Phân lập, tuyển chọn các chủng corynebacterium glutamicum và tách dòng, đọc trình tự gen lysc mã hoá enzym aspartokinase sinh tổng hợp l lysin

NGUYỄN CHI LAN BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG “PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM VÀ TÁCH DỊNG, ĐỌC TRÌNH TỰ GEN LYSC MÃ HOÁ ENZYM ASPARTOKINASE SINH TỔNG HỢP L-LYSIN” NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN NGỌC HUYỀN NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THÙY CHÂU 2005 - 2007 HÀ NỘI, 2007 Mục lục Trang Mở đầu………………………………………………………………… Chương Tổng quan………………………………………………… 1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất L-lysin………………………… 1.1.1 Trên giới……………………………………………………… 1.1.2 Việt Nam Đại cương sản xuất axit amin 1.2.1 Sinh tổng hợp axit amin nhờ vi sinh vật 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp axit amin 1.2.3 Sản xuất axit amin đường phân nhánh 1.3 Đại cương L-lysin 10 1.3.1 Cơng thức cấu tạo, tính chất L-lysin 10 1.3.2 Con đường sinh tổng hợp L-lysin 11 1.3.2.1 Con đường ỏ-aminoadipate……………………………………… 11 1.3.2.2 Con đường Diaminopimelate (DAP)……………………………… 12 1.3.3 Điều hòa sinh tổng hợp L-lysin ………………………………… 13 1.3.4 Tạo chủng đột biến để sản xuất L-lysin ………………………… 15 1.4 Vi sinh vật sản xuất L-lysin……………………………………… 16 1.4.1 Đặc điểm hình thái C glutamicum ………………………… 17 1.4.2 Vai trò C glutamicum sinh tổng hợp axit amin……… 18 1.5 Vai trò sinh học ứng dụng lysin sống 19 1.5.1 Vai trò sinh học lysin ……………………………………… 19 1.5.2 ứng dụng lysin sống…………………………… 21 1.6 Hướng nghiên cứu nhằm tăng sản lượng L-lysin ………………… 22 1.6.1 Cải tiến chủng sản xuất L-lysin khuyếch đại gen sinh tổng hợp 22 1.2 1.6.2 Vai trò gen lysC đường sinh tổng hợp L-lysin…… 24 1.6.3 Vectơ sử dụng cho tách dòng……………………………………… 25 Chương - Vật liệu Phương pháp 27 2.1 Vật liệu…………………………………………………………… 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……………………………………………… 27 2.1.2 Vi sinh vật………………………………………………………… 27 2.1.3 Sinh phẩm………………………………………………………… 27 2.1.4 Hoá chất…………………………………………………………… 27 2.1.5 Môi trường ………………………………………………………… 28 2.1.6 Trang thiết bị……………………………………………………… 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 29 2.2.1 Lấy mẫu…………………………………………………………… 29 2.2.2 Phân lập chủng C glutamicum ……………………………… 30 2.2.3 Phân loại chủng C.glutamicum ……………………………… 30 2.2.4 Định tính định lượng axit amin L-lysin………………………… 32 2.2.4.1 Sàng lọc chủng sinh L-lysin phương pháp sắc ký giấy… 32 2.2.4.2 Tiến hành định lượng L- lysin phương pháp quang phổ 33 2.2.5 Phương pháp tách dòng gen lysC từ vi khuẩn C.glutamicum phân lập 33 2.2.5.1 Tách ADN hệ gen vi khuẩn C glutamicum 33 2.2.5.2 Kỹ thuật PCR cho nhân gen lysC 36 2.2.5.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR 2.1 37 2.2.5.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α…………………… 38 2.2.5.5 Tách chiết ADN plasmid từ E coli DH5α ……………………… 39 2.2.5.6 Xử lý ADN enzym giới hạn EcoRI………………………… 40 2.2.5.7 Tách tinh ADN plasmid lượng lớn……………………… 40 2.2.5.8 Xác định trình tự nucleotit đoạn gen tách dịng……………… 41 Chương Kết thảo luận………………………………… 43 3.1 43 Phân lập tuyển chọn chủng C glutamicum sinh L-lysin…… 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp L-lysin 43 từ đất tỉnh miền Bắc Việt Nam……………………………………… 3.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp L-lysin cao 44 3.1.3 Định loại vi khuẩn có khả sinh L-lysin dựa vào đặc 45 điểm hình thái tính chất sinh lý, sinh hóa……………………………… 3.2 Tách dịng xác định trình tự gen lysC mã hóa aspartokinase 48 từ chủng C glutamicum HN 2650 ……………………………………… 3.2.1 Phân lập gen lysC ………………………………………………… 50 3.2.1.1 Tách chiết ADN hệ gen chủng C glutamicum HN 2650…… 50 3.2.1.2 Nhân gen lysC kỹ thuật PCR……………………………… 51 3.2.2 Tách dòng gen lysC……………………………………………… 52 3.2.2.1 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR 2.1………………… 53 3.2.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH5ỏ……………… 53 3.2.2.3 Tách ADN plasmit từ E.coli DH5ỏ……………………………… 54 3.2.2.4 Kiểm tra có mặt gen lysC dòng plasmit tái tổ hợp 56 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gen lysC mã hóa aspartokinase từ chủng 57 C glutamicum HN 2650 phân lập Việt Nam…………………………… Chương kết luận…………………………………………………… 66 Tài liệu tham khảo………………………………………………… 68 DANH MụC CáC CHữ VIếT TắT Bp Base pair (cặp bazơ) dNTP Deoxy Nucleotid Tri Phosphat ddNTP Dideoxy Nucleotid Tri Phosphat EDTA Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid IPTG Isopropyl- õ-D- Thiogalactopyranoside LB Môi trường Lauria Betani ORF Open reading frame (khung đọc mở) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris – Acetate - EDTA Tm Temperature melting (nhiệt độ nóng chảy) X-gal 5-bromo -4-chloro-3-indolyl-õ-D-galactopyranoside ATCC American Type Culture Collection NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) AEC S-(2- aminoethyl)-L-cysteine Danh mục bảng Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR Bảng 2.2 Chương trình chạy PCR Bảng 2.3 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRđ 2.1 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt ADN EcoRI Bảng 3.1 Sự phân bố chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp L-lysin phân lập từ đất số tỉnh miền Bắc Việt Nam Bảng 3.2 Khả sinh L-lysin chủng vi khuẩn phân lập Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái kích thước tế bào chủng vi khuẩn sinh L-lysin Bảng 3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn sinh L-lysin Bảng 3.5 Định lượng xác định độ tinh ADN hệ gen từ C glutamicum HN 2650 Danh mục hình đồ thị Sơ đồ 1.1 ức chế ngược enzym hoạt động Sơ đồ 1.2 Mơ hình chế điều hịa hoạt tính enzym sinh tổng hợp axit amin Sơ đồ 1.3 Điều chỉnh trình sinh tổng hợp axit amin họ aspartat chủng E.coli Sơ đồ 1.4 Điều chỉnh trình sinh tổng hợp axit amin họ aspartat chủng C glutamicum Sơ đồ 1.5 Sinh tổng hợp L-lysin theo đường DAP C glutamicum enzym tham gia tổng hợp Sơ đồ 1.6 Sơ đồ cấu trúc vị trí cắt vectơ pCR 2.1 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ miêu tả trình nối ghép tạo vector pCRlysC Hình 3.1 Điện di ADN hệ gen chủng C glutamicum HN 2650 gel agaroza 1% Hình 3.2 Sản phẩm PCR chủng C glutamicum HN 2650 gel agaroza 1% Hình 3.3 Kết biến nạp vecor tái tổ hợp mang gen lysC vào vi khuẩn E.coli DH5ỏ Hình 3.4 Kết điện di tách chiết ADN plasmit gel agaroza 1% Hình 3.5 Điện di ADN plasmit tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đặc hiệu gen lysC cắt EcoRI Hình 3.6 Trình tự đoạn gen lysC mã hóa aspartokinase chủng C glutamicum HN 2650 Hình 3.7 So sánh độ tương đồng trình tự nucleotit gen lysC tách dịng từ chủng C glutamicum HN 2650 phân lập với trình tự gen lysC chủng C glutamicum ATCC 13032 Kalinowski cộng công bố Ngân hàng liệu Gen quốc tế Hình 3.8 Trình tự axit amin dịch mã từ đoạn ADN đặc hiệu gen lysC tách dòng từ chủng C glutamicum HN 2650 phân lập Việt Nam Hình 3.9 Trình tự axit amin gen lysC từ chủng C glutamicum HN 2650 Hình 3.10 So sánh trình tự axit amin gen lysC tách dịng từ chủng C glutamicum HN 2650 phân lập Việt Nam với trình tự axit amin gen lysC Kalinowski cộng công bố Ngân hàng liệu Gen guốc tế Mở đầu Vai trị sinh học lysin xác định có tất protein quan trọng thể người động vật thể tự tổng hợp khơng thể thay axit amin khác Drechsel năm 1889 phát lysin thành tựu quan trọng hoá sinh học dinh dưỡng động vật [20] L-lysin ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Trong chăn nuôi, L-lysin bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng chất lượng sản lượng thịt động vật nuôi Trong công nghiệp dược phẩm, lysin sử dụng chất dinh dưỡng, kích thích ăn ngon miệng, dùng chất có nguồn gốc protein bổ sung trình cắt đứt bệnh căng thẳng thần kinh có chức chống nhiễm trùng máu Trong công nghiệp thực phẩm, lysin chất bổ sung làm giầu thực phẩm, nâng cao chất lượng loại ngũ cốc lúa mì, ngơ, gạo sản phẩm thiếu hụt L- lysin giá trị dinh dưỡng thấp [52] Trên giới việc sản xuất axit amin quy mô công nghiệp năm 1908 Năm 1986 sản lượng lysin toàn giới 70.000 tấn/năm đến năm 2000 tăng lên 500.000 tấn/năm năm 2007 800.000 tấn/năm [66] Việc gia tăng sản lượng lysin giới đồng nghĩa với nhu cầu lớn sản phẩm qui mô công ngiệp, L-lysin sản xuất từ chủng đột biến Việc tạo chủng đột biến khắc phục chế ức chế ngược chủng tự nhiên nên sản lượng lysin tăng cao Tuy nhiên, hướng nghiên cứu triển khai thu kết tốt Đó tách dịng đưa gen mã hố enzym điều khiển q trình sản xuất L-lysin vào hệ biểu hiện, nhằm tạo chủng siêu tổng hợp L-lysin Kalinowski cộng tách dòng đưa gen lysC mã hóa cho aspartokinase, enzyme khởi đầu cho trình sinh tổng hợp L-lysin theo nhánh diaminopimelate vào chủng C.glutamicum ATCC 13032 [40] Chủng tái tổ hợp thu có hoạt tính enzym tăng khả biểu sản phẩm protein lên 5-7 lần so với chủng tự nhiên Hiện Việt Nam nhu cầu sử dụng lysin cho thực phẩm người thức ăn chăn ni gia tăng nhanh chóng Hàng năm phải nhập lysin với số lượng lớn Tuy nhiên nghiên cứu L-lysin hai lĩnh vực ứng dụng có nghiên cứu sản xuất L-lysin với chất lượng cao, giá thành hạ Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn chủng Corynebacterium glutamicum tách dịng, đọc trình tự gen lysC mã hoá enzym aspartokinase sinh tổng hợp L-lysin ”  Mục tiêu luận văn Tuyển chọn số chủng C glutamicum có khả sinh tổng hợp L-lysin cao từ nguồn đất Việt Nam Tách dòng đọc trình tự gen lysC mã hóa cho aspartokinase từ chủng C glutamicum HN 2650  Nội dung nghiên cứu Phân lập số chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp L-lysin từ mẫu đất thu thập số tỉnh miền Bắc Việt Nam Định loại tuyển chọn chủng C glutamicum sinh tổng hợp L-lysin cao dựa vào đặc điểm hình thái tính chất sinh lý, sinh hóa Tách dịng gen lysC mã hóa enzym aspartokinase từ chủng C.glutamicum phân lập 69 LysC- VN MALVVQKYGGSSLESAERIRNVAERIVATKKTGNDVVVVCSAMGDTTDELLELAAAVNPV 60 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| LysC-Ger LysC- VN MALVVQKYGGSSLESAERIRNVAERIVATKKAGNDVVVVVSAMGDTTDELLELAAAVNPV 60 PPAREMDMLLTAGERISNALVAMAIESLGAEAQSFTGSQAGVLTTERHGNARIVDVTPGR 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| LysC-Ger LysC- VN PPAREMDMLLTAGERISNALVAMAIESLGAEAQSFTGSQAGVLTTERHGNARIVDVTPGR 120 VREALDEGKICIVAGFQGVNKETRDVTTLGRGGSDTTAVALAAALNADVCEIYSDVDGVY 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| LysC-Ger LysC- VN VREALDEGKICIVAGFQGVNKETRDVTTLGRGGSDTTAVALAAALNADVCEIYSDVDGVY 180 TADPRIVPNAQKLEKLSFEEMLELAAVGSKILVLRSVEYARAFNVPLRVRSSYSNDPGTL 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| LysC-Ger LysC- VN TADPRIVPNAQKLEKLSFEEMLELAAVGSKILVLRSVEYARAFNVPLRVRSSYSNDPGTL 240 IAGSMEDIPVEEAVLTGVATDKSEAKVTVLGISDKPGEAAKVFRALADAEINIDMVLQNV 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| LysC-Ger LysC- VN IAGSMEDIPVEEAVLTGVATDKSEAKVTVLGISDKPGEAAKVFRALADAEINIDMVLQNV 300 SSVEDGTTDITFTCPRSDGRRAMEILKKLQVQGNWTNVLYDDQVGKVSLVGAGMKSHPGV 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| LysC-Ger LysC- VN SSVEDGTTDITFTCPRSDGRRAMEILKKLQVQGNWTNVLYDDQVGKVSLVGAGMKSHPGV 360 TAEFMEALRDVNVNIVLISTSEIRISVLIREDDLDAAARALHEQFQLGGEDEAVVYAGTG 420 |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| LysC-Ger LysC- VN TAEFMEALRDVNVNIELISTSEIRISVLIREDDLDAAARALHEQFQLGGEDEAVVYAGTG R 420 421 | LysC-Ger R 421 Hình 3.10 So sánh trình tự axit amin gen lysC tách dòng từ chủng C glutamicum HN 2650 phân lập Việt Nam với trình tự axit amin gen lysC Kalinowski cộng công bố Ngân hàng liệu Gen guốc tế Kết hình 3.10 cho thấy, trình tự axit amin đoạn protein dịch mã từ gen lysC chủng C glutamicum HN 2650 phân lập trình tự axit amin dịch mã từ gen lysC chủng C glutamicum ATCC 13032 Kalinowski cộng công bố Ngân hàng liệu Gen quốc tế có độ tương đồng cao đạt 99% số lượng axit amin Các cơng trình nghiên cứu cơng bố tác giả khác (Zafar Alam Mahood, 1996 [80]; Bathe, 2004 [7] ) chủng C glutamicum phân lập từ 70 nguồn gốc khác có kết tương tự Điều khẳng định chúng tơi tách dịng thành cơng gen lysC từ chủng C glutamicum HN 2650 phân lập Việt Nam 71 Chương kết luận Từ 410 mẫu đất thu thập số tỉnh miền Bắc Việt Nam phân lập 22 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp L-lysin, có chủng có khả sinh L-lysin cao Dựa vào đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa, sàng lọc chủng vi khuẩn mang đặc điểm phân loại đặc trưng loài C glutamicum Đã tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp L-lysin cao nhất, đạt 10 g/l môi trường ML4 Chủng ký hiệu C glutamicum HN 2650 Đã nhân thành công đoạn gen lysC từ chủng C glutamicum HN 2650 kỹ thuật PCR với cặp mồi LysCP8 LysCM4 Đã tạo dịng đoạn ADN mang gen lysC mã hóa aspartokinase từ chủng C glutamicum HN 2650 phương pháp gắn vào vectơ tách dòng pCRđ2.1 biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α Đã xác định trình tự nucleotit gen lysC từ chủng C glutamicum HN 2650 phân lập Việt Nam Đoạn có chiều dài 1266 cặp bazơ mã hoá cho protein gồm 421 axit amin Trình tự gen lysC đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế với số đăng ký AM747626 So sánh trình tự nucleotit axit amin gen lysC từ chủng C glutamicum HN 2650 với trình tự nucleotit axit amin chủng C glutamicum ATCC 13032 tác giả Kalinowski cộng công bố Ngân hàng liệu Gen quốc tế cho thấy hai trình tự có độ tương đồng cao (98% 99%) 72 Hướng nghiên cứu tiếp Dựa vào trình tự gen lysC tách dịng, tiến hành đột biến phương pháp đột biến điểm định hướng gen Biểu gen lysC đột biến mã hóa cho asparokinase vi khuẩn C glutamicum Xác định hoạt tính aspartokinase tái tổ hợp Nghiên cứu qui trình cơng nghệ sản xuất L-lysin chủng tái tổ hợp 73 Tài liệu tham khảo Tiếng việt Kiều Hữu ảnh (1998), Cơ sở hoá sinh vi sinh vật học Công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật- Hà Nội Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp Ngô Tiến Hiển (1996), “ Lựa chọn chủng giống điều kiện tối ưu sinh tổng hợp L-lysin theo phương pháp bề mặt.”, Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghiệp thực phẩm, tr 185-190 Nguyễn Thị Hoài Trâm, Ngô Thị Mại (1996), “Nghiên cứu sử dụng giải pháp công nghệ để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp L-lysin chủng Corynebacterium glutamicum ATCC 13287”, Tạp chí Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm, tr 227-232 Tiếng anh Ausubel F., Brent R., Kingston R E., et al (1995), “ Short protocols in molecular biology”, Compendium of methods from current protocols in molecular biology, 3rd endition, Wiley, USA Azevedo R.A., Smith R.J., and Lea P.J (1992), “Aspartate kinase regulation in maize: Evidence for cepurification of threonine-sensitive 74 aspartate kinase and homoserine dehydrogenase” Phytochemistry, 31, pp 3371-3374 Bathe B., Reynen C., Pfefferle W (2004), WO 04013340A2 Bathe B., Stephen H.(2005) Alleles of the lysC gene from corynebactera Patent No: US 6,844,176 B1 Bathe B., Stephen H.(2006) Method for producing L-lysine or Llysine containing feed additives with a corynebacteria containing a mutated lysC Patent No: EP-A-0 854 189 or US 7,135,313 B2 10 Bellmann A., Patek M., Sahm H., Kramer R and Eggeling L.(2001), “Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum”, Microbiology, 147, pp 17651774 11 Bergey (1986), “Manual of synthematic bacterialogy”, Williams and Wilkins Co 12 Cassan M, Parsot C, Cohen GN, Patte JC (1986), “Nucleotide sequence of lysC gene encoding the lysine-sensitive aspartokinase III of Escherichia coli K12 Evolutionary pathway leading to three isofunctional enzymes” J Biol Chem, 261(3), pp.1052-1057 13 Cohen G.N.(1983), “The common pathway to lysine, methionine and threonine”, Amino Acids: Biosynthesis and Genetic Regulation, pp.141-147 14 Cowan and Steel’s (1974), “ Manual for the identification of medical bacteria”, Cambridge University Press, London 15 Cremer J., Eggelin L., Sahm H (1988), “Regulation of enzymes of lysine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum”, J Gen Microbiol 134, pp 3221-3229 75 16 Cremer J., Eggelin L., Sahm H (1991), “Control of lysine biosynthesis sequence in Corynebacterium glutamicum as analyzed by overexpression of the individual corresponding genes”, Appl Environ Microbiol 57, pp 17461752 17 Cremer J., Eggeling L., and Sahm H (1990), “Cloning the dapAdapB cluster of the lysine-secreting bacterium Corynebacterium glutamicum” Mol Gen Genet, 220, pp 478-480 18 Debajit K., Rajarchi M., Chitra B.(1968),” Regulation of Synthesis of Aspartate Kinase by Methionine,Threonine, and Lysine in Escherichia coli Strain B ”, The journal of biological chemistry, Vol 243, No 13, pp 3655-3660 19 Demain A.L., Masurekar P.S.(1974), “Lysine inhibition of in vivo homocitrate synthesis in Penicillium chrysogenum”, J.Gen.Microbiol, 83, pp 143 20 Drechsel E (1889), “ Studies on the degradation products of casein”, J Prakt Chem, 39, pp 425 21 Eggeling L, De Graaf AA, Sahm H (1996), “Quantifying and directing metabolite application to amino acid overproduction”, Adv Biochem Eng, 54, pp 2-30 22 Eggeling L and Bott M (2004), Corynebacterium glutamicum: Basic Biology and Application A Handbook Boca Raton, FL: CRC Press 23 Eggeling L.(1994), “Biology of L-lysine overproduction by Corynebacterium glutamicum”, Amino Acids, 6, pp 261-272 24 Eggeling L., Krumbach K (1997), “Identification and transcriptional analysis of the dapB-ORF2-dapA-ORF4 operon of Corynebacterium glutamicum, encoding two enzymes involved in L-lysine synthesis” 76 25 Eggeling L., Pfefferle W., Sahm H (2006), Amino acids, Published by Cambridge University Press, pp 147-171 26 Fechter W.L., Dienst J.H., Le Patourel J.F (1997), US5684190 27 Follettie M.T., Sinskey A.J., Cartherine A (1993), “Gene structure and expression of the Corynebacterium flavum N73”, Journal of Bacteriology, vol 175, pp 4096-4103 28 Follettiem technology T for (1989), “Development Corynebacteriurn of recombinant glutamicum: Isolation DNA and characterization of amino acid biosynthesis genes” Ph.D thesis, Massachusetts Institute of Technology Cambridge, MA 29 Gaillardin C.M., Poirier L., Ribet A.M., Heslot H.(1979), “General and lysine specific control of Saccharopine dehdrogenase levels in the yeast Saccharomycopsis lipolytica”, Biochimie, 61(4), pp.473 30 Gilvarg C glutamicum (1958), “The enzymatic synthesis of diaminopimelic acid”, J Biol Chem, 233, pp.1501 31 Hallaert J., Morel W.C., Vandamme E.J.,(1987),”L-lysine fermentation by aminoethylcysteine resistant C glutamicum mutant”, Meded Fac Landbouwet Gent, 52(4B), pp.1901 32 Hilliger M., Kreibich G., Thiele G., Boettger D., Bergter F., Jagusch L., Schoenherr W (1990), “Fermentation of L-lysin”, Patent DD 268384, chem Abs 112 33 Hirano S., Sugimoto M., Nakano E., Izui M., Hayakawa A., Yoshihara Y., Nakamatsu T (2000), “ Method of producing Llysine”, Patent number US 006090597A 34 Hogg R.W., Broquist H.P (1968), “Homocitrate formation in Neurospora crassa”, J.Biol.Chem, 243(8), pp.1839 35 Invitrogen life technologies (2002), “ TOPO – TA cloning kit” 77 36 Ishii T., Yokomori M., Miwa H (1997), US5650304 37 James G., Cappuccino., Natalie Sherman (1996), “Microbiology a laboratory manual”, pp 311- 313 38 Jetten M.S., Follettie M.T., Sinskey A.J.(2003), “Cloning and sequence analysis of aspartokinase genes from Corynebacterium crenatum” Appl Microbiol Biotechnol, pp.789-794 39 Kalinowski J, Simon R, Seep-Feldhaus A.(1990), “High-frequency conjugal plasmit transfer from gramnegative Escherichia coli to various gram-positive coryneformbacteria” J Bacteriol, 172, pp 1663-1666 40 Kalinowski J., Bachmann B (1991), “Genetic and biochemical analysis of the aspartokinase from Corynebacterium glutamicum”, Molecular Microbiology, 5, pp 1197-1204 41 Ken-ichi Suga (2004), Biotechnology Basic Microbial Metabolic Regulation, International Center for Biotechnology, Osaka University 42 Kinoshita S., Nakayama K., Kitada S (1961) “L-lysine manufature by fermentation”, Japan patent, 6499 Chem, Abs, 56 43 Kiss R.D, Stephanopoulos G (1991), “Metabolic activity control of the L-lysine fermentation by restrained growth fed-batch strategies”, Biotechnol Prog, 7, pp 501-509 44 Kobashi N., Nishiyama M and Yamane H (2001), “Characterization of aspartate kinase III of Bacillus subtilis”, Biosci Biotechnol Biochem, 65, pp 1391-1394 45 Kreutzer C glutamicum., Stephan H., Mechthild R., Eggeling H., Sahm M.P.(2007), “L-lysine producing corynebacteria and process for the prepararion of L-lysine”, Pub.No US 2007/0054380 A1 78 46 Kurtz M., Bhattacharjee J.K (1975), “Biosynthesis of lysine in Rhodotorula glutinis: role of pipecolic acid”, J.Gen.Microbiol 86, pp 103 47 Leuchtenberger W (1996), “Amino acids technical production and use Products of primary metabolism.”, Biotechnology, 6, pp 455502 48 Liebl W., Ehrmann M., Ludwig W., Schleifer K.H., (1991), “Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297(T), Brevibacterium Flavum DSM 20411, Brevibacterium lactofermentum DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium lilium DSM 20137(T) to Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns”, Intl J Syst Bacteriol, 41(2), pp 255260 49 Lieblw (1991), “The genus Corynebacterium” In The Prokaryotes J Balows, pp 1157-1 171 50 Liu Y., Zhang Y., Wang J., Wang Y., Yu Z., Ding J “Effect of different levels of aspartokinase on the lysine production by Corynebacterium crenatum”, Center for Microbial Biotechnology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences 51 Lotter H., Becker U., Dubner F., Kaeppke F., Pohlisch J., Kelle R., Fosdick L.(2006), “L-lysine-containing feed additives”, United States Patent 20070082031 52 Martin J.F.(1989), “Molecular genetics of amino acid producing Corynebacteria Symp”, Soc Gen Microbiol, 44, pp 25 - 59 53 Marx A, Graaf AA de, Wiechert W, Eggeling L, Sahm H (1996) “Determination of the central metabolism of Corynebacterium 79 glutamicum by nuclear magnetic resonance spectroscopy combined with metabolite balancing”, Biotechnol Bioeng, 49, pp 111-129 54 Mauro J.N and Rolls B.A.(1973) "Some Current Problems in Protein Nutrition", Proteins in Human Nutrition (Academic Press, New York and London) pp 1-9 55 Ohnishi J., Mitsuhashi S., Llayashi M (2002), “A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new r-lysine producing mutant”, Appliecl Microbiology and Biotechnology 58, pp 217-223 56 Patte JC.(1996), “Biosynthesis of threonine and lysine In Escherichia coli and Salmonella typhimurium” Neidhardt FC ASM Press, Washington, DC, pp 528-541 57 Peisker M.(2000),”Stability of liquid lysine in feed processing” ADM BioProducts, pp 287-292 58 Peters-Wendisch P G., Kreutzer C., Kalinowski J., Sahm H & Eikmanns B.J.(1998), “Pyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum: characterization, expression and inactivation of the pyc gene” Microbiology 144, pp 915-927 59 Reusser F., Spencer J.F., Sallans H.R (1957), “Essential amino acids in microorganisms”, Can J Microbiol, 3, pp 721 60 Richards M., Haskins R.H (1957), “Extracellular lysine production by various fungi”, Can J Microbiol, pp.543 61 Ronald E.V (2001), “The Central Enzymes of the Aspartate Family of Amino Acid Biosynthesis”, Acc Chem Res, 34, 339-349 62 Sahm H, Eggeling L (1996), “A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export in Corynebacterium glutamicum” Mol Microbiol, 22, pp 815-826 80 63 Sambrook J., Russell D.W (2001), “ Molecullar cloning”, A laboratory manual, 3rd ed, Cold spring Harbor laboratory press, Cold spring harbor, NY 64 Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R (1977), “ DNA sequencing with chain termination inhibitors”, Proceeding of the national academy of sciences of the USA, 74, pp: 5463-5467 65 Sato Y., Kainuma M., H.(1990),”Manufacture Nara of S., Terasawa L-lysine with M., Yugawa coryneform bacteria.”,Japanese Patent, 0242.995 Chem Abs 113 66 Savas Anastassiadis (2007), “L-lysine fermentation”, Recent Patents on Biotechnology, 1, pp 11-24 67 Scapin, G and Blanchard, J.S (1998), “Enzymology of bacterial lysine biosynthesis”, Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 72, 279– 323 68 Schojfer A.J., Kalinowski R., Simon A.H (1990), “High-frequency conjugal plasmit transfer from gram-negative Escherichia coli to various gram-positive Coryneform bacteria”, J Bacteriol, Vol172, pp 1663 - 1666 69 Schrumpf B, Schwarzer A, Kalinowski J, Eggeling L,Sahm H (1991), “A functionally split pathway for L-lysine synthesis in Corynebacterium glutamicum”, J Bacteriol, 173, pp 4510-4516 70 Takenouchi E., Tanaka H., Soda K (1981), “Homocitrate synthase of S-(aminoethyl)-L-cystein resistant mutant of Candida pelliculosa” J Ferment Technol, 59(6), 429 71 Tauro P., Ramachandra R., Johar T.N., Sreenivasan A., Subrahmanyam V (1963), “L-lysin production by Ustilaginales fungi”, Arg Bio Chem, 27 pp 227 81 72 Thierbach G., Kalinowski J., Bachmann B., and PCihier A.(1990), “Cloning of a DNA fragment from Corynebacterium glutamicum conferring aminoethyl cysteine resistance and feedback resistance to aspartkokinase.”, AppI Microbiol Biotectinol, 32, pp 443-448 73 Tosaka O., and K Takinami (1978), “Pathway and regulation of lysine biosynthesis in Brevibacterium lactofermentum”, Agric Biol Chem, 42, pp 95-100 74 Tucci A.F., Ceci L.N (1972), “Control of lysine biosynthesis is yeast”, Arch.Biophys, 153(3), pp 751 75 Vogel and Shimura, (1966), “Spectophotometric determination of lysine”, Bacteriology journal, Vol 118, pp 396 76 Vogel H.J (1963), “Lysine pathways as biochemical fossils”, Proc Inter Congr Biochem, 3, pp 341 77 www ncbi.nlm.nih.gov 78 Wendisch and Peter (1997) EP-A-0 088 166 79 Yasuhiko Toride (2004), “Lysine and other amino acids for feed: production and contribution to protein utilization in animal feeding”, Fao Corporate document repository (Originated by: Agriculture and Consumer Protection ) 80 Zafar Alam Mahood.(1996), Production of L-lysine through fermentation, Doctor of philosophy in pharmaceutics 81 Zhao Z., Liu Y.J., Wang Y., Zhang Y.Z., Ding J.Y.(2000), “Expression of feedback-resistant aspartate kinase gene in Corynebacterium crenatum” 82 Zupanic T.J., Kittle J.D., Baker B.D., Miller C.J., Palmer D.T., Asai Y., Inui M., Vertes A., Kobayashi M., Kursu Y., and Yukawa H (1995), “Isolation of promoters from Brevibacterium Flavum strain 82 MJ 233C and comparison of their gene expression levels in B Flavum and E coli”, FEMS Microbiol, Lett, Vol 131, pp 121 - 126 ... l? ??i thành công để cải tiến chủng sản xuất cho sản l? ?ợng L- lysin cao 1.6.2 Vai trò gen lysC đường sinh tổng hợp L- lysin Gen lysC gen quan trọng tổ hợp gen sinh tổng hợp L- lysin Nó mã hóa cho enzym. .. glutamicum sinh tổng hợp L- lysin cao dựa vào đặc điểm hình thái tính chất sinh l? ?, sinh hóa Tách dịng gen lysC mã hóa enzym aspartokinase từ chủng C .glutamicum phân l? ??p 3 Xác định trình tự đoạn gen lysC. .. aspartokinase sinh tổng hợp L- lysin ”  Mục tiêu luận văn Tuyển chọn số chủng C glutamicum có khả sinh tổng hợp L- lysin cao từ nguồn đất Việt Nam Tách dịng đọc trình tự gen lysC mã hóa cho aspartokinase