2.1.1.Mẫu nghiên cứu
Thân rễ phơi khô của cây Hoàng liên chân gà thu hái vào tháng 8 năm 2016 ở Hà Giang. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.1.2.Hóa chất, dung môi
- Hóa chất: AChE (mã số EC 3.1.1.7) (Sigma, Singapore) - Acetylthiocholine (ACTI) (Sigma, Singapore)
- Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) (Sigma, Singapore) - Tris-HCl và berberin clorid chuẩn (Sigma, Singapore)
- HCl (Merck).
- Dung môi: n-Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), n-Butanol, Ethanol (EtOH) (Shouguang, Trung Quốc) và nước cất; Methanol (MeOH) (Merck).
2.1.3.Máy móc, thiết bị và dụng cụ
- Hệ thống máy cô quay
- Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis (Mỹ). - Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sĩ).
- Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg.
- Dụng cụ thủy tinh: các loại cốc có mỏ dung tích 25-100 ml; bình cầu dung tích 1500 ml, pipet chính xác, bình định mức và các thiết bị dụng cụ cần thiết khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE
Phương pháp chiết xuất phân đoạn dịch chiết
Để đánh giá tác dụng ức chế AChE, đầu tiên, tiến hành chiết xuất dược liệu thân rễ Hoàng liên khô thu bằng ethanol (EtOH) được dịch EtOH chứa các thành phần alkaloid [48]. Dịch chiết này sau đó được chiết lần lượt bằng các dung môi n-Hexan, Ethyl acetat và n-Buthanol thu được các phân đoạn dịch chiết. Cô quay thu hồi cắn dược liệu để tiến hành thử hoạt tính. Quá trình chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis
Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên
Cách tiếp cận
Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu rất phổ biến hiện nay. Nguyên tắc của phương pháp như sau [18]:
Cơ chất acetylthiocholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5’- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Dựa vào xác định độ hấp thụ của mẫu thử ở 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE. Phương trình phản ứng được trình bày ở hình 2.2.
Hình 2.2. Quá trình phản ứng diễn ra trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman
Đã có nhiều nghiên cứu sàng lọc áp dụng hướng thực hiện này tuy nhiên mỗi nghiên cứu đều có những điều chỉnh phù hợp với điều kiện nghiên cứu về: Nồng độ dung dịch cơ chất ACTI, nồng độ thuốc thử DTNB, hoạt độ của AChE, thời gian ủ,…
Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro
Tiến hành pha đệm natri phosphat pH = 8, pha enzym dạng đông khô trong đệm tris-HCl, mẫu thử, mẫu chứng được nồng độ thí nghiệm.
Quy trình thực nghiệm tiến hành như sau:
Cách pha đệm natri phosphat pH=8
- Dung dịch mononatri orthophosphat 0,2M: 27,8g NaH2PO4 trong 500ml nước cất (dung dịch a).
- Dung dịch dinatri hydropphosphat 0,2M: 53,05g Na2HPO4 .7H2O trong 500ml nước cất (dung dịch b).
- Lấy 26,5 ml dung dịch a, 437,5 ml dung dịch b và 500ml nước cất định mức trong bình định mức 1000ml.
- Kiểm tra lại pH của đệm bằng máy đo pH và điều chỉnh pH bằng dung dịch chuẩn HCl hoặc NaOH 1M.
Cách pha enzym AChE, cơ chất, thuốc thử.
- Enzym: Cân chính xác 1mg bột AChE (mã số EC 3.1.1.7) tương ứng với 265 đơn vị (265 IU) pha trong 53 ml dung dịch đệm tris-HCl tạo thành dung dịch 5 IU/ml, từ dung dịch này pha loãng 20 lần thu được dung dịch enzym nồng độ 0,25 IU/ml sử dụng cho phương pháp đo quang.
- Cơ chất: cân 0,1446g acetylthiocholin iodid (ACTI) pha trong 25ml nước cất tạo thành dung dịch có nồng độ 20mM, từ dung dịch đó pha loãng 8 lần thu được dung dịch cơ chất có nồng độ 2,5 mM.
- Thuốc thử: Cân 0,1982g thuốc thử DTNB pha trong 25ml dung dịch đệm phosphat tạo thành dung dịch có nồng độ 20 mM, pha loãng dung dịch này 8 lần thu được dung dịch thuốc thử nồng độ 2,5 mM.
Cách pha các dải nồng độ dung dịch mẫu thử và mẫu đối chứng
- Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác 10mg cắn của 4 phân đoạn dịch chiết EtOH, n-Hexan, EtOAc và n-BuOH của Hoàng liên chân gà như đã chuẩn bị trong mục chiết xuất (3.1), hòa tan hoàn toàn trong 10ml MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml. Từ dung dịch có nồng độ 1mg/ml pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 500µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,625 µg/ml; và 7,8125 µg/ml.
- Dung dịch đối chứng: Cân chính xác 1 mg berberin clorid hòa tan trong 2ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 500 µg/ml; từ dung dịch này pha loãng thành các nồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0,1 µg/ml và 0,05 µg/ml.
Cách tiến hành
Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm natri phosphat pH=8, dung dịch mẫu thử hoặc mẫu chứng và dung dịch enzym vào cuvet 1 cm. Hỗn hợp các dung dịch này được trộn đều và ủ ở 250C trong 15 phút. Sau đó, dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ACTI lần lượt được thêm vào hỗn hợp và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 250C, sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412nm. Mỗi thử nghiệm được lặp đi lặp lại 3 lần. Quy trình thử nghiệm được tóm tắt ở hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro
Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức: %I = Ac - At
Ac - Ao × 100
Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế
Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (không chứa 100µl dung dịch thử)
At: độ hấp thu của mẫu thử
Ao: độ hấp thu của mẫu trắng (1000 µL dung dịch đệm natri phosphat)
Từ giá trị I% xác định được, tiến hành tính giá trị IC50 (nồng độ của mẫu ức chế 50% hoạt tính enzym) của từng mẫu thử như sau:
- Pha 1 dãy nồng độ của mẫu thử, xác định I% của từng nồng độ mẫu thử đó.
- Với những mẫu thử có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị I% và nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.x + b, trong đó, y là giá trị % tác dụng ức chế enzym và x là nồng độ mẫu thử.
- Với những mẫu không có sự tương quan tuyến tính giữa I% và nồng độ, tiến hành xây dựng đường hồi quy tuyến tính y = a.log(x) + b.
- Thay giá trị y = 50% vào phương trình tuyến tính mới xây dựng được từ đó tính được giá trị của nồng độ x. Giá trị tìm được này chính là giá trị IC50.
Để có cơ sở đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, berberin clorid được sử dụng làm mẫu chứng dương. Hợp chất này đã được nghiên cứu và chứng minh tác dụng ức chế AChE khá mạnh được sử dụng làm mẫu chứng dương trong nhiều nghiên cứu [17,26].
2.2.2.Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE
Từ mẫu cắn đã được lựa chọn trên kết quả khảo sát trước về tác dụng ức chế AChE in vtro, tiếp tục tiến hành đánh giá động học ức chế AChE với phân đoạn dịch chiết này ở các nồng độ gần sát giá trị nồng độ ức chế IC50 để nghiên cứu động học ức chế.
Cách pha nồng độ mẫu thử
Cân chính xác 1mg cắn n-BuOH của dịch chiết Hoàng liên chân gà hòa tan trong 1 ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml.
Dung dịch này được dùng để pha loãng thành các dung dịch thử có nồng độ 5 µg/ml; 10 µg/ml; và 15 µg/ml.
Cách pha nồng độ cơ chất
Cân chính xác 9,90 mg ACTI (M = 289,18) pha trong 1370 ml nước cất; thu được dung dịch cơ chất nồng độ 25 mM.
Từ dung dịch này tiến hành pha loãng thành các dung dịch cơ chất có nồng độ 5 µg/ml; 2,5 µg/ml; và 1,25 µg/ml để tiến hành nghiên cứu.
- Mẫu có nồng độ ức chế AChE IC50 thấp nhất sẽ được tiếp tục pha thêm dải nồng độ gần với nồng độ IC50 đo được để tiếp tục đánh giá.
- Dung dịch cơ chất ACTI cũng được pha thành các nồng độ khác nhau để khảo sát.
- Tiến hành phản ứng như trên với từng nồng độ mẫu thử và nồng độ cơ chất ACTI đã pha. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym.
- Hằng số ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết IC50 nhỏ nhất] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon - Dixon plot).
Quá trình tiến hành thí nghiệm được tóm tắt trong hình 2.4.
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu thực nghiệm được tổng hợp và xử lý bằng phương pháp thống kê thường dùng trong sinh học với sự trợ giúp của phần mềm SigmaPlot 12 (Systat Software Inc, Mỹ).
- Kết quả nghiên cứu được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn, ký hiệu: ± SD. Trong đó, độ lệch chuẩn (SD) được tính theo công thức:
- Độ lặp lại của thí nghiệm được đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và được tính như sau:
- So sánh giá trị trung bình giữa các mẫu thử sử dụng phép thử t- student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE
Thân rễ khô Hoàng liên được rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50oC, thái nhỏ. 50 gam dược liệu (hàm ẩm 10%) được chiết với 500ml dung môi EtOH 90o
bằng phương pháp siêu âm ngấm kiệt; chiết lặp lại 3 lần. Gộp dịch chiết và lọc qua giấy lọc; tiến hành cô quay chân không dịch chiết trong bình cầu 1,5 lít và thu được 9 g cắn ethanol.
Hòa cắn với khoảng 100 ml nước cất ấm rồi khuấy đều. Thêm khoảng 100ml dung môi n-Hexan, khuấy đều hỗn hợp trong phễu trong thời gian 20 phút. Để yên cho dung môi phân lớp. Gạn lấy lớp dung môi n-Hexan. Lớp nước trong bình được thêm tiếp 100ml n-Hexan. Tiến hành lặp lại 3 lần. Sau đó thu dịch chiết n-Hexan tiến hành cô quay thu cắn.
Tiếp theo, tiến hành lần lượt tương tự với dung môi Ethyl acetat (EtOAc) và n-BuOH. Mỗi dung môi 100 ml lặp lại 3 lần.
Cắn từ dịch chiết n-Hexan 2,3 (g); EtOAc 3,2 (g); n-BuOH 3,5 (g) được bảo quản để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.
Lựa chọn điều kiện thích hợp cho phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro như sau:
Thành phần hỗn hợp phản ứng được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần hỗn hợp phản ứng STT Thành phần Mẫu thử (µl) Mẫu trắng của mẫu thử (µl) Mẫu chứng dương (µl) Mẫu trắng của mẫu chứng dương (µl) 1 Đệm natri phosphat pH=8 700 800 700 800 2 Mẫu thử 100 100 0 0 3 Berberin clorid 0 0 100 100 4 AChE 0,25 IU/ml 100 0 100 0 5 DTNB 2,5 mM 50 50 50 50 6 ACTI 2,5 mM 50 50 50 50 Tổng thể tích (µl) 1000 1000 1000 1000
Tiến hành đo quang theo phương pháp đo quang Ellman
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphate (pH = 8,0); 100 µl dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,25 IU/ml. Trộn đều trong cuvet 1 cm và đem ủ 15 phút tại 25
0
C. Các dịch chiết được thử và chất chuẩn dương (Berberin chlorid) được hòa tan trong methanol. Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2,5 mM và 50 µl ACTI 2,5 mM và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 25 0C. Sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE
Kết quả tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà và berberin clorid được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.1, hình 3.2.
Bảng 3.2. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên chân gà và Berberin clorid Mẫu thử IC50 (µg/ml) EtOH 15,62 ± 0,26 n- hexan 57,86 ± 0,86 EtOAc 105,83 ± 1,95 n-BuOH 10,44 ± 0,16 Berberin clorid 0,282 ± 0,03
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên chân gà
Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết được tính dựa vào đồ thị và chuyển từ log [µg/ml] sang µg/ml.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế hoạt độ enzym AChE của Berberin clorid
Giá trị IC50 Berberin clorid được tính dựa vào đồ thị và chuyển từ log [µg/ml] sang µg/ml. 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0 20 40 60 80 100 n-hexan EtOAc n-BuOH EtOH % Ức ch ế AC hE Log (Nồng độ) (μg/ml) -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 % Ức chế AChE Log (Nồng độ) (µg/mL) • Berberin clorid
Nhận xét:
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy tất cả 4 mẫu cắn đều có tác dụng ức chế AChE ở mức độ khác nhau. Tác dụng ức chế AChE của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ. Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp nhất với IC50 là 105,83 ± 1,95 µg/ml và hoạt tính này còn yếu hơn cả hoạt tính của mẫu căn toàn phần trong EtOH. Phân đoạn dịch chiết n- BuOH và dịch chiết tổng EtOH cho thấy có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất với IC50 là 10,44 ± 0,16 và 15,62 ± 0,26 µg/ml. Tiếp đó là phân đoạn n- Hexan có tác dụng ức chế enzym AChE với IC50 là 57,86 ± 0,86 µg/ml. Tuy nhiên, hoạt tính của 2 phân đoạn n-BuOH và EtOH vẫn còn yếu hơn hoạt tính của chuẩn dương berberin clorid với giá trị IC50 là 0,282 ± 0,03 µg/ml. Với tác dụng ức chế mạnh nhất AChE ở nồng độ thấp, phân đoạn dịch chiết n-BuOH được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu động học.
Hình 3.1 và 3.2 thể hiện mối tương quan giữa giá trị Log của nồng độ mẫu thử và Berberin clorid so với phần trăm tác dụng ức chế enzym AChE.
3.2. Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE
Tiến hành đánh giá động học ức chế AchE
Động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dịch chiết n-BuOH được tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây với một chút thay đổi cho phù hợp với phòng thí nghiệm. Hỗn hợp phản ứng gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphat (pH 8,0); 100 µl dung dịch thử ở các nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH (0; 5 ; 10 và 15 μg/ml) và 100 µl dung dịch enzym AChE 0,25 IU/ml. Trộn đều và đem ủ 15 phút tại 25oC. Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2.5 mM và 50 µl với các nồng độ khác nhau của cơ chất ACTI (5; 2,5; 1,25 mM) và trộn đều. Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch được ở bước sóng 412 nm trong vòng 5 phút. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk plot) để xác định kiểu động học ức chế enzym. Hằng số ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon plot).
Kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro
Đồ thị Lineweaver–Burk mô tả động học ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết n-BuOH. Hình 3.3 cho thấy kiểu ức chế là kiểu ức chế hỗn hợp
(trong đồ thị Lineweaver–Burk thì hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km). Hằng số Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục