Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết hoàng liên (coptis chinensis franch)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN BÍCH HẠNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN COPTIS CHINENSIS FRANCH KH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA

CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN

(COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN BÍCH HẠNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM

ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA

CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN

(COPTIS CHINENSIS FRANCH)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: TS BÙI THANH TÙNG

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin

trân trọng cảm ơn TS Bùi Thanh Tùng – giảng viên bộ môn Dược lý –

Dược lâm sàng Khoa Y Dược - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận

tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và

hoàn thành nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

từ các thầy cô phụ trách trong các phòng thí nghiệm của Khoa Tôi xin chân

thành cảm ơn Khoa Y dược đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất,

các dụng cụ phòng thí nghiệm cho tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn bộ thầy cô trong bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng cùng toàn thể các thầy cô Khoa Y Dược đã giúp đỡ,

trang bị cho tôi nhiều điều bổ ích và thực sự đó là những hành trang quý báu

giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt và ý nghĩa nhất tới ông bà,

bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn chỉ bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên

tôi để tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Bích Hạnh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AChE Enzym actylcholinesterase

ACTI Acetylthiocholine iodid

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

pH Chỉ số đo hoạt động của ion hidro (Hydrogen power)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng 27

Bảng 3.2 Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên

chân gà và Berberin clorid

28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên 7

Hình 1.3 Các vị trí hoạt động của enzym AChE 14

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên 20

Hình 2.2 Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 21

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro 23

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro 25

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà 29

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của Berberin clorid 29

Hình 3.3 Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH 31

Hình 3.4 Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định hằng số ức chế Ki 31

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) – Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Phân bố, trồng trọt và thu hái 4

1.1.3 Thành phần hóa học 5

1.1.4 Bộ phận dùng 8

1.1.5 Tác dụng dược lý 8

1.2 Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 13

1.2.1 Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 13

1.2.2 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 15

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu 19

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 19

2.1.2 Hóa chất, dung môi 19

2.1.3 Máy móc, thiết bị và dụng cụ 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 19

2.2.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE 24

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

3.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE 27

3.2 Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE 30

3.3 Bàn luận 32

3.3.1 Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32 3.3.2 Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Cuộc sống hiện đại ngày càng phát triển cùng với đó cũng là sự gia tăng của bệnh suy giảm trí nhớ - đặc biệt là Alzheimer không chỉ ở người cao tuổi mà thậm chí người trẻ tuổi cũng mắc phải Năm 2012, Tổ chức y tế thế giới đã cảnh báo về mối lo ngại do bệnh này gây ra và đưa bệnh Alzheimer vào vấn đề sức khỏe cộng đồng cần được ưu tiên [11] Nghiên cứu cho thấy

có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, thống kê tại châu Á có khoảng gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 con số này có thể tăng lên đến 62,8 triệu người Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng điển hình là Alzheimer Đây được coi là căn bệnh nặng nhất trong các nhóm bệnh sa sút trí tuệ, hiện nay là mối quan tâm hàng đầu của những nhà lão khoa trên toàn thế giới cũng như ở nước ta khi tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh ngày càng nhiều [6]

Bệnh nhân bị Alzheimer sẽ bị giảm khả năng xét đoán, định hướng không gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức và hành động ảnh hưởng nặng nề đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình và xã hội

Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D – Aspartat, thuốc tăng cường hoạt tính serotonin Ba nhóm thuốc này đa số là các thuốc tân dược, giá thành còn tương đối cao và có nhiều tác dụng phụ không mong muốn Do đó nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ

và điều trị Alzheimer là rất cần thiết

Acetylcholinesterase (AChE) là enzym có mặt ở khe synap của hệ thần kinh trung ương và có vai trò duy trì sự ổn định nồng độ của chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin [8] Với việc Whitehouse lần đầu tiên đưa ra giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer vào năm 1982, AChE cũng được xác định là một trong những đích phân tử đối với bệnh này

Trên cơ sở đó, một vài phương pháp thử in vitro đã được xây dựng Trong đó,

phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được sử dụng khá phổ biến

trong các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro Đây cũng là

một hướng quan trọng và nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

trên thế giới và trong nước, đặc biệt đối với các thuốc có nguồn gốc dược liệu [27,34]

Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, Hoàng liên là thân rễ phơi khô của

nhiều loại Hoàng liên chân gà như: Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis teetoides C.Y Cheng, Coptis deltoidea C.Y Cheng et Hsisao,

Coptis quinquesecta… thuộc họ Hoàng liên – Ranunculaceae được biết đến

với nhiều công dụng như kháng khuẩn, chống virus, chống viêm Ở Việt

Nam, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) được dùng khá phổ biến

trong các bài thuốc với nhiều tác dụng tốt Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy hợp chất berberin và một số alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm năng

ức chế enzym AChE cao mở ra hướng mới trong điều trị bệnh Alzheimer Nhận thấy, trong dịch chiết của Hoàng liên cũng có chứa một lượng lớn các alkaloid đặc biệt là berberin có tiềm năng lớn trong nghiên cứu phát triển thuốc mới từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ - Alzheimer

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức

chế enzym Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)” với mục tiêu:

Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn

dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)

Mục tiêu 2: Đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dịch chiết

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) –

Họ Hoàng liên (Ranunculaceae)

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Hiện nay có rất nhiều loài Hoàng liên chân gà được đưa vào sử dụng và

nghiên cứu như Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao, Coptis quinqueseeta Họ Hoàng liên: Ranunculaceae

Hoàng liên: Coptis chinensis Franch, là một cây thuốc thuộc loại quý

với nhiều tác dụng được dùng trong nhiều bài thuốc ở Việt Nam Tên khác:

Hoàng liên chân gà, Xuyên liên, Phàng lình (H’Mông) [9] Read Coptis (Anh), Coptis savoyard (Pháp) [2,9] Gia liên (Trung Quốc) [9]

Hoàng liên: Coptis chinensis Franch là cây thân thảo, sống nhiều năm,

cao 10-25 cm Thân rễ có màu vàng thường phân nhánh, lá có cuống dài mọc tập trung ở gốc, lá dài và mảnh chia thành 3 thùy chính Mép khía răng không đều, thùy giữa gần giống tam giác cân xẻ thùy hình dạng lông chim, không đều Hai thùy bên giống nhau có cuống lá ngắn hơn thùy giữa Lá có màu xanh lục, nhẵn bóng, cụm hoa gồm 3-5 hoa mọc tụ trên 1 cuống chung dài khoảng 25 cm Hoa nhỏ có màu vàng, lá bắc nhỏ, bao hoa màu lục Năm lá đài có hình mác, 5 cánh hoa thon dài, hoa có khoảng 20 nhị Lá noãn rời nhau khoảng 8-12 noãn Cây ra hoa từ tháng 10-12 Quả có màu đen từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau, nhỏ, dài 6-7 cm, có cuống ngắn Vào mùa xuân cây con, chồi có thể tái sinh từ thân rễ [2,4,5,7,9]

Hình 1.1 Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch)

1.1.2 Phân bố, trồng trọt và thu hái

 Phân bố

Hoàng liên là loại cây thân thảo mọc hoang trên các đỉnh núi cao

Trong cuốn “Thần Nông bản thảo kinh” (Trung Quốc) có viết Hoàng liên là cây thuốc quý cao cấp, được xếp vào loại thượng phẩm, cây mọc ở trên núi Thái Sơn có nhiều ở vùng Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam, Hồ Bắc, Triết Giang [13,14]

Ở Việt Nam, Hoàng liên là loại cây thuốc hiếm thường mọc hoang ở vùng núi có độ cao từ 1500 – 2000 m trong các khu rừng có nhiều cây cổ thụ rậm rạp, ở nơi nửa sáng, nửa tối

 Trồng trọt

Ở Lào Cai, Hoàng liên mọc tại dãy Hoàng Liên Sơn (xã Tả Van, San

Sả Hồ, Lao Chải), Quảng Bạ (Hà Giang) [2,9] Hoàng liên là cây ưa chỗ ẩm mát, nhiệt độ thấp khoảng 20-250C Muốn trồng Hoàng liên, chọn các quả già nhưng chưa nứt vỏ Đem quả về phơi cho nứt vỏ, chọn các hạt mập chắc rồi reo ngay tránh để lâu làm mất khả năng mọc của hạt Nếu chưa gieo ngay cần trộn ủ hạt với đất lẫn cát ẩm Trong vòng 1 tháng phải đem trồng nếu để lâu hạt sẽ không nảy mầm

và rizhome (thân rễ) của Coptis Chinensis Franch Kết quả cho thấy khác biệt đáng kể trong việc phân bố của 7 alkaloid trong các mô được kiểm tra, tổng hàm lượng alkaloid trong xylem tương đối thấp so với hàm lượng trong phloem, medulla và rhizome của Hoàng liên [47,48]

Berberin tinh khiết là dạng tinh thể kết tinh màu vàng, điểm nóng chảy

1450C, tan nhiều trong nước ở 200C, tan trong ethanol, ít tan trong clorofom, benzen, không tan trong ether ethylic UVmax 265, 243nm, pk = 2,47 [2-4]

Hàm lượng berberin trong Hoàng liên đạt 5-6% có khi tới 9% [9]

Theo quy định của Dược điển Việt Nam IV, Dược liệu phải chứa ít nhất 3,5 % beberin (C20H18NO4.HCl) và 0,5% (C21H22NO4 HCl) palmatin tính theo dược liệu khô kiệt [3]

Trong cây, berberin tồn tại dưới dạng clohydrat Hàm lượng alkaloid thay đổi tùy theo vùng và thời kỳ sinh trưởng của cây Ở Tứ Xuyên (Trung Quốc), hàm lượng berberin cao nhất vào tháng 9 và 10, thấp nhất vào thời kỳ cây ra hoa Ngoài thân rễ, lá cũng chứa berberin, hàm lượng cao nhất ở lá già

Ở Nhã Liên (Trung Quốc), hàm lượng berberin chứa 5% vào tháng 9-10 Lá già chứa 2,5 – 2,8% berberin vào tháng 7-10 [4,7,9]

Ngoài ra, trong dịch chiết EtOH của Hoàng liên còn phân lập được 13 hợp chất non-alkaloid như 7 hợp chất lignan, 3 phenylpropanoid đơn giản, 2 hợp chất flavon và 1 hợp chất phenolic acid Đó là các hợp chất: erythro-guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-(coniferyl alcohol) ether, (+)-pinoresinol, (+)-medioresinol, (+)-lariciresinol, (+)-5'-methoxylariciresinol, (+)-isolariciresinol, chlorogenic acid, ferulic acid, Z-octadecyl caffeat, rhamnetin, wogonin, and vanillic acid [12]

Công thức cấu tạo của một số alkaloid phân lập từ thân rễ Hoàng Liên thể hiện ở hình 1.2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số chất trong thân rễ Hoàng liên

1.1.4 Bộ phận dùng

Thân rễ (Rhizoma Coptidis) là những mẩu cong queo dài 3-5 cm, rộng

0,2 - 0,5 cm Có nhiều đốt khúc khuỷu và phân nhánh, trông giống hình chân

gà nên được gọi là Hoàng liên chân gà Mặt ngoài màu nâu mang vết tích của

rễ phụ và cuống lá Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng Phần gỗ màu vàng tươi, vị rất đắng lưu vị lâu trong miệng [2,7,9]

Dung dịch berberin clohydrat được pha loãng tiến hành phản ứng in

vitro cho thấy: nồng độ 1:32000 có tác dụng ức chế đối với Vibrio cholerae;

nồng độ 1:16000 có tác dụng với Staphylococcus aureus; nồng độ 1:8000 có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với Shigella dysenteriae, Streptococcus viridans

[1,4,9]

Tiêm tĩnh mạch trên chó với berberin clohydrat liều lượng 19mg/kg đã cứu sống được con vật bị nhiễm trùng huyết thực nghiệm gây ra bởi

Staphylococcus aureus [1,9]

Dịch chiết thô Hoàng liên có tác dụng ức chế ký sinh đường ruột

Blastocystis hominis rất mạnh với nồng độ 100 µg/ml [1]

Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn: berberin có khả năng ức chế quá trình phiên mã và dịch mã tạo ARN và protein ở vi khuẩn Các chất vitamin B6, nicotinamid, acid p – aminobenzoic đều có tác dụng đối kháng với berberin

Có hiện tượng kháng thuốc xảy ra khi dùng dài ngày berberin sulfat trên các bệnh liên quan đến các chủng tụ cầu vàng, liên cầu khuẩn tán huyết, trực trùng lỵ, nhưng đối với bài thuốc có Hoàng liên như bài “Hoàng liên giải độc thang” thì không có hiện tượng kháng thuốc, ngược lại tác dụng kháng khuẩn lại mạnh hơn [7,9]

Dịch chiết nước Hoàng liên có khả năng ổn định phức hợp không bền với enzym ADN topoisomerase I ở động vật có vú Nghiên cứu cho thấy rằng

hai tiền chất epiberberin và gloenlandicin của berberin là những tiểu phân hoạt động có hoạt tính phân tách ADN qua trung gian topoisomerase I; song 2 alkaloid này lại không phân tách AND qua trung gian topoisomerase II Chỉ

có tiền chất berberrubin (alkaloid loại protoberberin) là chất đặc hiệu phân

tách ADN qua trung gian topoisomerase II in vitro

Những kết quả này cho thấy alkaloid gốc berberin là nhóm hợp chất có khả năng tạo phức không bền với topoisomerase I và II [30]

 Tác dụng kháng virus

Dịch chiết nước Hoàng liên thí nghiệm trên phôi gà có tác dụng ức chế

sự phát triển của virus cúm chủng PR8 [1]

Palmatine có trong Hoàng liên có khả năng ức chế không cạnh tranh enzym protease NS2B-NS3 của virus West Nile (WNV), với IC50 là 96 µM, không gây độc tính tế bào Hơn nữa, palmatin cũng có thể ức chế virus dengue và virus sốt vàng theo các liều lượng Hợp chất này có thể được phát triển để điều trị các nhiễm trùng do virus [21]

 Tác dụng kháng nấm, đơn bào gây bệnh

Hoàng liên có tác dụng kháng một số loài nấm gây bênh ngoài da với dịch chiết nước từ dược liệu này pha loãng 1:30 đã chứng tỏ tác dụng

Quan sát dưới kính hiển vi berberin với nồng độ 1:5000 cho chuột nhắt trắng đã được gây nhiễm amip uống với liều lượng 50 mg/kg có tác dụng ức chế sinh trưởng của amip gây bệnh

Dịch chiết Hoàng liên cho thấy tác dụng chống đơn bào Trypanosoma

cruzi gây bệnh Chagas với IC50 khá thấp là 1,7 µg/ml; và không gây độc cho

tế bào [36]

 Tác dụng trên đường tiêu hóa

Hoàng liên có tác dụng chống loét đường tiêu hóa Nghiên cứu cho chuột cống trắng uống dich chiết alkaloid của Hoàng liên có tác dụng ức chế nhẹ loét dạ dày thực nghiệm do stress Bằng đường tiêm dưới da trên chuột cống trắng berberin có tác dụng ức chế hình thành vết loét và hiện tượng chảy máu dạ dày trong mô hình gây loét do thắt môn vị [9]

Dịch chiết từ Hoàng liên có tác dụng làm tăng nhẹ sự phân tiết dịch nước bọt, dịch vị, dịch mật và tăng cường hoạt động của ruột, dạ dày từ đó kích thích tiêu hóa, có lợi cho đường tiêu hóa [4,7]

Nghiên cứu cho thấy, dịch chiết nước của thân rễ Hoàng liên có tác

dụng ức chế Helicobacter pylori (H.pylori), ngăn ngừa và phòng tránh các

bệnh liên quan đến loét dạ dày- tá tràng; có so sánh với berberin và dịch

chiết Hoàng bá (Cortex Phellodendri) Tác dụng ức chế enzym urease tiết

ra bởi H.pylori và urease của đậu jack của dịch Hoàng liên cao hơn Hoàng

bá và berberin (với giá trị IC50 nhỏ hơn hẳn) Sự ức chế không cạnh tranh

của Coptis chinensis Franch có sự tương quan nồng độ và thời gian, có khả

năng giải ức chế bằng glutathion được cho là do sự tương tác của các hợp chất trong dịch chiết với nhóm sulfhydryl của vị trí hoạt động trên enzym urease [32,51]

 Tác dụng chống viêm Coptisin, thành phần chính của Coptis chinensis Franch, đã cho thấy

khả năng ức chế mạnh sản xuất oxit nitơ (NO) bằng cách ức chế protein và các biểu hiện mARN của enzym tổng hợp oxi nitric (iNOS) trong lipopolysaccharid (LPS) kích thích các đại thực bào RAW 264.7 Coptisin cũng ức chế sản xuất các cytokin gây viêm là interleukin-1β (IL-1β) và interleukin-6 (IL-6) bằng cách ức chế sự biểu hiện mARN của cytokin; đồng thời ức chế sự thoái hoá của protein ức chế nhân tố nhân κBα (IκBα) và phosphoryl hóa yếu tố điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), và phosphoinositide 3-kinase/Akt (PI3K/Akt) Coptisin cũng ức chế sự xuất hiện của TNF-α và NO trong các mô viêm ở chuột thí nghiệm

Các kết quả này cho thấy coptisin trong Hoàng liên ức chế sự viêm LPS bằng cách ngăn chặn sự kích hoạt yết tố nhân κB, MAPK và PI3K / Akt trong các đại thực bào có tác dụng chống viêm đặc hiệu [19,45]

Dịch chiết thân rễ Coptis chinensis Franch kích hoạt tế bào MOLT-4,

Th1, MAPK giúp tăng cường miễn dịch trong viêm, đóng vai trò như các chất

bổ trợ, bổ sung để điều trị trong suy giảm hệ thống miễn dịch [20]

 Tác dụng chống oxy hóa

Dịch chiết ethanol hoa cây Hoàng liên cho thấy khả năng làm tăng lượng superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathion (GSH) trong tế bào giúp trung hòa các gốc tự do có tác dụng chống oxy hóa mạnh cả

in vitro và in vivo [46]

Jatrorrhizin chứng tỏ khả năng chống oxy hóa do độc tính của hydrogen peroxid gây ra ở tế bào não chuột thí nghiệm [39]

 Tác dụng trên tim, hạ huyết áp

Tiêm dưới da dịch chiết nước của Hoàng liên hoặc berberin trên súc vật thí nghiệm có tác dụng làm hạ huyết áp nhất thời; chế phẩm điều chế từ Hoàng liên đã loại bỏ berberin cũng có tác dụng làm hạ huyết áp trên chuột cống trắng [1]

Thành phần palmatin và coptisin trong dịch chiết Hoàng liên có tác dụng bảo vệ và giảm tổn thương tế bào cơ tim thông qua việc làm bền vững ty thể màng, giảm kích thước vùng bị nhồi máu, giải phóng malondialdehyd (MDA), tăng superoxid dismutase (SOD) [28,49,52]

 Tác dụng phòng xơ vữa động mạch, giảm béo phì

Trên thỏ thí nghiệm được nuôi bằng chế độ ăn uống có lượng cholesterol cao, dịch chiết nước Hoàng liên dùng bằng đường uống có tác dụng làm cho tỷ lệ cholesterol toàn phần/lipid trở về giá trị bình thường [4,9,24]

Berberin trong dịch chiết Hoàng liên có khả năng làm tăng sự biểu hiện của enzym adipose triglycerid lipase (ATGL) và hormone-sensitive lipase (HSL) đẩy nhanh quá trình phân giải triacylglycerol (TG) ở mô mỡ, có tác dụng đáng kể trong giảm béo phì [16,29]

Trong dịch chiết Hoàng liên chứa Jatrorrhizin hydrochlorid (JH) được nghiên cứu có khả năng ức chế hình thành lipid và tăng cường oxy hóa lipid trong gan chuột thí nghiệm [43]

 Tác dụng hạ đường huyết

Dịch chiết Hoàng liên làm giảm khả năng kháng insullin của tế bào trong mô hình chuột Wistar bị đái tháo đường týp II gây ra bởi chế độ ăn giàu chất béo và tiêm streptozotocin thông qua con đường ức chế c-Jun N terminal kinase [24,37]

Franch có tác dụng ức chế MAO (monoaminoxidase- enzym xúc tác quá trình phân hủy chất dẫn truyền thần kinh monoamin)

Jatrorrhizin ức chế không cạnh tranh MAO-A và B ở ty thể của tế bào não chuột với giá trị IC50 lần lượt là 4 và 62 µM Berberin chỉ ức chế cạnh tranh với giá trị IC50 là 126 µM Trong khi palmatin không có khả năng ức chế mặc dù nồng độ dùng là 200 µM [31,39]

Dịch chiết Hoàng liên cho thấy khả năng tăng tiết và tăng hoạt tính của

enzym tyrosin hydroxylase kích thích nơ-ron thần kinh trong mô hình in vitro

và in vivo ở bệnh Parkinson gây ra bởi MPTP

(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin)[41]

Trong mô hình gây stress oxy hóa tế bào thần kinh bằng butylhydroperoxid (t-BOOH), dịch chiết nước Hoàng liên nồng độ 100 µg/ml cho thấy khả năng tăng sự sống sót của tế bào, giảm tỷ lệ tế bào tự chết theo chương trình (apoptosis) và tăng hoạt lực của ty thể trêng màng; tác dụng bảo

tert-vệ tế bào thần kinh [40]

Hiện nay có một số nghiên cứu mới chứng minh tác dụng ức chế

enzym Acetylcholinesterase của dịch chiết toàn phần Hoàng liên in vitro cải

thiện tình trạng suy giảm trí nhớ và tiến tới điều trị bệnh Alzheimer [17,26]

 Tác dụng chống ung thư

Hoạt chất berberin phân lập từ chiết xuất Hoàng liên cho thấy tác dụng chống ung thư trên đích tác dụng ephrin-B2, ức chế tế bào khối u ZR-75-30 phát triển và dự di căn của chúng [43] Trong nghiên cứu trên tế bào ung thư

tuyến tiền liệt in vitro, berberin cho thấy tác dụng ức chế sự ra tăng tế bào ưng

thư thông qua khả năng kích thích quá trình tế bào tự chết theo chương trình apoptosis hoặc ngừng chu trình tế bào bằng cách ức chế tín hiệu của yếu tố tăng trưởng biểu bì EGFR (epidermal growth factor receptor) [50]

Trong thành phần dịch chiết Hoàng liên chứa jatrorrhizin hydrochlorid

có tác dụng chống u ác tính trên da do có khả năng ức chế tăng sinh tân mạch

máu ở tế bào u ác tính di căn ở tế bào người C8161 in vitro [35]

 Độc tính

Berberin ít độc Trên người uống một lần 2 g, chưa phát hiện có triệu chứng ngộ độc [1] Bài tiết rất nhanh, một phần qua nước tiểu, một phần bị

chuyển hóa trong cơ thể [7] Hiện chưa có nghiên cứu chứng minh độc tính của Hoàng liên chân gà lên cơ thể người

1.2 Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro

1.2.1 Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

1.2.1.1 Acetylcholin

Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ Acetylcholin tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân

và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động) Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh

Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym cholin acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong các túi Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì

sự có mặt của enzym AChE Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân

tử ACh tạo ra cholin và acid acetic Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE

sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [8,11]

Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh Trong đó, ACh được xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [33]

1.2.1.2 Enzym Acetylcholinesterase

AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa,

vị trí oxy-anion, vị trí anion và túi acyl [27] Những vị trí hoạt động này của AChE được minh họa ở hình 1.3

Hình 1.3 Các vị trí hoạt động của enzym AChE AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất Hoạt tính của

nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase (enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện

nhiệt độ và pH [23]

1.2.1.3 Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [8,27] Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer Theo giả thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và

thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [15,33]

1.2.2 Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro

Nghiên cứu sàng lọc là giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới Giai đoạn này thường tiến hành đánh giá hoạt tính của một lượng lớn các mẫu thử Vì vậy, những phương pháp được lựa chọn để sử dụng

ở giai đoạn này phải là những phương pháp có thể tiến hành đồng thời nhiều

mẫu, lượng mẫu cần ít, cho kết quả nhanh và chi phí thấp Phương pháp thử in

vitro đáp ứng được tất cả những yêu cầu đó Đối với nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là

phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

1.2.2.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác

dụng ức chế AChE in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây

dựng và ứng dụng sớm nhất Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng Trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’- dithiobis - nitrobenzoic acid (DTNB)

 Phương pháp đo quang

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym cholinesterase dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961[18,33] Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic acid màu vàng Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 412

nm

Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro khác tiếp tục được thực hiện Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công

bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều

có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng,

nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng

 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [10]

Một trong những hạn chế của phương pháp TLC là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu) Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch AChE Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được phun sau Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả

1.2.2.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử

dụng phương pháp này để sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn

chế Phương pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B (muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double)

 Phương pháp đo quang

Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công

bố lần đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K vào năm 1962 [7] Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α-naphthol Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo Hợp chất này được xác định bằng cách

đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm Tuy nhiên, sau đó, không

có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác