Cho vào ống eppendoff 1,5mL 50µL sản phẩm phản ứng PCR: - 5µL CH3COONa 3M, pH 4,6
- 100 µL ethanol 95%
Vortex hỗn hợp rồi đặt ở -20oC trong 30 phút để kết tủa sản phẩm PCR.
Ly tâm mẫu ở tốc độ 13.000 rpm trong 20 phút Loại bỏ dịch nổi
Rửa với ethanol 70% Làm khô
Hòa tan lại trong 50µL nước.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nhằm tách dòng được gen mã hoá enzym xylanase có hoạt tính cao, quá trình nghiên cứu thực hiện qua các bước theo sơ đồ hình 7.
Phân lập, tuyển chọn chủng
Phân lập, tuyển chọn chủng
Hình 7. Sơ đồ quy trình thí nghiệm
Nấm mốc là vi sinh vật nhân chuẩn nên trong bộ gen có chứa các intron. Vì vậy, trong các nghiên cứu thường tiến hành tách dòng gen bằng việc tách chiết RNA và khuếch đại gen mong muốn bằng phản ứng RT-PCR. Đối với gen mã hoá enzym xylanase cũng như vậy, trong gen này có chứa một intron ở giữa. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, tôi muốn đi theo một hướng tiếp cận khác để tách dòng gen mã hoá enzym xylanase từ nấm mốc. Đó là tách dòng từ chính genom của nấm mốc bằng phản ứng PCR. Vì việc tách dòng gen từ genom bằng phản ứng PCR là một phương pháp tiết kiệm chi phí về hoá chất và đơn giản hơn so với việc tách dòng từ
Xác định động học STH xylanase
Xác định động học STH xylanase
Tách chiết DNA, RNA
Tách chiết DNA, RNA
Thiết kế mồi Thiết kế mồi Giải trình tự Giải trình tự Dùng PCR, RT-PCR để KĐ gen xylanase Dùng PCR, RT-PCR để KĐ gen xylanase
RNA. Với định hướng biểu hiện trong chủng nấm mốc mà tiến hành tách dòng nên việc có intron trong gen không phải là trở ngại. Hơn nữa với một intron trong gen, nếu muốn ta dễ dàng loại bỏ bằng phản ứng PCR.