TÍNH XYLANASE CAO
Có 3 nguồn để phân lập nấm mốc đó là gỗ mục, đất tại hồ xử lý nước thải nhà máy giấy, và mốc tương. Ở đây tôi chọn nguồn mốc tương để phân lập xuất phát từ thực tế rằng bất kỳ thành tế bào của tế bào thực vật nào cũng có chứa xylan (hemicellulose), do đó mốc tương muốn sinh trưởng thì cần phải có enzym xylanase để phân huỷ thành tế bào thực vật.
Từ 7 mẫu đã phân lập được 28 chủng nấm mốc trên môi trường Czapek đặc với cách tiến hành đã trình bày ở phần phương pháp phân lập. 28 chủng này được chọn lọc trên môi trường Czapek đặc trong đó saccharose được thay thế bằng xylan với hàm lượng 2 gam/lít. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.
Bảng 4. Đặc tính của các chủng nấm mốc đã được phân lập
Chủng Nguồn phân lập Mầu sắc bào tử Tỷ lệ D/d
B1 Mốc tương Bần Màu xanh lá cây 1,21
B2 Mốc tương Bần Màu xám 1,20
B4 Mốc tương Bần Màu xám xanh 1,14
B5 Mốc tương Bần Màu vàng xanh 1,24
B6 Mốc tương Bần Màu vàng xanh 1,38
B7 Mốc tương Bần Mầu đen 1,44
B8 Mốc tương Bần Mầu trắng 1,43 B9 Mốc tương Bần Mầu vàng 1,41 M1 Gỗ mục Màu xanh 1,26 M2 Gỗ mục Màu xám 1,20 M3 Gỗ mục Màu nâu 1,05 C1 Gỗ mục Màu đen 1,54 C2 Gỗ mục Màu trắng 1,16 C3 Gỗ mục Màu vàng xanh 1,20 C4 Gỗ mục Màu xám xanh 1,05 C5 Gỗ mục Màu vàng xám 1,33
C6 Mẫu gỗ mục Màu xanh đậm 1,17
C7 Mẫu gỗ mục Màu xanh nhạt 1,11
N1 Nước thải Màu vàng 1,39
N2 Nước thải Màu xanh nhạt 1,28
N3 Nước thải Màu xám 1,12
N4 Nước thải Màu vàng xám 1,25
N5 Nước thải Màu sẫm 1,41
N7 Nước thải Màu đen 1,12
N8 Nước thải Màu nâu 1,06
N9 Nước thải Màu xanh đậm 1,15
Trong đó D: đường kính thủy phân (mm) d: đường kính khuẩn lạc (mm)
Hình 8. Hình ảnh vòng thủy phân của chủng C1 và B7
Từ kết quả trên, chọn 2 chủng có tỷ lệ D/d cao nhất là B7 và C1 có bào tử màu đen với tỉ lệ D/d tương ứng cao nhất là 1,44 và 1,54. Tỷ lệ D/d thể hiện khả năng sinh enzym xylanase của các chủng nấm mốc. Tỷ lệ D/d càng cao có thể phần nào chứng tỏ chủng nấm mốc có khả năng sinh xylanase với hoạt tính cao. Kết quả tuyển chọn này khá lý thú vì chủng có tỷ lệ D/d cao thứ hai đó là chủng B7, một chủng có nguồn gốc từ mốc tương Bần – đây là nguồn phân lập rất mới mẻ mà ít người nghĩ rằng lại có thể thu được một chủng nấm mốc có khả năng sinh enzym xylanase cao. Việc chọn lựa 2 chủng này ngoài lý do tỷ lệ D/d cao còn vì cả 2 chủng này đều có bào tử mầu đen, rất có thể thuộc loài Aspergillus niger. Bởi vì các
nghiên cứu trên thế giời đã chỉ ra rằng Aspergillus niger là loài có khả năng sinh tổng hợp xylanase có hoạt tính khá tốt [34].
3.2. ĐỘNG HỌC SINH TỔNG HỢP ENZYM XYLANASE CỦA CHỦNG C1 VÀ B7
Tiến hành nuôi hai chủng C1 và B7 trong môi trường Czapek, thay thế đường saccharose bằng xylan 0,2% ở 30oC, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau các khoảng thời gian 1, 2, 3, 4 và 5 ngày, thu mẫu và xác định hoạt độ. Kết quả thể hiện ở hình 9.
Hình 9. Động học sinh tổng hợp xylanase từ chủng C1 và B7
Kết quả động học sinh tổng hợp xylanase của hai chủng C1 và B7 (hình 9) cho thấy hai chủng có khả năng sinh enzym xylanase khá cao. So với các chủng
520,24 U/ml
nấm mốc đã được nghiên cứu trên thế giới thì hoạt độ thu được ở mức trên trung bình. Đa số các chủng nấm mốc có hoạt độ vào khoảng 300 U/ml. Chỉ có một số ít các chủng có hoạt độ cao khoảng 1000U/ml. Tuy nhiên 2 chủng nấm mốc chọn được có hoạt tính rất tốt bởi chúng sinh tổng hợp xylanase đạt 520,24 U/ml (chủng C1) và 323,96 U/ml (chủng B7) khi chưa được tối ưu điều kiện sinh enzym. Hoạt độ thu được có thể sẽ cao hơn nữa nếu chúng ta tiếp tục nghiên cứu để tối ưu điều kiện sinh tổng hợp enzym của chủng.
Thường thì với nấm mốc hoạt độ cao nhất của enzym được thu nhận sau 3 ngày. Tuy nhiên, với xylanase là một ngoại lệ, người ta thường thu được hoạt độ xylanase cao nhất từ nấm mốc sau 2 ngày nuôi cấy [35].
Việc xác định động học sinh tổng hợp xylanase không chỉ giúp đánh giá sơ bộ khả năng sinh xylanase của chủng nấm mốc nghiên cứu mà nó còn là dữ liệu quan trọng để xác định thời gian thu sinh khối trong trường hợp muốn tách chiết RNA để tách dòng gen mã hoá xylanase.
3.3. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOI HÌNH THÁI
Hai chủng nấm mốc được nuôi trên môi trường Czapek đặc để quan sát đặc điểm hình thái dưới mắt thường và dưới kính hiển vi. Để quan sát màu sắc và hình thái khuẩn lạc ta tiến hành cấy chấm điểm trên môi trường rắn, nuôi ở 25oC để tiến hành quan sát. Còn để quan sát dưới kính hiển vi, ta lấy bào tử của 2 chủng C1 và B7 hoà vào trong nước cất thanh trùng rồi lấy dịch trang đều trên mặt môi trường đặc. Sau đó đặt các vòng bằng sợi kim loại nhỏ lên trên. Sau khoảng 2 ngày nuôi ở 30oC khi hệ sợi nấm đã phát triển bao phủ lên vòng kim loại và tạo bào tử, lấy vòng kim loại ra, đặt dưới kính hiển vi quang học để quan sát đặc điểm, kích thước hệ sợi nấm và bào tử. Hình 10 và 11 là hình dạng của chủng C1 và B7 khi soi dưới kính hiển vi.
Hình 10. Hình ảnh bào tử của chủng C1 dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần
Hình 11. Hình ảnh bào tử của chủng B7 dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần.
Cả 2 chủng đều có đặc điểm:
Khuẩn lạc trên môi trường Czapek có đường kính 4,5 -5,5 cm sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 25ºC.
Khuẩn lạc xốp nhẹ, mặt trước có màu đen nâu, mặt trái không màu đến màu vàng nhạt.
Cuống sinh bào tử trần có kích thước120-1010µm x 4,0µm, nhẵn. Bọng cầu hoặc gần cầu có d = 30-50µm.
Chổi 2 tầng, cuống thể bình 12-15µm x 6-7,5µm, thể bình 5-12µm x 3-3,7µm.
Bào tử cầu hoặc gần cầu, gai, ráp, d = 5-6 µm.
Trên đây là những đặc điểm quan trọng để có thể xác định một cách sơ bộ: hai chủng C1 và B7 thuộc loài Aspergillus niger. Việc định tên bằng phương pháp soi hình thái này có độ chính xác không cao do phải phụ thuộc vào trình độ và kỹ năng của người quan sát. Tuy nhiên, việc định tên sơ bộ lại rất cần thiết để biết một cách sơ bộ về chủng mà ta đang nghiên cứu. Và việc định tên bằng phương pháp sinh học phân tử là cần thiết để biết chính xác tên loài của chủng sẽ tiến hành nghiên cứu.
3.4. ĐỊNH TÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số
Nuôi nấm mốc trong môi trường Czapek lỏng. Sau 48 giờ, thu sinh khối và tách chiết DNA tổng số, tiến hành điện di trên gel agarose. Kết quả thể hiện ở hình 12:
Hình 12. Điện di đồ của DNA tổng số của C1 và B7
Kết quả điện di cho thấy đã tách chiết thành công DNA tổng số từ hai chủng nấm mốc C1 và B7.