Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 29, Số (2013) 24-28 Tách dòng cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mơ não người Việt Nam Võ Thị Thương Lan1,*, Phan Hà Mỵ1, Đinh Đồn Long1,2 Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ enzyme-protein, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 08 tháng năm 2013 h nh a ngày 22 tháng năm 2013; ch nhận ăng ngày 05 tháng năm 2013 Tóm tắt Thụ thể neurokinin-1 (NK-1R) thuộc nhóm thụ thể xuyên màng liên kết với G protein (GPCR) NK-1R óng vai trò ịnh ự ống tế bào thần kinh, tham gia vào việc iều hòa hản xạ nơn, chức tim mạch, hô h iều ch nh hành vi hản xạ Ái lực liên kết với hối t hụ thuộc vào ự a dạng trình tự amino acid NK-1R NK1R tái tổ hợ ược biểu hệ thống tế bào ộng vật ược dụng ể àng lọc ch t ối kháng cạnh tranh (ch t ối vận) với hối t ản xu t biệt dược Trong báo này, chúng tơi trình bày kết hân lậ cDNA hồn ch nh từ mơ não, trình tự nucleotide trình tự amino acid uy diễn NK-1R người Việt Sự khác amino acid o với liệu gốc Databank khơng làm ảnh hưởng ến tính xun màng thụ thể có lực liên kết khác với loại hối t Do ó, cDNA hoàn ch nh người Việt tạo ể biểu NK-1R tế bào ộng vật ể àng lọc dược liệu Việt Nam Từ Khóa: Thụ thể neurokinin-1 (NK-1R), Thụ thể kết cặ G-protein (GPCR), Ch t ối kháng thụ thể, người Việt Nam Tổng quan hòa hản xạ nôn, chức tim mạch, hô h iều ch nh hành vi hản xạ khác [3] Ngồi ra, NK-1R tham gia vào ự tiết ường ruột, iều tiết miễn dịch hay co bó trơn thể [4, 5] Đặc biệt, Ro o cộng ự ã chứng minh vai trò NK-1R liên quan ến hát triển khối u ác tính [6] Thụ thể neurokinin-1 (NK-1R) thuộc nhóm thụ thể xuyên màng liên kết với G rotein ược biểu nhiều nh t não [1] NK-1R liên kết chủ yếu với ch t P tế bào G rotein tế bào, từ ó truyền tải tín hiệu au ớn gây ứng inh lí cho tế bào [2] NK-1R óng vai trò ịnh ự ống tế bào thần kinh, tham gia vào việc iều Gen mã hóa cho NK-1R gen ơn Ở người, gen nằm nhiễm ắc thể ố 2, có exon Trình tự nucleotide gen NK1 ược Takaha hi cộng ự công bố năm 1991 Trong _ Tác giả liên hệ ĐT: 84-0988551068 E-mail: vothithuonglan@hus.edu.vn 24 V.T.T Lan nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 24-28 thời gian này, trình tự cDNA mã hóa cho thụ thể NK1 người ược công bố Ho kin cộng ự [7] Trình tự rotein thụ thể NK-1R có 407 amino acid ba ối tượng người, chuột nhà chuột ồng Trình tự amino acid NK-1R người chuột có ộ tương ồng cao 99%, ch khác 22 amino acid Sự khác không ảnh hưởng nhiều ến liên kết với ch t P ố ch t tín hiệu khác Tuy nhiên, lực liên kết dạng NK-1R với loại thuốc dược liệu có ự thay ổi rõ rệt [8, 9] Vì vậy, hân lập gen mã hóa cho NK-1R từ tộc người vùng ịa lý khác ặc biệt có ý nghĩa nghiên cứu ch t ối kháng thụ thể ác ch t ối kháng thụ thể hối t (có thể thuốc có ch t hóa học khác nhau) liên kết với thụ thể không gây hản ứng inh học làm giảm hay khóa hản ứng trung gian ch t chủ vận Thuốc ối kháng thụ thể cạnh tranh với hối t nội inh ể liên kết với thụ thể Tương tự vậy, ch t ối kháng NK-1R hợ ch t hay dược liệu có lực liên kết cao với NK-1R, tranh ch vị trí liên kết ch t P khơng gây ứng thể liên kết với thụ thể [10] Vào năm 1980, ch t ối kháng với hối t gắn thụ thể NK1 ầu tiên ược tổng hợ thúc ẩy mạnh mẽ nghiên cứu thuốc ối kháng NK-1R [3] Hiện nay, thuốc ối kháng NK-1R tham gia vào hỗ trợ iều trị lâm àng bệnh chủ yếu liên quan ến thần kinh trầm cảm, tre , chứng au n a ầu, giảm au, triệu chứng tâm thần rối loạn thần kinh hỗ trợ bệnh nhân hóa trị liệu [8, 9] Mặc dù NK-1R ch t ối kháng NK-1R có ứng dụng rộng rãi lĩnh vực y, dược, nghiên cứu NK-1R Việt Nam 25 r t chưa ược công bố Nghiên cứu trình bày kết hân lậ cDNA hồn ch nh mã hóa cho NK-1R từ người Việt Nam nhằm mục ích chủ ộng biểu thụ thể cho nghiên cứu tiế theo àng lọc ch t ối kháng từ dược liệu Việt Nam Nguyên liệu phương pháp Mẫu u não au hẫu thuật ược giữ nitơ ược dụng ể tách chiết ARN tổng ố PureLink Kit (Invitrogen) Hai µg RNA tổng ố ược dùng làm khuôn hản ứng hiên mã ngược tổng hợ cDNA dụng oligoT enzyme Reverse Transcriptase (Invitrogen) Phản ứng ược thực theo quy trình hướng dẫn Invitrogen Phản ứng RT-P R ược thực ể khuếch ại riêng biệt hai oạn 5’ 3’ cDNA cặ mồi NK1 F: 5’ GAAATGGATAA GT T 3’ NK1 R1: 5’ G AG AGATGG GA AGG 3’ (nhân oạn 5’), cặ mồi NK1 F1: 5’ GATCTACTTCCTC TG 3’ NK1 R: 5’ AAGT AGTGTGAGGGTG 3’ (nhân oạn 3’) Phản ứng dụng µl cDNA với chu trình nhiệt lặ lại 40 chu kỳ (94oC phút; 60o 30’’; 72o 90’’) Sản hẩm au ó ược x lý với enzyme SmaI nối với nhờ DNA liga e tạo nên cDNA hồn ch nh ể tách dòng vector JET1.2 biến nạ vào E coli DH5 ác hản ứng P R ều dụng enzyme Pfu Taq olymera e có hoạt tính ọc a ể ảm bảo tính xác trình nhân bản.Trình tự cDNA ược xác ịnh máy tự ộng Sơ hản ứng ược trình bày Hình 26 V.T.T Lan nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 24-28 Hình Sơ hân lậ cDNA thụ thể NK1 dụng cặ mồi nhân vùng 5’ vùng 3’ riêng biệt Sản hẩm 1,4 kb ược tinh ạch Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), ược tách dòng vector Jet1.2 (Fermenta ) ược biến nạ vào tế bào khả biến E coli DH5α ác khuẩn lạc mọc môi trường thạch LB bổ ung Am icillin ược chọn ể àng lọc la mid tái tổ hợ mang cDNA-NK1 P R (Hình 3) Kết 3.1 Phân lập hai đoạn 5’ 3’ cDNA mã cho thụ thể NK-1R S dụng hai cặ mồi NK1 F/NK1 R1; NK1 F1/NK1 R hản ứng P R, hân lậ hai oạn NK1- 5’ NK1- 3’ tương ứng với hai vùng 5’ 3’ NK1, dụng khuôn cDNA Kết khuếch ại hai oạn rõ nét có kích thước tính tốn 788 b 728 ược trình bày Hình 2A Hai oạn NK1-5’ NK1-3’ ược cắt với SmaI, ược tinh ạch Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) ược nối với DNA liga e Sản hẩm nối ược dụng làm khuôn cho hản ứng P R với cặ mồi NK1 F/NK1 R ể khuếch ại oạn DNA 1,4 kb tương ứng với cDNA-NK1 hồn ch nh (Hình 2B) (A) Hình Điện di ản hẩm P R àng lọc khuẩn lạc với cặ mồi JET F/R Giếng 45-53: ác khuẩn lạc ược àng lọc; Đ : Đối chứng âm khơng có khuôn ADN; M: Thang chuẩn SY – 500 3.2 Xác định trình tự nucleotide cDNA hồn chỉnh thụ thể NK-1R Pla mid tái tổ hợ ược tách chiết từ dòng khuẩn lạc ( ố 5, – Hình 3) ược xác ịnh trình tự máy ọc tự ộng Kết o ánh với liệu Databank cho th y trình tự rotein uy diễn thụ thể NK1 hân lậ người Việt Nam có amino acid khác o với trình tự Databank (Hình Bảng 1) (B) Hình Điện di ản hẩm P R hân lậ NK1-5’ NK1-3’ (A) NK1 hoàn ch nh (B) Giếng 5’: oạn NK1-5’; Giếng 3’: oạn NK1-3’; Đ : ối chứng âm khn cDNA; Giếng NK1: cDNA hồn ch nh NK1 M: Thang chuẩn SY-500 Hình So ánh trình tự amino acid uy diễn thụ thể NK1 người Việt Nam với trình tự gốc Databank 27 V.T.T Lan nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 24-28 Bảng Sai khác trình tự amino acid thụ thể NK1 người Việt với trình tự rotein N BI R - Arginine (62) G - Glycine T – Threonine (124) A - Alanine Y – Tyrosine (214) C - Cysteine E - Glutamic acid (332) G - Glycine (Chú thích: (62), (124), (214) (332) vị trí amino acid trình tự rotein gốc) Thảo luận Khi ối chiếu khác acid amin c u trúc 2D thụ thể NK-1R, nhận th y ba vị trí quan trọng liên quan ến chức thụ thể [1] ều không bị thay ổi ho ến chưa có tài liệu cơng bố c u trúc 3D thụ thể NK-1R Vì vậy, chuyển ộng hay biến ổi thụ thể NK-1R liên kết với ch t P G-protein ều chưa ược biết rõ [4] Hiện tại, thay ổi c u trúc 3D thụ thể NK-1R ược o ánh với thụ thể GP R β2adrenergic xem xét biến ổi trình ược hoạt hóa Với thụ thể NK-1R người Việt Nam, ch amino acid khác ược cho liên quan ến q trình hoạt hóa thụ thể NK-1R Tuy nhiên amino acid sai khác amino acid ưa nước giống amino acid vị trí trình tự gốc [7] S dụng hần mềm TMHMM server 2.0 [11] ể kiểm tra tính xuyên màng trình tự rotein uy diễn thu ược, nhận th y khác amino acid nhiều khả khơng ảnh hưởng ến tính xun màng (Hình 5) Xác suất Acid amin (Mẫu người Việt Nam) Vùng xuyên màng Bên Bên Thụ thể NK-1R người Việt Nam Xác suất Acid amin (NM_007053.3) Thụ thể NK-1R (ngân hàng gen NM_007053.3) Vị trí axit amin Hình Kiểm tra tính xun màng rotein thụ thể NK1 gốc (Databank) rotein uy diễn thụ thể NK1 hân lậ từ người Việt Nam hần mềm TMHMM erver 2.0 [11] Kết luận húng ã hân lậ ược cDNA hồn ch nh mã hóa cho thụ thể NK1 người Việt Nam Trình tự amino acid uy diễn cho th y có khác o với trình tự gốc Databank Tuy nhiên hân tích mơ hỏng cho th y ự khác có lẽ khơng ảnh hưởng ến tính xun màng thụ thể mà hân lậ ược cDNA hoàn ch nh ẽ ược biểu tế bào ộng vật nuôi c y, xây dựng hệ thống th thuốc nhằm àng lọc ch t ối kháng từ nguồn dược liệu nước ta Lời cảm ơn húng trân trọng cảm ơn ự tài trợ Bộ Khoa học ông nghệ Việt Nam cho ề tài ĐT-PTNTĐ.2011-G/04 ể thực nghiên cứu 28 V.T.T Lan nnk /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 29, Số (2013) 24-28 Tài liệu tham khảo [1] [2] [3] [4] [5] T.A Almeida, J Rojo, P.M Nieto, F.M Pinto, M Hernandez, J.D Martín, M.L Candenas Tachykinins and tachykinin receptors: structure and activity relationships Bentham Science Publishers 11 (2004), 2045 E.W Greeno, P Mantyh, G.M Vercellotti, C.F Moldow Functional neuroklnin receptors for substance P are expressed by human vascular endothelium The Journal of Experimental Medicine 177 (1993), 1269 L Quartara, C.A Maggi The tachykinin NK1 receptor Part I: Ligands and mechanisms of cellular activation Neuropeptides 31(1997), 537 J InHae, H.J Tae Differential roles of exoloop of the human follicle – stimulating hormone receptor in hormone binding and receptor activation J Biological Chemistry 270 (1995), 15970 T Kincy-Cain, K.L Bost Increased susceptibility of mice to Salmonella infection following in vivo treatment with the substance P antagonist, spantide II The Journal of Immunology 157 (1996), 255 [6] M Rosso, M Munoz, M Berger The Role of Neurokinin-1 Receptor in the Microenvironment of Inflammation and Cancer The Scientific World Journal (2012), Doi:10.1100/2012/381434 [7] B Hopkins, S.J Powell, P Danks, I Briggs, A Graham Isolation and characterization of the human lung NK-1R cDNA Biochemical and Biophysical Research Comm 180 (1991), 1110 [8] I Marriott, K.L Bost Subtance P University of North Carolina, (2001), DOI: 10.1006/rwcy.2001.13005 [9] M.P Rogers, L Blackburn, MS, et al Use of Neurokinin – receptor antagonists in patients receiving moderately or highly emetogenic chemotherapy Clinical Journal of Oncology Nursing 14 (2010), 500 [10] M.J.N Rupnipak, M.S Kramer Substance P and related tachykinins Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress (2002), 169 [11] http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ Isolation of full length cDNA encoding NK1 receptor from Vietnamese brain tissue Võ Thị Thương Lan1, Phan Hà Mỵ1, Đinh Đoàn Long1,2 Key Lab for Enzyme-Protein Technology, VNU University of Science, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hanoi, Vietnam School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hanoi, Vietnam Abstracts: The NK1 receptor (NK-1R) is a member of family of G-protein coupled receptors (GPCR) NK-1R is widely distributed in both the central and peripheral nervous system It plays an important role in pain and inflammation, and mediating chemotherapy-induced nausea and vomiting High affinity of receptor - ligands and receptor activation are associated with the diverse and differential roles of the amino acids of NK1 receptors The recombinant NK-1R has been used for pharmacological studies and in methods of screening candidate compounds for the ability to antagonize the binding of specific ligands to NK-1R In this study, we isolated full length cDNA encoding NK-1R from Vietnamese brain tissue Nucleotide sequencing and deduced peptide sequence revealed different amino acids as compared to that presented in databank and that these variant acids did not appear to influence transmembrane domains However, these variants might alter the affinity interaction between NK-1R and its ligands Recombinant NK1R corresponding to cDNA isolated from Vietnamese people expressed in mammalian cells would be useful for pharmacological studiesn and in screening candidate compounds extracted from Vietnamese herbal medicines Keywords: Neurokinin-1 receptor (NK-1R), G-Protein coupled receptor, antagonist, Vietnamese ... rotein thụ thể NK1 gốc (Databank) rotein uy diễn thụ thể NK1 hân lậ từ người Việt Nam hần mềm TMHMM erver 2.0 [11] Kết luận húng ã hân lậ ược cDNA hồn ch nh mã hóa cho thụ thể NK1 người Việt Nam. .. cDNA hồn ch nh mã hóa cho NK-1R từ người Việt Nam nhằm mục ích chủ ộng biểu thụ thể cho nghiên cứu tiế theo àng lọc ch t ối kháng từ dược liệu Việt Nam Nguyên liệu phương pháp Mẫu u não au hẫu thuật... gen mã hóa cho NK-1R từ tộc người vùng ịa lý khác ặc biệt có ý nghĩa nghiên cứu ch t ối kháng thụ thể ác ch t ối kháng thụ thể hối t (có thể thuốc có ch t hóa học khác nhau) liên kết với thụ thể