đạo Ruột non người

Bề mặt thực vật

Bề mặt thực vật Thực vật,fomat

46

44-Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Lys –Asp Orn-D- Asp Lys-Ala Lys-Ala- Ser Lys-Ala

DL DL DL DL DL DL DL DL DL

Fomat Thực vật,fomat Thực vật,fomat Kefir

Ruột non Thực vật,fomat Thực vật Ccác sản phẩm thịt

Các loại bánh

Giống Lactobacillus được chia làm 3 nhóm (Bảng 1.2) [6]:

Nhóm 1: Được gọi là Thermobacterium, lên men đồng hình và ưa

nhiệt Không lên men glucose và đường pentosa Những vi khuẩn này cófructose 1,6 diphosphate aldolasa, chúng phát triển ở 450C

Nhóm 2: Được gọi là Streptobacterium, đây là những trực khuẩn lên

men đồng hình và ưa ấm, nhiều loại của nhóm này có khả năng lên men dịhình Các hexosa được lên men theo con đường EMP tạo thành axit lactic,nhưng các pentosa có thể lên men dị hình

Nhóm 3: gồm những trực khuẩn có tên gọi là Betabacterium, chúng là

những vi khuẩn lên men dị hình bắt buộc Chúng sinh axit lactic, axit acetic,CO2 và ethanol

2.1.2.2 Streptococuss

Đây là những vi khuẩn gram dương bao gồm các cầu khuẩn, đa số lênmen đồng hình và bất động Sau khi phân chia chúng thường tạo thành chuỗi,sống hoại sinh trong đất, bề mặt cây, da người, ruột… Chi này cũng là mộtchi rất lớn trong vi khuẩn lactic, bao gồm nhiều nhóm khác nhau

Ngoài Lactococcus thì trước đây người ta đã xếp thêm Enterococcus vào chi Streptococcus Mặc dù ngày nay đã có sự phân tách và tạo thành những chi mới, chi Streptococcus vẫn là một chi rất lớn và khó phân loại một cách hoàn hảo Enterococcus không có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm Một số loài trong chi này, ví dụ như E faecalis có thể là những vi

khuẩn gây bệnh cơ hội, vì thế không được ưa chuộng trong chế biến thựcphẩm Người ta quan tâm nhiều đến khả năng kháng kháng sinh và khả năngchuyển một số tính trạng thông qua các yếu tố di truyền có khả năng dịch

chuyển Tuy nhiên, vẫn có nhiều nghiên cứu sử dụng E faecium và E faecalis làm probiotic do nhiều loài trong chi Enterococcus cư trú tự nhiên

trong đường ruột của động vật bậc cao và người [10] [36]

2.1.2.3 Leuconostoc

Chi Leuconostoc là những vi khuẩn hình cầu, gram dương, phần lớn

chúng lên men dị hình theo con đường Hecxoso-monophosphat tạo D-lactic

từ glucose Một số loài Leuconostoc cùng với Lactobacillus gây nên quá

trình lên men malolactic, đây là quá trình lên men thứ hai sau lên men rượuvang, nó làm chua rượu vang, quá trình xảy ra mạnh trong vang còn nhiều

axit tactric và axit malic Vì vậy rất dễ nhầm lẫn giữa Leuconostoc với Lactobacillus lên men dị hình có hình thái dạng cầu-que Do đó đã có sự tách

ra một số loài từ cả chi Lactobacillus và Leuconostoc đề hình thành nên chi mới: Weissella, gồm các vi khuẩn “giống như Leuconostoc”, đó chính là các loài trước đây được xem như Ln.paramesenteroides; Lb.confusus; Lb.viridesens …[27] Chi này vì thế có cả dạng hình cầu và que Người ta nhận thấy loài Ln oenos, còn được gọi là Leuconostoc ở rượu, có khả năng

chịu nồng độ rượu và axit cao, vì thể đã được tách ra tạo thành một chi mới,

Oenococcus Trong khi việc phân biệt giữa Oenococcus và Leuconostoc khá đơn giản, thì việc phân biệt giữa Weissella và Leuconostoc vẫn là một vấn đề

nan giải

2.1.2.4 Pediococcus

Pediococcus là một chi trong nhóm vi khuẩn lactic gồm những tứ cầu

hoặc song cầu lên men lactic đồng hình, tạo axit lactic dạng DL hoặc (L+),cókhả năng chịu axit và thủy phân protein yếu Hầu hết chúng không có khảnăng sử dụng lactosa và được đặc trưng bởi GC% ADN từ 34-42 % Người ta

phân biệt Pediococcus bởi khả năng chịu nhiệt, chịu pH, chịu NaCl và khả

năng lên men đường (Bảng 1.3)

Trong công nghệ thực phẩm vai trò của chúng vừa có ý nghĩa tích cực

vừa tiêu cực Chẳng hạn như và P pentosaceus được sử dụng làm giống nuôi

cấy khởi đầu trong sản xuất xúc xích và ủ thức ăn gia súc [27] Chúng cũng

có thể có vai trò quan trọng góp phần vào sự chín của phomat Ngược lại thì

P damnosus lại là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của

chúng có thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl/acetoin, làm cho bia có vị giốngbơ

Hình 1.2 Hình thái tế bào của Leuconostoc mesenteroides

Ngoài Pediococcus thì Aerococcus, Tetragenococcus cũng tạo nên các

vi khuẩn lactic dạng tetrad (4 cầu khuẩn liên kết thành bộ 4) Trong đó chiAerococcus nhìn chung chỉ có vai trò thứ yếu trong công nghệ thực phẩm

Còn chi Tetragenococcus ban đầu được coi là Pediococcus halophilus

Bảng 1.3 Các đặc điểm phân biệt một số loài Pediococcus [2]

+6.5

ND4-6.5

4

+6.5

ND6.5

18

6.5

-Hình 1.3 -Hình thái tế bào của Pediococcus halophilus(a) vàAerococcus

urinaeequi(b)

- -

+ -+/

-++ -+/ -

+ /+

-++-

+-+-+ +

+-+/ -+

+/+++++ -

-+-ND+++ +: dương tính; -: âm tính; +/-: khác nhau tùy chủng; ND: không xác định.

+/-Ngoài đặc điểm là chịu được nồng độ muối rất cao (18%) thì chúng cònmột đặc điểm nữa để phân biệt với các vi khuẩn lactic khác là chúng cần nồng

độ muối khoảng 5% để phát triển Chi này có vai trò quan trọng trong các loạithực phẩm có hàm lượng muối cao, như nước chấm đậu nành

2.1.2.5 Bifidobacterium

Chi Bifidobacterium là những trực khuẩn kị khí không sinh bào tử,

Gram dương, bất động Khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn có thểphân nhánh dạng chữ Y, V tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy chuyềnchúng trở thành những trực khuẩn thẳng hoặc hơi uốn cong với những hạt dựtrữ nhuộm màu xanh metylen Vì vậy khi phát hiện vào năm 1899, vào đầu

thế kỉ XX chi này chi được xem như thuộc vào chi Lactobacillus Theo khóa phân loại Bergey năm 1920, chúng có tên là Lactobacillus bifidus Năm 1967,

Devries và Stouthamer đã chứng minh sự có mặt của enzyme phosphate phosphoketolase Ở nhóm vi khuẩn này và sự vắng mặt của haienzyme là aldolase và glucose-6-phosphatase dehydrogenase – hai enzyme cómặt trong Lactobacilli Từ đó người ta kết luận rằng việc phân loại nhóm

fructose-6-bifido trong chi Lactobacillus là không hợp lý Ngày nay, nhóm này được xếp thành một chi riêng biệt, chi Bifidobacterium, thuộc họ Actinomycetaceae, có

25 loài [2]

Chúng lên men lactic dị hình sản phẩm chính của chúng là axit acetic

và axit lactic, cùng với một lượng nhỏ axit formic, ethanol, axit succinic vàmột điều đặc biệt khác nữa là trong quá trình lên men không sản sinh ra khíCO2 Là những cơ thể catalasa âm,nitrat dương, indol và gelatine âm Chi nàychủ yếu sống ở trên cơ thể động vật bậc cao, có thể gặp chúng ở trong khoangmiệng và đường tiêu hóa của động vật và cả ở côn trùng, thậm chí ở cả bùn,chúng là vi sinh vật tiên phong trong hệ tiêu hóa của người Chúng có ứngdụng quan trọng trong việc sản xuất các chế phẩm vi sinh làm probiotic

2.1.3 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghiệp bảo quản, chếbiến thực phẩm và thức ăn gia súc [5] Từ lâu nhân dân ta đã biết bảo quản vàchế biến các sản phẩm rau quả bằng cách muối chua để kéo dài thời gian sửdụng Chính các vi khuẩn lactic là tác nhân chủ yếu tham gia qua trình lênmen chua Chúng có khả năng lên men đường tạo axit lactic trong môi trường

kỵ khí làm cho pH giảm xuống dưới 5, làm ức chế các loại vi khuẩn gây thối

Hình 1.4 Hình thái tế bào của Bifidobacterium

phát triển Ngày nay, vi khuẩn lactic được sử dụng trong sản xuất sữa chua,phomat, lên men các sản phẩm rau quả, thịt, hải sản

Ngoài ra, nhóm vi khuẩn này còn có nhiều đặc tính có tiềm năngprobiotic nên đã được nhiều nhà nghiên cứu đã và đang quan tâm Việc sửdụng các chủng vi khuẩn lactic trong phòng ngừa và điều trị bệnh cũng nhưphục hồi và duy trì sức khỏe ngày càng phổ biến Ngày nay, chúng còn được

sử dụng trong điều trị làm tăng hệ miễn dịch, giảm cholesterol, ngăn ngừa ungthư [20] [21] Các chủng vi sinh vật được sử dụng làm probiotic thương mại

hiện nay đều thuộc nhóm vi khuẩn lactic, ở hai chi là Lactobacillus và Bifidobacterium [16] Trong đó Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được

sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực probiotic [20] [19] Những loài này đềuđược xem là các vi khuẩn không gây bệnh ở người Hiện nay đang có một số

nghiên cứu sử dụng cả Enterococcus, Streptococcus để làm probiotic [14]

[36] Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm probiotic cónguồn gốc từ vi khuẩn lactic còn rất hạn chế

2.2 Hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của người

2.2.1 Đặc điểm chung của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa người

Hệ tiêu hóa của chúng ta chỉ chiếm một khoảng không gian khá khiêmtốn trong ổ bụng nhưng diện tích bề mặt tiêu hóa của ruột lớn rất lớn Người

ta ước đoán trong ruột chúng ta có hằng hà sa số các loài vi sinh vật khácnhau, gấp hàng chục lần tổng số tế bào trong cơ thể một người trưởng thành.[19]

Khi mới sinh ra, đường tiêu hóa của chúng ta không có bất kì một visinh vật nào kể cả vi khuẩn, do những tiếp xúc đầu tiên với môi trường, từsữa mẹ vi khuẩn bắt đầu xâm nhập Những cá thể vi khuẩn này sau khi thoátqua được dạ dày đến ruột sẽ tăng sinh nhanh chóng, tồn tại và phát triển, dầndần tạo nên quần thể vi sinh vật với sự cân bằng tự nhiên

Khi trưởng thành, vi sinh vật đường ruột ổn định và cân bằng hơn Tuynhiên cũng có thể bị mất cân bằng do ảnh hưởng của môi trường, vệ sinh antoàn thực phẩm, bia rượu, thuốc kháng sinh, thuốc hóa trị liệu, hoặc ngay cảcăng thẳng công việc Vì vậy rối loạn đường ruột vẫn thường xuyên xảy ra

Với người già, vi sinh vật có lợi có xu hướng giảm nhưng vi sinh vậtgây bệnh lại tăng, do đó người già thường xuyên bị rối loạn tiêu hóa như tiêuchảy, táo bón, viêm đại tràng, sình bụng, đi phân sống , giảm khả năng hấpthụ dinh dưỡng, giảm đề kháng, bệnh tật, kể cả ung thư ruột kết.

Về mặt khoa học, chúng được biết là một hệ vi sinh vật sống Chúngsinh sôi nảy nở trong đường ruột non, đại tràng của người và phần lớn chúngtồn tại mà không cần oxy [19] Hàng trăm ngàn tỷ vi sinh vật sống này là sựcân bằng giữa vi khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại Bắt đầu từ dạ dày, vi khuẩn

gần như bằng không, chỉ có vi khuẩn gây loét dạ dày Helicobacter pylori là

có thể hiện diện, số lượng tăng dần ở ruột non và ruột già Trong đó sự có mặtcủa vi khuẩn có lợi đóng vai trò vô cùng quan trọng cho chức năng tiêu hóa

và giúp cân bằng hệ vi khuẩn ruột

2.2.2 Chức năng các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường tiêu hóa người

Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong đường đường ruột của chúng ta lànhững vi sinh vật sống có hại, có lợi và các loài trung tính khác nhau

Các vi sinh vật có lợi chủ yếu trong đường ruột của chúng ta là các loài

cộng sinh Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus và nấm men [11] [19]

Các tác động của nhóm vi khuẩn có lợi :

 Chúng đem lại lợi ích bằng cách tái lập sự cân bằng tự nhiên trong hệtiêu hóa, giúp đường ruột khỏe mạnh bằng cách bám chặt, chiếm lĩnhthành ruột và cạnh tranh chất dinh dưỡng với vi khuẩn có hại; ngănngừa vi khuẩn có hại tấn công và phát triển, tăng cường chức năngchống đỡ của niêm mạc ruột, giúp khống chế vi khuẩn gây hại

 Một số loại vi khuẩn sinh ra các chất kháng khuẩn như bacteriocinsgiúp ngăn ngừa và tiêu diệt mầm bệnh Ngoài ra vi khuẩn cộng sinhcòn giúp tăng cả phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu bằngcách kích thích các tế bào phản ứng miễn dịch (macrophages,lymphocytes), tăng cường sự sản xuất ra các thành phần miễn nhiễm(cytolines, immunoglobulins, interferon)

 Một số vi sinh vật có lợi khác trong ruột non lại hạn chế hấp thucholesterol, giúp giảm cholesterol trong máu; sản sinh ra các enzymkhắc phục quá trình tiêu hủy carbohydrat, làm thuận tiện hơn việc hấpthụ năng lượng từ các chất dinh dưỡng

 Vi sinh vật có lợi giúp tăng khả năng dung nạp lactose nhờ kích thíchsản sinh lactaze

Bên cạnh lợi ích của vi khuẩn có lợi thì luôn có sự tồn tại của các vi

khuẩn có hại như Escherichia coli, Shigella, Staphylococcus aureus, Clostridium, Veillonella… [19] Các vi khuẩn có hại này khi xâm nhiễm vào

đường ruột sã gây ra các tác động xấu đến sức khỏe mgười tiêu dùng như ngộ

độc thực phẩm ( Salmonella), viêm nhiễm đường ruột (Campylobacter), rối loạn tiêu hóa (Enterotoxigenic E coli, Enterotoxigenic E coli, Enteroinvasive

E coli, Enterohaemorrhagic E coli)…

Tuy nhiên khi nào vi khuẩn có lợi và vi khuẩn trung tính này cạnh tranhnhau để giành lấy không gian trong đường ruột thì vi khuẩn có hại không có

cơ hội nhân lên Thường thì hệ vi khuẩn trong đường ruột của chúng ta rấtbền vững Ngay cả khi hệ khuẩn ruột bị rối loạn rất nặng do dùng kháng sinhhoặc tiêu chảy thì chúng vẫn có thể phục hồi một cách nhanh chóng khinguyên nhân gây nên rối loạn này được loại bỏ Tuy vậy đôi khi vẫn cótrường hợp những vi khuẩn có hại chiếm ưu thế trong đường ruột

2.3 Tổng quan về probiotic

2.3.1 Khái niệm probiotic

Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con ngườikhông phải là mới Hàng nghìn năm về trước, trước khi tìm ra thuốc khángsinh, con người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợichẳng hạn như các sản phẩm sữa lên men Các nhà khoa học đầu tiên, nhưHippocrates và những người khác cũng chỉ định sữa lên men với tính chấtdinh dưỡng và dược tính của nó, để chữa trị rối loạn ruột và dạ dày(Oberman, 1985) [10] Còn đối với nhà sinh lý học người Nga, EliMetchnikoff (1907) thì "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối vớithực phẩm làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh

vật trong người của chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vậthữu ích " [21].

Một vài năm trước bài thảo luận cuả Metchnikoff, Pastuer và Joubert(1877) [10], trong khi quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã nhậnthấy sự tiêu thụ vi khuẩn không gây bệnh có thể kiểm soát các vi khuẩn gâybệnh Ngoài ra, cùng thời gian này, Henry Tissier, một bác sĩ khoa nhi người

Pháp đã phân lập Bifidobacterium, một thành viên của nhóm vi khuẩn lactic,

từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ (Tissier, 1906) [18] và nhận thấychúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi vàShimamura, 1993)

Như vậy nền tảng cho khái niệm hiện đại về probiotic đã được thànhlập từ rất lâu và việc nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ

ăn uống đã được tiếp tục suốt các thế kỷ vừa qua

Định nghĩa chung này sau đó chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông địnhnghĩa probiotic như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnhhưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của

nó [21] Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vikhuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sungtrong thực phẩm lên men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏecủa vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn cócủa vật chủ” (Havenaar và Huis in't Veld, 1992) [21] [10]

Với Tannock et al., 2000 thì probiotic là “vi sinh vật sống có lợi chovùng ruột, góp phần vào việc cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột và có tácđộng tốt đến sức khỏe của người tiêu dùng ” [38]

Tóm lại, đó là những vi khuẩn tốt sống trong đường tiêu hóa và ngay cả

trong âm hộ Thí dụ điển hình về probiotic là vi khuẩn Bifidobacterium và vi khuẩn Lactobacillus trích từ hệ vi sinh đường ruột [19].

2.3.2 Những tính chất có lợi của probiotic

Probiotic được coi như là một thực phẩm chức năng rất được ưa chuộngbởi các tính năng của nó mang lại Những tác động chủ yếu của các chủng vikhuẩn probiotic tới sức khỏe con người gồm những mặt chính như sau:

 Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản chúng bám vào thành ruột

Probiotic khi được bổ sung vào cơ thể, các vi sinh vật này sau khi vượtqua các rào cản về lý học và hóa học trong hệ dạ dày- ruột non thì chúng sẽtiến hành bám dính vào thành ruột để thực hiện các chức năng có lợi cho cơthể vật chủ Chúng cạnh tranh nơi ở với vi khuẩn gây bệnh, ngăn cản khôngcho các vi khuẩn này bám vào thành ruột, từ đó làm giảm số lượng vi khuẩnngăn chặn các mầm bệnh [21]

 Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được hữu hiệu hơn

Đối với những người thường bị chứng bất dung nạp đường lactosetrong các sản phẩm sữa do trong ruột không có enzyme tiêu hóa loại đườngnày thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa được dễ dàng hơn [21]

 Giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh

Việc sử dụng probiotic để phòng ngừa tiêu chảy gây ra bởi thuốc khángsinh rất được quan tâm

Sự phát triển một cách rộng rãi và đặc hiệu cao của thuốc kháng sinh đãkhiến cho ngành y học quá tin tưởng vào phương pháp trị liệu kháng sinh.Tuy nhiên, tác động loại bỏ của thuốc kháng sinh không phân biệt được mầmbệnh thật sự và hệ vi sinh vật có lợi trong ruột Vì vậy, phương pháp trị liệukháng sinh cũng dẫn đến thay đổi hệ cân bằng của ruột và gây ra một vài ảnhhưởng xấu mà có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngừng sử dụng cách điềutrị này

Bên cạnh đó, sự xuất hiện nhanh của nhiều chủng vi khuẩn kháng lại

kháng sinh chẳng hạn như Enterocci kháng vancomycin và Staphylococcus aureus kháng methicillin là một vấn đề đáng quan tâm Hơn nữa, một vài

bệnh lây nhiễm lại gia tăng và trở nên trầm trọng hơn trong điều trị thuốc

khág sinh Ví dụ, bệnh tiêu chảy có thể do Clostridium difficile, một mầm

bệnh cơ hội, hoạt động và tăng nhanh khi có sự mất cân bằng của hệ vi sinhvật trong ruột thông thường diễn ra trong suốt quá trình điều trị kháng sinh[21] Mặc dù bệnh này nói chung được điều trị thành công với một loại thuốckháng sinh thứ hai, tuy nhiên một vài bệnh lây nhiễm vẫn tái diễn mặc chocác phương pháp trị liệu kháng sinh khác (Sanders, 1999)

Về sau việc sử dụng probiotic đã cải thiện đáng kể hệ vi sinh vật nộisinh (Markowitz và Bengmark, 2002) bằng cách thay thế các vi khuẩn có ích

bị mất So với các nhược điểm như đắt, tính hóa học và xâm hại ruột củathuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotic là an toàn, nguồn gốc tự nhiên, vàphần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào

Ngoài tác dụng giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc khángsinh thì việc sử dụng probiotic còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ tiêu chảygây ra bởi các loại virut gây bệnh [21]

 Tăng cường hệ miễn dịch

Probiotic như một vị thuốc chứa các phân tử chống viêm cho đườngruột Đồng thời góp phần đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào vật chủ để giảmcác phản ứng viêm bằng cách tạo các phản ứng miễn dịch cho cơ thể

 Ngừa ung thư ruột

Một vài nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật probiotic có thể ngănchặn hoặc làm chậm quá trình ung thư ruột Theo như các ghi nhận trước đóthì các thành viên của hệ vi sinh vật đường ruột có khả năng sản sinh ra chấtgây ung thư nitrosamines Do dó việc sử dụng Lactobacilii và

Bifidobacterium về mặt lí thuyết có thể giảm bớt được mức độ sản sinh ra các

chất gây ung thư này (Hosada et al, 1996) Tuy nhiên cũng quá sớm để đưa rakết luận cuối cùng về hiệu quả của probiotic trong việc ngừa ung thư ruột[ 21][34]

 Giảm cholesterol trong máu.

Hàm lượng cholesterol trong huyết thanh ảnh hưởng rất lớn đến cácbệnh về tim mạch Nếu hàm lượng này cao hơn 1mmol so với mức bìnhthường thì người bệnh đang ở mức độ nguy hiểm của các bệnh về tim mạch

(>35%) và có thể gây chết người nếu cao hơn 45 % Vì vậy chỉ cần giảm 1 %hàm lượng cholesterol trong máu là có thể giảm được mức độ nguy hiểm củacác bệnh về tim mạch từ 2 đến 3 % (Masnon etal, 1992) [27] Và việc sử dụngcác sản phẩm probiotic có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trongmáu [34] [10] Một trong những bằng chứng đầu tiên đó là việc sử dụng

probiotic lactobaccilii trong các sản phẩm có ảnh hưởng tốt đến tim mạch,

bao gồm cả khả năng ngăn ngừa và điều trị các hội chứng thiếu máu cục bộcủa tim (Oxman et al, 2001) và giảm đáng kể hàm lượng cholesterol trongmáu (De Roos và Katan) , 2000 [18]

 Giảm thiểu hiện tượng dị ứng.

Lb rhamnousus GG đã được thử nghiệm trên hai đối tượng có mức độ

dị ứng cao đó là phụ nữ 6 tuần trước khi sinh và trẻ sơ sinh trong vòng 6tháng Kết quả cho thấy có sự giảm có ý nghĩa về mức độ dị ứng (Kalliomaki

et al , 2001) Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của probiotic trong việc tạo

ra các phản ứng giúp cơ thể chống lại các chất lạ xâm nhập vào cơ thể vàngăn ngừa hiện tượng dị ứng xảy ra Trong các nghiên cứu y học khác vềbệnh dị ứng của trẻ em với sữa bò, người ta thấy rằng chứng viêm da di ứng

này có thể giảm bớt khi sử dụng thực phẩm probiotic của chủng Lb rhamnousus và B lactics BB-12 (Majamaa và Isolauri, 1996; 1997; Isolauri et

al, 2000) [18]

Ngoài các ứng dụng chính trên thì probiotic theo như các nghiên cứukhác còn có khả năng thuyên giảm triệu chứng đường ruột của hội chứng ruột

bị kích thích, nhiễm nấm âm đạo, nhiễm Helicobacter pylori ở dạ dày, bệnh

viêm ruột, và nhiễm trùng đường tiết niệu [21] [34]

2.3.3 Các tiêu chuẩn sàng lọc một chủng vi khuẩn làm probiotic

Không phải bất cứ loài vi khuẩn, nấm men hay vi sinh vật đơn bào nàocũng có khả năng sử dụng làm probiotic Chính số lượng và sự đa dạng củacác loài vi sinh vật làm cho việc sàng lọc trở nên khó khăn Vì vậy để quátrình sàng lọc có hiệu quả hơn trong ứng dụng thì đòi hỏi phải tiến hành cả thí

nghiệm in vitro và in vivo [19]

Các nghiên cứu in vitro được sử dụng để đánh giá các đặc tính của vi

sinh vật, làm cơ sở cho việc sàng lọc các chủng có tiềm năng làm probiotic

Còn thí nghiệm in vivo đòi hỏi nhiều thời gian và số lượng lớn động vật cho

việc thử nghiệm, do đó, phương pháp này chỉ có thể sử dụng sau khi đã chọnlọc được một số chủng có tiềm năng làm probiotic (Martins và cộng sự ,2008) [31]

Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic phải chịu sự tác độngđồng thời hay liên tiếp các điều kiện bất lợi như sốc nhiệt nhẹ (nhiệt độ cơthể), tính axit của dịch dạ dày, các enzyme trong dịch tụy, lysozyme và muốimật (Klaenhammer và Kullen, 1999)[26] và khả năng ức chế sự phát triển củacác vi sinh vật gây bệnh, khả năng cạnh tranh sự bám dính với vi khuẩn gâybệnh và giảm sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh vào đường ruột.Trường hợpprobiotic không có nguồn gốc từ đường tiêu hóa của động vật thì vấn đề nàyrất cần được quan tâm

WHO và FAO trong tuyên bố chung về tiêu chuẩn probiotic đã giớithiệu một số tiêu chuẩn chủ yếu như sau [22]:

- Khả năng chịu pH thấp của dạ dày

- Khả năng chịu muối mật

- Khả năng phân giải muối mật

- Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh

- Khả năng bám dính đường ruột

- Khả năng bám dính biểu mô âm đạo (chuyên dùng cho cho sản phẩmprobiotic giúp cân bằng hệ vi sinh niệu – sinh dục

Đây cũng là các kiểm nghiệm in vitro đang được dùng rộng rãi trong

quá trình sàng lọc các chủng vi khuẩn làm probiotic trên thế giới

Sau khi hoàn thành các thí nghiệm in vitro chúng ta sẽ có được các

nhận xét sơ khảo về đặc tính của các chủng đang test, làm cơ sở cho quá trìnhsàng lọc các các chủng có tiềm năng probiotic [22] [28] Từ đó tiến hành các

thí nghiệm in vivo tiếp theo trên động vật và đối tượng cuối cùng là con người

[22]

2.4 Khả năng tồn tại và sinh trưởng của vi khuẩn lactic trong đường tiêu hóa người

Hệ tiêu hóa của con người là một hệ thống các cơ quan, đó là một ốngdài từ miệng đến hậu môn, gồm thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già Khi tanuốt, đồ ăn được thực quản dẫn xuống dạ dày Dạ dày co bóp, trộn lẫn đồ ănvới dịch vị, gồm axit và men tiêu hóa Sau đó đồ ăn được đẩy xuống ruột non,dưới tác dụng của nhiều men tiêu hóa khác, thức ăn được chuyển thành cácchất dễ hấp thu hơn và được ruột non hấp thu vào máu, còn các chất bã đượcđẩy xuống ruột già Ruột già hút bớt nước, làm đặc chất bã, đóng khuôn và cobóp để thải chất bã ra ngoài Tuy nhiên đi kèm với thức ăn vào miệng là rấtnhiều loại vi khuẩn kể cả vi khuẩn có lợi và có hại từ môi trường

Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng vi khuẩn lactic là những vi sinh vật

có số lượng và khả năng tồn tại trong ruột người khá cao Điển hình đó là các

vi khuẩn lactic ở 2 chi Bifidobacterium và Lactobacillus [19] [21].

Rất nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn có lợiđược bổ sung vào cơ thể duới dạng probiotic [30] [13] Trở ngại đầu tiên củacác chủng probiotic này là dịch axit trong dạ dày, nó có thể hủy diệt một sốlượng lớn các vi sinh vật đi vào trong cơ thể Để có thể tồn tại được đòi hỏicác chủng probiotic phải còn sống sau 2giờ - 4giờ trong dạ dày dưới điều kiện

pH thấp Trong trường hợp những vi khuẩn này vượt qua được rào cản hóahọc là lớp dịch có tính axit tương đối mạnh của dạ dày thì mối tương tác giữachúng với các vi khuẩn trong ruột cũng sẽ làm hạn chế sự lây lan của vi khuẩnxâm nhập có hại

Sau đó là khả năng chịu muối mật trong ruột non cũng như các enzymetrong ruột non Những dòng được xem là kháng muối mật tốt là những dòng

có khả năng tăng trưởng tốt trong môi trường có các nồng độ muối mật trongkhoảng 0,15 – 0,3% [33]

2.5 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic trên thế giới

Hiện nay, có rất nhiều nghiên phân lập và tuyển chọn các dòng vikhuẩn lactic để làm probiotic [10] [36] Và một trong những tiêu chuẩn quantrọng nhất được chú ý nghiên cứu khi chọn lọc chủng probiotic là khả năngsống sót và thích nghi trong đường tiêu hóa, với 2 đặc điểm nổi bật là chịuaxit và chịu muối mật [ 35]

M T Liong và N P Shah (2005) [33] tiến hành khảo sát khả năng chịu

axit và muối mật của 11 chủng Lactobacillus và cho kết quả khả quan về khả

năng chịu axit và muối mật của các chủng này, thời gian trung bình để tăng

OD lên 0,3 đơn vị trong khoảng từ 2,3 đến 4,6 giờ (tính trong pha logarit).Khả năng sống sót ở pH 2 giảm rất mạnh và thay đổi lớn tùy theo chủng Sau

120 phút ủ ở pH 2, hai tác giả này nhận thấy lượng tế bào sống đã giảm từkhoảng 10 (log CFU/ml) xuống còn từ 4,2 đến 7,5 (log CFU/ml) tùy theochủng

Suskovic và cộng sự (2000) [22] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởngcủa các loại muối mật lên khả năng tăng trưởng của chủng probiotic M92, kếtquả cho thấy chủng bị giảm khoảng từ 40-60 % khả năng tăng trưởng trongmôi trường muối mật

Khalil và cộng sự (2007) [24] cũng đã khảo sát tiềm năng probiotic củamột số chủng vi khuẩn lactic phân lập ở Ai Cập, kết quả cho thấy khả năngchịu axit và muối mật tốt nhất rơi vào các chủng thuộc các loài

Bifidobacterium longum, Lb fermentum, Lb plantanum.

2.6 Tình hình nghiên cứu khả năng chịu axit và muối mật của vi khuẩn lactic ở việt Nam.

Ở Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về khả năng chịu muối mật còn ít

và phạm vi nghiên cứu còn hạn chế Các nghiên cứu in vitro về các chủng có

tiềm năng probiotic như của Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu (2009) [7].Nghiên cứu khả năng sống trong môi trường đường tiêu hóa của động vật một

số chủng vi sinh vât nhằm từng bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuấtprobotic Nhóm tác giả đã phân lập được một số chủng nấm men có khả năngthích nghi cao với các điều kiện đường ruột và có thể làm probiotic Tuynhiên, hiện nay các sản phẩm probiotic có chứa vi khuẩn lactic vẫn được ưachuộng hơn do có nhiều ưu điểm vượt trội

Các tác giả Nguyễn Vũ Tường Vy, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa(Bộ môn Vi sinh Ký sinh – Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM) (2007) [9]

thực hiện khảo sát vi sinh vật probiotic gồm vi khuẩn Lactic (Lactobacillus aci-dophilus, Lactobacillus casei, Streptococus fae-calis), vi khuẩn tạo bào tử Bacillus subtilis và nấm men Saccharomyces boulardii nhằm khảo sát khả

năng chịu đựng axit, muối mật và kháng sinh của một số vi sinh vật là nguyênliệu sản xuất probiotic dùng đường uống Tuy nhiên, các tác giả vẫn chưaphân lập được các chủng sống sót được ở pH 2 sau 2 giờ Kết quả cho thấysau 2 giờ tất cả các chủng đều mất khả năng sống ở pH 2.

Như vậy ở Việt Nam mặc dù chưa có nhiều nghiên cứu nhưng thôngqua các nghiên cứu trên cho thấy probiotic đã trở thành một đối tượng đượcchú ý nhiều trong cộng đồng khoa học và sản xuất Việt Nam có một tiềmnăng rất lớn về đa dạng vi sinh vật chưa được khai thác Trong đó, Huế vốn

đã nổi tiếng với các sản phẩm lên men chua lactic truyền thống, và có thểtiềm ẩn những chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic mạnh Do đó,

chúng tôi chọn đề tài “Tuyển chọn chủng có khả năng chịu axit và muối mật cao từ các chủng vi khuẩn lactic trong một số sản phẩm lên men lactic trên địa bàn thành phố Huế” nhằm sơ bộ khảo sát một số đặc điểm

ban đầu để chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic có tiềm năng probiotic

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 12 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các sảnphẩm lên men lactic truyền thống (tôm chua, nem chua, dưa cải chua, măngchua, nước chua trong sản xuất đậu phụ) trên địa bàn thành phố Huế, đã đượcphân lập và định danh ở mức độ chi tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh,Viện Tài nguyên môi trường và Công nghệ sinh học Huế (Bảng 3.1, Hình3.1)

Bảng 3.1 Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm

STT Nguồn phân lập Tên chủng Catalase/Gram Kết quả định

DC1 DC2

N1 N5

N10 NC10

NC13 MC5

MC9 MC10

T9 T10

Hình 3.1 Hình thái tế bào và nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic

sử dụng trong thí nghiệm

3.2 Thiết bị ,hóa chất sử dụng

3.2.1 Thiết bị

Tủ ấm Incubactor MiR.262 - Nhật

Tủ lạnh Sanyo - Nhật

Máy đo pH Hanna - Ý

Máy đo quang phổ quang phổ kế UV/VIS - Nhật

No.3, Merck ( Sodium chocolate và sodium deoxycholate)

Các hóa chất được cung cấp bởi Meck

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp hoạt hóa giống

Nguyên tắc :

Giống ban đầu thường được bảo quản trong điều kiện lạnh -30 oC Khi

sử dụng để nuôi cấy và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo cần phải hoạt hóa

để giống có được khả năng sinh trưởng và phát triển bình thường

Tiến hành:

Lấy 100µl dịch rã đông của giống vi khuẩn cho vào eppendoft có chứa900µl dịch pepton 0,1% Đem ủ trong 1giờ ở tủ ấm 370 C Sau đó sử dụng cấychuyền qua các môi trường phục vụ nghiên cứu

Thành phần dịch pepton 0,1%; pH 7,2

Nước cất đủ 1lít

Nguyên tắc:

Trong môi trường lỏng vi khuẩn có khả năng tiếp xúc các chất dinhdưỡng dễ dàng hơn, khả năng phát triển ổn định và từ đó thu được sinh khốicho các nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành:

Dùng que cấy tròn lấy 1 khuẩn lạc đơn đánh đều vào eppendoft có chứa

1 mL MRS lỏng, nuôi ở tủ ấm 37 0C trong 24 giờ

Đủ 1l

Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH môi trường về 6,2.Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong 15 phút

3.3.3 Phương pháp bảo quản giống

Giống được bảo quản để nhằm mục đích sử dụng thường xuyên trongnghiên cứu thí nghiệm và bảo quản lâu dài [4] [17]

Để bảo quản giống các chủng vi khuẩn lactic, chúng tôi tiến hành nhưsau:

* Bảo quản thường xuyên: giống được cấy chuyền trong eppendorf cóchứa 1ml môi trường MRS lỏng và ủ ở 37oC trong 24 giờ, sau đó được giữlạnh 4oC Giống bảo quản có thể được sử dụng cấy tăng sinh để thu sinh khối

nghiên cứu mà không cần phải hoạt hóa, tuy nhiên giống này chỉ sử dụngtrong khoảng 10 ngày và phải thường xuyên cấy chuyền.

* Để bảo quản giống lâu dài chủng cũng được nuôi tăng sinh giống nhưbảo quản thường xuyên, sau đó li tâm thu sinh khối ở tốc độ 5000 vòng/phút,loại bỏ dịch nổi, bổ sung 1ml môi trường MRS có glycerol (30%) vàoeppendoff và giữ ở -30oC

3.3.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong môi trường lỏng 3.3.4.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp (phương pháp Koch)

Nguyên tắc : Mẫu có chứa sinh khối vi sinh vật khi được pha loãng ở

nồng độ thích hợp và trang lên môi trường rắn thì mỗi tế bào vi khuẩn sẽ pháttriển thành một khuẩn lạc đơn Do đó, đếm số khuẩn lạc đơn sẽ xác định được

số tế bào ban đầu trong dịch pha loãng và qua đó tính được số tế bào ban đầutrong dịch gốc Số tế bào được xác định bằng đơn vị log CFU/ml

Tiến hành : Mẫu được pha loãng liên tiếp theo tỉ lệ pha loãng 10 lần

thành các mẫu từ 100 đến 10-5 bằng pepton 0,1% và lấy 50µl trang trên đĩapetri đường kính 10cm có chứa môi trường MRS Mẫu được ủ 48h ở 37oC vàđếm số khuẩn lạc đơn Kết quả được tính như sau :

Log CFU/ml = log (Ai Di / V) (3.1)Trong đó:

Ai là số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa

Di là độ pha loãng

V là dung tích huyền phù cho vào mỗi đĩa

3.3.4.2 Phương pháp đo mật độ quang [1] [8]

Nguyên tắc : Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ

lửng sẽ bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so vớicường độ tia sáng đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽphản ánh một cách tương đối lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường Ngoài

ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng, do đó, lượngánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môi trường lỏng Đểđánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế bào như các hạtrắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch có tế bào nuôi cấy, đối