3.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống
Nguyên tắc :
Giống ban đầu thường được bảo quản trong điều kiện lạnh -30 oC. Khi sử dụng để nuôi cấy và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo cần phải hoạt hóa để giống có được khả năng sinh trưởng và phát triển bình thường.
Tiến hành:
Lấy 100µl dịch rã đông của giống vi khuẩn cho vào eppendoft có chứa 900µl dịch pepton 0,1%. Đem ủ trong 1giờ ở tủ ấm 370 C. Sau đó sử dụng cấy chuyền qua các môi trường phục vụ nghiên cứu.
Thành phần dịch pepton 0,1%; pH 7,2
Pepton 1g
NaCl 0,5g
Nguyên tắc:
Trong môi trường lỏng vi khuẩn có khả năng tiếp xúc các chất dinh dưỡng dễ dàng hơn, khả năng phát triển ổn định và từ đó thu được sinh khối cho các nghiên cứu tiếp theo.
Tiến hành:
Dùng que cấy tròn lấy 1 khuẩn lạc đơn đánh đều vào eppendoft có chứa 1 mL MRS lỏng, nuôi ở tủ ấm 37 0C trong 24 giờ.
Bảng 3.2. : Thành phần môi trường MRS rắn/Lít [7, 37]
( Môi trường MRS lỏng không bổ sung agar)
Thành phần Số lượng (g)
Pepton Cao thịt Cao nấm Glucose
Sorbitan monooleate (Tween 80) K2HPO4 MgSO4.7H2O MnSO4 .4H2O (NH4 )2 C6H6O7 CH3COONa.3H2O Agar Nước cất 10 8.0 4.0 20.0 1.0 2.0 0.2 0.05 2.0 5.0 15.0 Đủ 1l
Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH môi trường về 6,2. Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong 15 phút.
3.3.3. Phương pháp bảo quản giống
Giống được bảo quản để nhằm mục đích sử dụng thường xuyên trong nghiên cứu thí nghiệm và bảo quản lâu dài [4] [17].
Để bảo quản giống các chủng vi khuẩn lactic, chúng tôi tiến hành như sau:
* Bảo quản thường xuyên: giống được cấy chuyền trong eppendorf có chứa 1ml môi trường MRS lỏng và ủ ở 37oC trong 24 giờ, sau đó được giữ lạnh 4oC. Giống bảo quản có thể được sử dụng cấy tăng sinh để thu sinh khối
nghiên cứu mà không cần phải hoạt hóa, tuy nhiên giống này chỉ sử dụng trong khoảng 10 ngày và phải thường xuyên cấy chuyền.
* Để bảo quản giống lâu dài chủng cũng được nuôi tăng sinh giống như bảo quản thường xuyên, sau đó li tâm thu sinh khối ở tốc độ 5000 vòng/phút, loại bỏ dịch nổi, bổ sung 1ml môi trường MRS có glycerol (30%) vào eppendoff và giữ ở -30oC.
3.3.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn trong môi trường lỏng 3.3.4.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp (phương pháp Koch)
Nguyên tắc : Mẫu có chứa sinh khối vi sinh vật khi được pha loãng ở
nồng độ thích hợp và trang lên môi trường rắn thì mỗi tế bào vi khuẩn sẽ phát triển thành một khuẩn lạc đơn. Do đó, đếm số khuẩn lạc đơn sẽ xác định được số tế bào ban đầu trong dịch pha loãng và qua đó tính được số tế bào ban đầu trong dịch gốc. Số tế bào được xác định bằng đơn vị log CFU/ml.
Tiến hành : Mẫu được pha loãng liên tiếp theo tỉ lệ pha loãng 10 lần
thành các mẫu từ 100 đến 10-5 bằng pepton 0,1% và lấy 50µl trang trên đĩa petri đường kính 10cm có chứa môi trường MRS. Mẫu được ủ 48h ở 37oC và đếm số khuẩn lạc đơn. Kết quả được tính như sau :
Log CFU/ml = log (Ai . Di / V) (3.1) Trong đó:
Ai là số khuẩn lạc trung bình trên một đĩa Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù cho vào mỗi đĩa 3.3.4.2. Phương pháp đo mật độ quang [1] [8]
Nguyên tắc : Khi ánh sáng đi qua môi trường lỏng có nhiều hạt rắn lơ
lửng sẽ bị tán xạ trở lại và dẫn đến cường độ tia sáng ló ra thấp hơn so với cường độ tia sáng đi vào, việc so sánh độ chênh lệch cường độ tia sáng sẽ phản ánh một cách tương đối lượng chất rắn lơ lửng trong môi trường. Ngoài ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng, do đó, lượng ánh sáng đi qua cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môi trường lỏng. Để đánh giá mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy, ta có thể xem tế bào như các hạt rắn lơ lửng, và tiến hành đo mức hấp thụ của dịch có tế bào nuôi cấy, đối
chiếu với môi trường lỏng không có sinh khối sẽ cho ra lượng tương đối của sinh khối vi khuẩn.
Lượng ánh sáng bị hấp thụ tỉ lệ tuyến tính với mật độ tế bào theo định luật Lumber-Beer, điều kiện nghiệm đúng của định luật là ở mức OD thấp (dưới 1), do đó, cần tiến hành pha loãng để mẫu đo luôn có OD thấp hơn 1. OD thật sự của dịch được tính lại bằng cách nhân với độ pha loãng.
Tiến hành :
Chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MRS lỏng trong eppendorf 1ml. Sinh khối được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 600nm với mẫu trắng (blank) là môi trường MRS không nuôi cấy. Mẫu được pha loãng (nếu cần) bằng môi trường MRS lỏng.
3.3.5. Phương pháp khảo sát khả năng chịu muối mật [33] [11]
Nguyên tắc:
Khảo sát khả năng chịu muối mật của các chung vi khuẩn lactic trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 0,3% muối mật (No.3, Merck) dựa trên phương pháp của Gilliand và Walker (1990) [15].
Các bước tiến hành: Quá trình khảo sát được tiến hành theo các bước
sau :
1. Hoạt hóa giống gốc chủng vi khuẩn cần khảo sát (phần 3.3.1) 2. Tiến hành nuôi cấy tăng sinh (phần 3.3.2)
3. Tiến hành phân phối giống sau khi tăng sinh vào các eppendoff (tỉ lệ thể tích 1/10) trong môi trường MRS lỏng có bổ sung muối mật 0,3 %. 4. Ủ các eppendoff có chứa dịch vi khuẩn trên ở 370C và tiến hành lấy
mẫu ở 0 giờ, 4 giờ (mỗi giờ 3 eppendoff )
5. Đo OD sau mỗi mốc giờ tại bước sóng 600nm và tính kết quả theo công thức 3.2
Tính kết quả : Mức độ chịu muối mật được xá định bằng thời gian
trung bình để tăng OD lên 0,3 đơn vị 0 4 OD OD 0,3 4 t − × = (giờ) (3.2) Trong đó: t : Thời gian tăng OD lên 0,3 đơn vị.
OD4: OD ở mốc thời gian 4 giờ. OD : OD ở mốc thời gian 0 giờ.
3.3.6. Phương pháp khảo sát khả năng chịu axit [33], [11]
Nguyên tắc:
Khả năng chịu axit của các chủng khảo sát được đánh giá qua lượng vi khuẩn sống sót sau khi ủ ở pH 2, số tế bào vi khuẩn sống sót được xác định theo phương pháp Kock (Do lượng tế bào sống sót ít nằm dưới ngưỡng đo OD).
Tiến hành: Quá trình khảo sát được tiến hành theo các bước sau
1. Hoạt hóa giống gốc chủng vi khuẩn cần khảo sát (phần 3.3.1) 2. Tiến hành nuôi cấy tăng sinh (phần 3.3.2)
3. Ly tâm thu sinh khối ở 500 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng 4. Rửa sinh khối bằng đệm phosphate 0,1M pH 7 2 lần (1 lần 1ml
đệm/eppendoff)
5. Tái huyền phù trong 1ml đệm trên bằng votex
6. Trộn 1ml dịch sau khi tái huyền phù với 24,5 ml dung dịch có pH = 2 (Điều chỉnh dung dịch NaCl 0,2 % đến pH = 2 bởi HCl)
7. Phân phối vào 12 ống eppendoff (1ml dịch tái huyền phù/ống eppendoff)
8. Tiến hành ủ các eppendoff có chứa dịch trộn trên ở các mốc thời gian khác nhau (0 giờ, 1giờ, 2 giờ, 3 giờ)
9. Lấy mẫu sau mỗi mốc giờ (mỗi giờ 3 eppendoff), pha loãng từng eppendoff thành các nồng độ khác nhau và chọn 3 nồng độ thích hợp dàn đều (50µl) lên đĩa thạch MRS pH 6,2 (3 đĩa thạch cho 1 eppendoff) 10. Ủ các đĩa peptri ở 370 C trong vòng 48 giờ
11. Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc và tính kết quả theo công thức 3.1
3.3.7. Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng
Cấy chuyền giống đã qua 24 giờ nuôi cấy vào các eppendoff có chưa 1ml môi truờng MRS lỏng pH 6,2 sao cho OD ban đầu đạt 0,05 ỏ bước sóng 600 nm.
Ủ mẫu trong tủ ổn nhiệt 37oC và lấy mẫu theo thời gian từng giờ 1 trong 8 giờ đầu, 2 giờ một lần trong 32 giờ tiếp theo và 8 giờ một lần trong 48 giờ sau đó, mẫu được đo sinh khối thông qua OD ở bước sóng 600nm.
3.3.8. Phương pháp xử lí số liệu [3]
Số liệu được tính trung bình, độ lệch chuẩn và xử lý ANOVA bằng chương trình SAS 9.0.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.
4.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật
Havenaar và cộng sự (1992) [18] đã chỉ ra rằng probiotic chỉ phát huy tác dụng có lợi lên vật chủ khi chúng định cư và tồn tại trong ruột non. Môi trường ruột non chứa pancreatine và muối mật là các yếu tố ức chế sinh trưởng của vi sinh vật. Theo Gilliland và cộng sự (1984) [15], 0,15 - 0,3% được xem là nồng độ quyết định để sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng chống chịu muối mật.
Các chủng khảo sát được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường MRS lỏng trong 24 giờ và được cấy chuyền vào môi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật (No.3, Merck). Mẫu được lấy sau khi ủ 370C ở 0 giờ và 4 giờ, đo OD ở bước sóng 600nm và kết quả được tính theo công thức 3.2.
Khả năng chịu muối mật được đánh giá thông qua thời gian tăng OD lên 0,3 đơn vị. Thời gian càng ngắn thì chứng tỏ chủng có khả năng thích nghi tốt và phát triển được trong môi trường có chứa muối mật (Hình 4.1).
Kết quả cho thấy tất cả các chủng khảo sát đều có khả năng tăng trưởng được trong môi trường muối mật 0,3%, trong đó các chủng DC1, MC9, MC10, DC2, MC5 có khả năng chịu muối mật cao nhất, tốc độ tăng OD lên 0,3 của chủng là khoảng từ 2,34 đến 3,24 giờ. Các chủng N1, N10, T9, T10, N5 có tốc độ tăng OD 0,3 trong môi trường muối mật đạt trung bình, từ khoảng 3,66 giờ đến 4,31 giờ. Nhóm có khả năng kháng muối mật kém là N5, NC13 và NC10, các chủng này cần hơn 5 giờ để gia tăng OD lên 0,3 đơn vị trong pha logarit.
Hình 4.1. Thời gian tăng OD 0,3 của các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS có 0,3% muối mật
a, b, c, d, e: Các mức khác biệt có ý nghĩa khi xử lý ANOVA. Các giá trị có cùng chữ cái xem như không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa p = 0,05.
Kết quả này tương đương với kết quả của Liong và cộng sự (2005) [33]. Nhóm tác giả này đã tiến hành khảo sát khả năng tăng trưởng của vi khuẩn lactic trong môi trường MRS có 0,3% dịch mật bò, kết quả cho thấy thời gian tăng trưởng của các chủng khảo sát trong khoảng 2,36 (Lb. casei
ASCC 1520) đến 4,36 giờ (Lb. casei ASCC 290). Chủng DC1, MC9 trong thí nghiệm của chúng tôi cũng có thời gian tăng trưởng tương đương với nhóm kháng muối mật cao nhất của nhóm tác giả này.
Lin và cộng sự (2007) [28] khi nghiên cứu khả năng chịu muối mật bò (0,3%) của các chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum phân lập từ lợn đã cho thấy sau thời gian tăng OD 0,3 sau 4 giờ khảo sát là vào khoảng từ 1,3
giờ đến 4,1 giờ, trong số 20 chủng được khảo sát có đến 10 chủng có tốc độ tăng OD lên 0,3 dưới 2 giờ, một chủng tăng mạnh nhất, chỉ mất trung bình 1,3 giờ để tăng OD lên 0,3 đơn vị, có hai chủng hầu như không phát triển được trong môi trường có muối mật (OD không thay đổi đáng kể), các chủng còn lại có thời gian tăng OD 0,3 vào khoảng 3 đến 4 giờ .
Mota và cộng sự (2006) [32] cũng đã tiến hành nghiên cứu khả năng kháng muối mật của 3 chủng vi khuẩn Lb. acidophilus phân lập từ gà, kết quả có 1 chủng hầu như bị ức chế hoàn toàn khi có dịch mật bò ở nồng độ 0,3% là
Lb. acidophilus 2M14E, hai chủng còn lại có tốc độ tăng trưởng tương đối
nhau là Lb. acidophilus 5C14E và Lb. acidophilus 2G14E với thời gian tăng OD 0,3 đơn vị vào khoảng 2,1 đến 3 giờ.
Từ các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy khả năng kháng muối mật của vi khuẩn lactic bằng thông số thời gian tăng OD lên 0,3 đơn vị trung bình ở vào khoảng 2 – 5 giờ, những chủng kháng mạnh có thời gian khoảng từ 2 đến 3 giờ, và những chủng kháng kém có thời gian trên 4 giờ.
So sánh với một số nghiên cứu như trên, chúng tôi nhận thấy các chủng DC1, MC9, MC10, DC2, MC5 có khả năng chịu muối mật tốt. Trong đó các chủng DC1, MC9 có khả năng kháng muối mật cao. Các chủng MC10, DC2, MC5 có khả năng kháng muối mật khoảng giữa cao và trung bình (thời gian gần bằng 3). Với mục tuyển chọn dòng tiềm năng protiotic mạnh vì thế chúng tôi chọn các chủng kháng cao (DC1, MC9) và cận cao (MC10, DC2, MC5) để tiếp tục khảo sát khả năng chịu axit ở mốc pH 2.
4.2. Khảo sát khả năng chịu axit
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn DC1, MC9, MC10, DC2, MC5 qua các mốc giờ liên tục từ 0 giờ đến 3giờ trong dịch axit có pH 2. Chủng khảo sát được nuôi trong môi trường MRS lỏng trong eppendort ở 37oC trong 24 giờ. Tiến hành ly tâm thu sinh khối và ủ vào dịch pH 2. Mẫu được lấy vào 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ và pha loãng ở các nồng độ khác nhau, dàn đều các nồng độ thích hợp (50µl) lên đĩa thạch MRS. Kết quả được xác định thông qua lượng tế bào còn sống sót sau 3 giờ nuôi cấy bằng phương pháp Koch theo công thức 3.1.
Số lượng khuẩn lạc đơn đếm được qua 4 mốc giờ nuôi cấy thể hiện ở các hình từ 4.3 đến 4.7 và kết quả ở đồ thị hình 4.2, cho thấy thời gian ủ mẫu càng lâu thì tỉ lệ sống sót của các chủng càng giảm nhưng tất cả đều có khả năng chịu axit và sống sót trong vòng 3giờ tại pH 2. Trong đó chủng MC9 là chủng có khả năng chịu cao nhất.
Lượng tế bào ban đầu của các chủng khảo sát rất cao (lớn hơn 108
CFU/ml ) và chênh lệch nhau không đáng kể. Ở giờ nuôi đầu tiên thì lượng tế bào đã bắt đầu giảm ở tất cả các chủng DC2 còn 7,52 logCFU/ml ( giảm 1,269 logCFU/ml), MC5 là 7,67 logCFU/ml ( giảm 1,116 logCFU/ml), MC10 là 7,62 logCFU/ml ( giảm 1,123 logCFU/ml), giảm nhanh nhất là DC1 chỉ còn 6,7 logCFU/ml ( giảm 2,207 logCFU/ml ). Trong khi đó chủng MC9 vẫn đang còn 8, 51 logCFU/ml tức là chỉ giảm có 0,237 logCFU/ml với tỉ lệ sống sót cao rất nhiều so với các chủng còn lại (Phụ luc 1). Tương tự ở mốc 2 giờ lượng tế bào vẫn tiếp tục giảm ở tất ở các chủng. Giảm nhiều nhất là DC1 còn 6,09 logCFU/ml và MC10 còn 6,16 logCFU/ml, tỉ lệ sống sót của 2 chủng này giảm nhanh chỉ còn 0,15% (DC1), 0,26%( MC10) ( Phụ luc 1). Trong khi đó dẫn đầu vẫn là chủng MC9 với tỉ lệ sống sót sau 2 giờ là 4,29% tương đương với 7,35 logCFU/ml. Ở mốc 3 giờ cũng vậy lượng tế bào của các chủng giảm nhanh nằm trong khoảng 5,12 - 6,57 logCFU/ml. Và ở mốc giờ này chủng MC9 vẫn là chủng có khả năng chịu mạnh nhất.
Như vậy trong cả 3giờ thì chủng MC9 là chủng có khả năng chịu axit tốt nhất tỉ lệ sống sót là 0.92 %, trong khi các chủng khác tỉ lệ sống sót đều rất thấp.
Hình 4.2. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic ở pH 2
Zhou và cộng sự (2007) [32] cho rằng giá trị pH 2 và pH 3 được xem là giới hạn quyết định trong sàng lọc các chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic. Kết quả nghiên cứu của Kim và cộng sự (2007) [25] cho thấy khi xử lý bằng dịch dạ dày pH = 2,5, có 3/7 chủng vi khuẩn có khả năng chịu môi trường axit, tuy nhiên, tỉ lệ sống của các chủng này giảm mạnh chỉ còn 0,8% đến 8% sau 30 phút xử lý và tiếp tục giảm mạnh sau 2 giờ xử lý (từ 0,04% đến 0,2% so với ban đầu).
Theo nghiên cứu của M. T. Liong và N.P. Shah [27] trên 11chủng lactic bao gồm Lb.acidophilus và Lb.casei kết quả cho thấy cả Lb.
acidophilus và Lb.casei đều có khả năng chịu axit sau 2 giờ nuôi cấy. Trong
đó Lb. acidophilus ATCC 4962, Lb.casei ASCC 290 và Lb.casei ASCC 292 là những chủng chịu tốt nhất khi giảm từ khoảng 1010cfu/ml (10 logCFU/ml) xuống khoảng hơn 107 CFU/ml (khoảng 1000 lần), có một số chủng chỉ còn
104 CFU/ml (1 triệu lần). Như vậy, khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn lactic thay đổi rất lớn theo chủng.
Kết quả nghiên cứu của Liu và cộng sự (2007) [29] cho rằng
Lactobacillus là chi lactic có khả năng chịu axit rất tốt trong đó chủng Lb. acidophilus GG (ATCC 53103) là chủng duy nhất được phân lập từ phân
người có khả năng chịu axit với số lượng còn lại sau 2 giờ tại pH từ 1-2 là