Việc phân ly dựa trên độ lớn và hình thái các chất, trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử DNA dịch chuyển về phía anode (cực dương) với tốc độ tỉ lệ nghịch với khối lượng phân tử. Vì vậy, Các đoạn DNA càng lớn thì dịch chuyển càng chậm sau một khoảng thời gian di chuyển, tại một thời điểm nào đó các phân tử có kích thước (trọng lượng) khác nhau sẽ tách xa vị trí bắt đầu di chuyển những khoảng khác nhau. Do đó, chúng được tách nhau ra. Ta có thể phát hiện được chúng nhờ kỹ thuật nhuộm EtBr.
Qui trình (cho gel agarose 1%)
Cân 1g agarose cho vào 100 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn. Để nguội 45-50oC rồi đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn. Sau 20-30 phút, khi gel đã trùng hợp hoàn toàn thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm
Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn với đệm mẫu 6X và tra vào các giếng trên gel
Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn với chế độ chạy 100V và 90mA
Nhuộm gel: Bản gel sau khi chạy điện di xong được nhuộm trong dung dịch EtBr 0,5 µg/ml trong 5-10 phút, rửa lại bằng nước trước khi soi gel Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nhờ
liên kết với EtBr
2.2.7. Phương pháp khuếch đại một đoạn DNA bằng phản ứng PCRNguyên tắc: Nguyên tắc:
Taq polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt được dùng để tổng hợp các đoạn DNA trong môi trường có 4 loại dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) và 2 primer trên khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự.
Tiến hành:
Thành phần của phản ứng PCR chuẩn với thể tích phản ứng 100 µl là:
• DNA khuôn (105 – 106 phân tử)
• 50 pmol mỗi mồi
• 200 µmol mỗi dNTP
• 2U Taq polymerase
• 1,5 mM MgCl2
• 50mM KCl, 10mM Tris HCl (pH 8.4)
• Nước đề ion
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chuẩn:
• Biến tính ở chu kỳ đầu ở 94oC trong 5 phút. Các chu kỳ sau biến tính trong 1 phút
• Bắt cặp mồi ở nhiệt độ khoảng 50oC – 60oC trong 30 giây
• Kéo dài ở 72oC trong 1,5 phút
Thực hiện 25 – 40 chu kỳ. Chu kỳ cuối thực hiện ở 72oC trong 5 phút. Kết thúc phản ứng hạ nhiệt độ xuống 4oC.