Các chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) thường được sử dụng để điều trị alzheimer. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm ra thuốc điều trị alzheimer tiềm năng với cơ chế ức chế AChE từ dược liệu góp phần ngăn chặn tiến triển của bệnh.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƢỢC LIỆU Đỗ Thị Quỳnh Quyên*, Nguyễn Thị Hồng Phúc**, Nguyễn Thị Minh Thuận*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mở đầu: Các chất ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) thường sử dụng để điều trị Alzheimer Nghiên cứu n|y thực nhằm tìm thuốc điều trị Alzheimer tiềm với chế ức chế AChE từ dược liệu góp phần ngăn chặn tiến triển bệnh Phương pháp: Khảo sát tác dụng ức chế AChE in vitro cao chiết cồn 80% từ 12 dược liệu phương ph{p đo quang Ellman sử dụng chất ACTI thuốc thử DTNB đĩa 96 giếng bước sóng 415nm Chọn mẫu dược liệu có tác dụng mạnh để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học Kết quả: Đề tài chọn cao tồn phần Dừa cạn có tác dụng ức chế 50,26% nồng độ 1mg/ml Khảo sát thành phần hóa thực vật dừa cạn, từ c{c cao ph}n đoạn thu ph}n đoạn có hoạt tính ức chế enzym AChE tiềm Kết luận: Những kết tiền đề cho nghiên cứu s}u hướng tác dụng ức chế AChE dược liệu Dừa cạn Đồng thời dựa vào quy trình sàng lọc x{c định để tiếp tục thử nghiệm mẫu dược liệu khác nhằm tìm dược liệu có tiềm cao Từ khóa: Ức chế enzym acetylcholinesterase, Dừa cạn, in vitro ABSTRACT IN VITRO SCREENING FOR ACETYLCHOLINESTERASE INHIBITION ACTIVITY FROM SOME MEDICINAL PLANTS Do Thi Quynh Quyen, Nguyen Thi Hong Phuc, Nguyen Thi Minh Thuan, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 235 - 240 Introduction: Acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs) are commonly used for Alzheimer’s treatment This research aims to find potential agents from medicinal plants helping prevent progressive Alzheimer's disease Methods: Evaluation of the AChE inhibitory activity of alcoholic 80% extracts of 12 plants was performed in vitro by using Ellman method with acetylthiocholine iodide as substrate and dithiodinitrobenzoic acid as reagent in 96-well plates at 415 nm The strongest effectively extracts were taken to investigate its chemical compositions Results: The present study demonstrated that total extract of Catharanthus roseus possessed 50,26% inhibitiory activity at concentration of 1mg/ml Investigation of the plant composition Catharanthus roseus from total extract obtained fraction extracts having a potential AChEi activity Conclusion: Results are a prerequisite for further studies toward AChEi activity of Catharanthus roseus Furthermore, the screening model of AChE inhibitory activity in vitro established could be used for other medicinal plants to find the higher potential AChEi agents Keyword: Acetylcholinesterase inhibitors, Catharanthus roseus, in vitro *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dƣợc, Đại học Nguyễn Tất Thành Tác giả liên lạc: Võ Thị Bạch Huệ ĐT: 0908420240 Email: vothibachhue@gmail.com Chuyên Đề Dƣợc 235 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển sống đại sa sút trí tuệ - bệnh đƣợc biết đến với c{i tên Alzheimer đ ng trở nên phổ biến Sinh bệnh học Alzheimer phức tạp liên qu n đến nhiều yếu tố nhƣ myloid bet Aβ (5), protein tau(9), viêm thần kinh(11), tổn thƣơng củ c{c syn p nhƣ c{c tế bào thần kinh(3) < Vì việc sử dụng loại thuốc cổ truyền với nhiều mục tiêu có lẽ có ƣu so với việc sử dụng loại thuốc điều trị triệu chứng bệnh lý Acetylcholin (ACh) có vai trò quan trọng hoạt động hệ thần kinh, chất dẫn truyền thần kinh khe synap nồng độ ACh đƣợc trì ổn định enzym acetylcholinesterase (AChE), enzym có chức l|m ngƣng lại hoạt động chất dẫn truyền thần kinh ACh thông qua việc thủy phân ACh tạo thành cholin acid acetic Ở bệnh nhân Alzheimer, nồng độ ACh bị suy giảm đ{ng kể(1) Do vậy, thuốc ức chế AChE đóng v i trò quan trọng việc ngăn chặn tiến triển bệnh Alzheimer Các thuốc ức chế cholinesterase thị trƣờng n y đ số thuốc t}n dƣợc nhƣng gi{ th|nh thuốc tƣơng đối cao có tác dụng phụ không mong muốn Nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu để hỗ trợ v| điều trị Alzheimer l| điều cần thiết Vì nghiên cứu n|y đƣợc tiến hành nhằm tìm r ph}n đoạn chiết tiềm từ dƣợc liệu góp phần ngăn chặn tiến triển chứng suy giảm trí nhớ nhƣ bệnh Alzheimer NGUYÊN LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 12 dƣợc liệu đƣợc lựa chọn từ kinh nghiệm dân gian, từ tài liệu tổng quan c{c dƣợc liệu hoạt chất có tác dụng ức chế AChE đƣợc sàng lọc nhiều nƣớc giới(4,7,10) C{c dƣợc liệu n|y đƣợc thu thập TpHCM 236 tỉnh miền Trung Việt Nam theo danh sách bảng ảng : Danh mục c{c dược liệu tiến hành khảo s{t sơ tác dụng ức chế AChE TT Tên dược liệu Cỏ sữa Tên khoa học Họ Euphorbia thymifolia Euphorbiaceae Toàn Cỏ cứt lợn Ageratum conyzoides Đan sâm Dừa cạn Gùi Bộ phận dùng Salvia miltiorrhiza Asteraceae Toàn mặt đất Lamiaceae Rễ củ Cantharanthus roseus Apocynaceae Toàn Willughbeia Apocynaceae Dây cochinchinensis Khương Thân rễ Notopterygium incisum Apiaceae hoạt Mần trầu Poaceae Tồn Eleusine indica Muồng hòe Cassia surattensis Fabaceae Lá Riềng Alpinia officinarum Zingiberaceae Thân rễ Anemarrhena Tri mẫu Liliaceae Thân rễ asphodeloides Trinh nữ Fabaceae Toàn Mimosa pudica Xuyên tiêu Zanthoxylum nitidum Rutaceae Vỏ Nguyên liệu đƣợc định danh dựa vào hình ảnh, tài liệu tham khảo để tránh nhầm lẫn Hóa chất AChE loại C3389 (Sigma-Aldrich), Acetylthiocholin iodid (ATCI) (Sigma-Aldrich), Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) (Sigma-Aldrich) Các dung môi n-hexan, chloroform, ethyl cet t EtOAc đạt tinh khiết phân tích Phƣơng pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE mẫu dược liệu in vitro Chuẩn bị mẫu: 30g dƣợc liệu khô sau xay nhỏ thành bột đƣợc rây qua rây 2mm tiến hành chiết nóng với dung mơi cồn 80% Dịch chiết thu đƣợc cô loại dung m i thu đƣợc cao toàn phần mẫu thử Pha cao mẫu thử DMSO 10% nồng độ 1mg/ml Đ{nh gi{ t{c dụng ức chế enzym AChE mẫu dƣợc liệu phƣơng ph{p đo qu ng in vitro dựa nguyên tắc củ phƣơng ph{p Ellman(2): Cơ chất ATCI bị thủy phân enzym AChE tạo thiocholin Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid DTNB tạo thành hợp chất Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học acid 5-thio-2-nitro benzoic có m|u v|ng Cƣờng độ màu chất tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym AChE Dự v|o độ hấp thu mẫu thử đƣợc x{c định bƣớc sóng 415nm để đ{nh gi{ khả ức chế hoạt tính enzym AChE dƣợc liệu Hoạt tính ức chế AChE in vitro mẫu thử đƣợc x{c định giá trị phần trăm hoạt tính enzym bị ức chế I% v| đƣợc x{c định theo công thức: I% = (1 – AbsT/AbsC) x 100 (CT1) Trong đó: I%: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế AbsT AbsC lần lƣợt l| độ hấp thu mẫu thử mẫu chứng Mỗi mẫu thử đƣợc thực lặp lại lần, lần làm giếng Thành phần hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày bảng ảng : Thành phần hỗn hợp phản ứng đo quang in vitro Mẫu Mẫu Mẫu đối Mẫu trắng thử trắng chứng chứng (µl) (µl) thử (µl) (µl) STT Thành phần Đệm phosphat pH 80 100 Mẫu thử 20 20 0 DMSO 10% 0 20 20 Enzym AChE 0,25U/ml 20 20 ACTI 2,4mM 40 40 40 40 DTNB 2,4mM Tổng thể tích (µl) 80 100 40 40 40 40 200 200 200 200 Quy trình thử nghiệm đƣợc tóm tắt theo sơ đồ hình Để có sở đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE in vitro mẫu nghiên cứu, berberin clorid đƣợc lựa chọn làm mẫu đối chứng dƣơng Hợp chất n|y đƣợc nghiên cứu chứng minh sở hữu hoạt tính ức chế AChE in vitro mạnh Thực tế, berberin clorid đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng số nghiên cứu(6,8) Chuyên Đề Dƣợc ình : Sơ đồ quy trình thử nghiệm hoạt tính ức chế AChE in vitro Từ kết sàng lọc trên, chọn mẫu dƣợc liệu có tác dụng cao để tiếp tục khảo sát hóa học sàng lọc c{c ph}n đoạn nhỏ có tác dụng dƣợc lý mạnh dƣợc liệu Khảo sát thành phần hóa thực vật mẫu dƣợc liệu theo định hƣớng tác dụng ức chế enzym AChE in vitro Chiết xuất phân lập Dƣợc liệu đƣợc chiết ngấm kiệt với cồn 80% (tỷ lệ dƣợc liệu dung môi 1: 15) Sau cô quay thu hồi thu đƣợc cao toàn phần Từ cao toàn phần, lắc phân bố với dung môi hỗn hợp dung môi (n-hexan, chloroform, ethyl cet t để phân tách thành c{c ph}n đoạn có độ phân cực khác Theo dõi qu{ trình t{ch ph}n đoạn sắc ký lớp mỏng S u đó, ph{t vết phƣơng ph{p soi UV bƣớc sóng 254nm, 365nm thuốc thử vanillin – sulfuric (VS) Sau khi, loại dung m i thu đƣợc ph}n đoạn đơn giản Từ c{c ph}n đoạn này, tiến hành phân lập phƣơng ph{p sắc ký cột ch}n kh ng để t{ch th|nh c{c ph}n đoạn nhỏ Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn phân lập Tiến hành khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE củ c{c ph}n đoạn thu đƣợc từ phƣơng 237 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 pháp sắc ký cột ch}n kh ng theo quy trình nhƣ mẫu c o dƣợc liệu để chọn phân đoạn có tác dụng cao trình theo sơ đồ hình hình KẾT QUẢ Kết đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro ảng : Kết đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE 12 dược liệu nghiên cứu STT Tên dược liệu Cỏ sữa Cỏ cứt lợn Dừa cạn Đan sâm Gùi Khương hoạt Mần trầu Muồng hòe Riềng Tri mẫu Trinh nữ Xuyên tiêu % ức chế 9,23 50,26 8,54 2,91 3,67 - * Ghi chú: (-) khơng có tác dụng tác dụng khơng rõ ràng Nhận xét: Kết bảng cho thấy 12 mẫu dƣợc liệu khảo sát có mẫu dƣợc liệu có khả enzym ức chế AchE, mẫu dƣợc liệu khơng có tác dụng tác dụng khơng rõ ràng Trong mẫu dƣợc liệu có tác dụng in vitro, Dừa cạn có tác dụng kháng enzym AChE rõ rệt (50,26%) so với mẫu lại Vì thế, Dừa cạn đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát hóa học phân lập ph}n đoạn nhỏ có tác dụng mạnh dƣợc liệu ình : Quy trình chiết xuất cao alkaloid tồn phần từ dược liệu Dừa cạn Khảo sát thành phần hóa thực vật Dừa cạn theo định hƣớng tác dụng ức chế enzym AChE Chiết xuất tách phân đoạn Theo kết sơ thành phần hóa thực vật dƣợc liệu Dừa cạn nhận thấy mẫu dịch chiết cồn 80% có alkaloid thành phần bật Vì thế, chiết xuất phân lập tập trung vào thành phần alkaloid củ dƣợc liệu Quy trình chiết xuất xử lý sơ cao alkaloid toàn phần từ dƣợc liệu Dừa cạn đƣợc 238 ình : Quy trình xử lý sơ cao alkaloid toàn phần Dựa vào sắc ký lớp mỏng khối lƣợng c o thu đƣợc, chọn cao n-hexan cao EtOAc Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học để tiến hành sắc ký cột chân không UV 365 UV 245 Thuốc thử VS Thuốc thử Dragendorff ình 4: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra c{c cao ph}n đoạn Kết quả: Từ cao n-hex n thu đƣợc phân đoạn nhỏ đƣợc kí hiệu từ H1 – H8 Từ cao EtOAc thu đƣợc 18 ph}n đoạn nhỏ kí hiệu từ E1 – E18 Áp dụng phƣơng ph{p đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE in vitro đƣợc x{c định để khảo sát tác dụng củ c{c ph}n đoạn phân lập đƣợc từ hai cột sắc ký Kết đƣợc trình bày bảng bảng Khảo sát tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn phân lập ảng : Kết đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AChE c{c ph}n đoạn cột cao n-hexan Phân đoạn (1mg/ml) % ức chế Phân đoạn (1mg/ml) % ức chế H1 4,97 H5 30,22 H2 13,15 H6 17,20 H3 6,31 H7 16,74 H4 -7,26 H8 29,90 ảng : Kết đ{nh gi{ hoạt tính kháng enzym AchE c{c ph}n đoạn cột cao EtOAc Phân đoạn (1mg/ml) % ức chế Phân đoạn (1mg/ml) % ức chế Phân đoạn (1mg/ml) % ức chế E1 -6,47 E7 23,98 E13 40,24 E2 13,54 E8 19,27 E14 67,26 Nhận xét: Ở nồng độ 1mg/ml, c{c ph}n đoạn cao EtOAc cho kết ức chế enzym tốt so với c{c ph}n đoạn cao n-hexan Nhƣ c{c ph}n đoạn có độ phân cực trung bình đến mạnh có tác dụng dƣợc lý tốt c{c ph}n đoạn phân cực Trong đó, ph}n đoạn E17 có kết ức chế enzym mức c o 78,79% , c{c ph}n đoạn E14 v| E16 cho kết mức tƣơng đối (67,26 68,45%) Có h i ph}n đoạn cho kết âm dung mơi khơng thể hòa tan hồn tồn mẫu làm cho Chuyên Đề Dƣợc E3 25,61 E9 25,70 E15 61,97 E4 13,10 E10 16,46 E16 68,45 E5 18,99 E11 22,69 E17 78,79 E6 16,93 E12 35,65 E18 37,16 dung dịch phản ứng bị đục dẫn tới sai lệch kết BÀN LUẬN Khảo sát tác dụng ức chế AChE in vitro cao chiết cồn 80% từ 12 dƣợc liệu phƣơng pháp đo quang Ellman sử dụng chất ACTI thuốc thử DTNB đĩa 96 giếng bƣớc sóng 415nm Chọn mẫu dƣợc liệu có tác dụng mạnh để tiếp tục khảo sát thành phần hóa học Đề tài định hƣớng để tiếp tục khảo sát sâu Dừa 239 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 cạn- dƣợc liệu từ lâu đƣợc biết với alkaloid (vincristin; vinblastin) trị ung thƣ vú KẾT LUẬN Từ 12 dƣợc liệu sàng lọc chọn đƣợc Dừa cạn có tác dụng ức chế AChE Phân tích thành phần hóa học Dừa cạn thu đƣợc ph}n đoạn cao EtOAc cho tác dụng ức chế AChE tốt E14, E16 v| E17 Trong tƣơng l i tiến hành nghiên cứu s}u dƣợc liệu Dừa cạn áp dụng quy trình sàng lọc x{c định để tìm dƣợc liệu có tiềm ức chế AChE tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO Auld DS, Kornecook TJ, Bastianetto S, Quirion R (2002) Alzheimer’s dise se nd the b s l forebr in cholinergic system: rel tions to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies Progress in neurobiology, 68(3):209-245 Ellman GL, Courtney KD, Andres V, Featherstone RM (1961) A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity Biochemical pharmacology, 7(2):88IN191-9095 Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK (1999) The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s dise se: review of progress Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66(2):137-147 240 10 11 Gholamhoseinian A, Moradi M, Sharifi-Far F (2009) Screening the methanol extracts of some Iranian plants for acetylcholinesterase inhibitory activity Research in pharmaceutical sciences, 4(2):105 Hardy J, Allsop D (1991) Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease Trends in pharmacological sciences, 12:383-388 Hoàng Việt Dũng Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase hai loài Piper thomsonii (C DC.) Hook f var Thomsonii Piper hymenophyllum Miq., họ hồ tiêu Piper ce e , Đại học Dƣợc Hà Nội; 2014 Houghton PJ, Ren Y, Howes M-J (2006) Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi Natural Product Reports, 23(2):181-199 Min BS, Cuong TD, Lee J-S, Shin B-S, Woo MH, Hung TM (2010) Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus buds Archives of pharmacal research, 33(10):1665-1670 Mudher A, Lovestone S (2002) Alzheimer's disease–do tauists and baptists finally shake hands? Trends in neurosciences, 25(1):22-26 Mukherjee PK, Kumar V, Mal M, Houghton PJ (2007) Acetylcholinesterase inhibitors from plants Phytomedicine, 14(4):289-300 Shen Z (2004) Brain cholinesterases: II The molecular and cellular basis of Alzheimer's disease Medical hypotheses, 63(2):308-321 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 Chuyên Đề Dƣợc ... đ{nh gi{ khả ức chế hoạt tính enzym AChE dƣợc liệu Hoạt tính ức chế AChE in vitro mẫu thử đƣợc x{c định giá trị phần trăm hoạt tính enzym bị ức chế I% v| đƣợc x{c định theo công thức: I% = (1... đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE in vitro mẫu nghiên cứu, berberin clorid đƣợc lựa chọn làm mẫu đối chứng dƣơng Hợp chất n|y đƣợc nghiên cứu chứng minh sở hữu hoạt tính ức chế AChE in vitro mạnh... o dƣợc liệu để chọn phân đoạn có tác dụng cao trình theo sơ đồ hình hình KẾT QUẢ Kết đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro ảng : Kết đ{nh gi{ hoạt tính ức chế AChE 12 dược liệu nghiên cứu STT