Acetylcholinesterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)
Về kết quả chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên
Trong nghiên cứu khóa luận này, dược liệu Hoàng liên chân gà được chiết xuất bằng dung môi EtOH rồi tiếp tục chiết phân đoạn với các dung môi n-Hexan, EtOAc và n-BuOH. Các dịch chiết phân đoạn được cô thành cắn
(EtOH 9 g; n-Hexan 2,3 g; EtOAc 3,2 g và n-BuOH 3,5 g) được dùng để đánh giá các tác dụng trên enzym AChE in vitro.
Về phương pháp đánh giá sàng lọc in vitro
Phương pháp in vitro được lựa chọn bởi ưu điểm của nó là cho kết quả nhanh, tiến hành đồng thời được nhiều mẫu và ít tốn kém. Đồng thời, qua thu thập tài liệu cho thấy, hầu hết các nghiên cứu liên quan ức chế AChE đều sử dụng phương pháp đo quang của Ellman với cách tiến hành và đòi hỏi điều kiẹn phòng thí nghiệm đơn giản, cho kết quả đáng tin cậy hơn các phương pháp Fast Blue B. Vì vây, nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng phương pháp đo quang Ellman để đánh giá với sự thay đổi một và yếu tố để phù hợp hơn với điều kiện nghiên cứu.
Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE
Đánh giá tác dụng ức chế của 4 dịch chiết phân đoạn của Hoàng liên chân gà cho thấy tất cả các phân đoạn dịch chiết này đều thể hiện tác dụng ức chế enzym AChE, kết quả này phù hợp với kết quả một số nghiên cứu trước đây của Hengqiang Zhaoa và cộng sự [26]; và Dorothea Kaufmann và cộng sự [17]. Tuy nhiên, mức độ ức chế của các phân đoạn dịch chiết rất khác nhau với các giá trị IC50 thay đổi từ 10,44-105,83 µg/ml. So với chất đối chứng dương là berberin clorid, tác dụng ức chế của 4 phân đoạn dịch chiết yếu hơn khoảng từ 37-375 lần. Trong các phân đoạn dịch chiết nghiên cứu đánh giá, phân đoạn dịch chiết n-Butanol cho thấy tác dụng ức chế mạnh nhất; phân đoạn dịch chiết Ethyl acetat cho tác dụng ức chế yếu nhất. Phân đoạn n- BuOH của dịch chiết Hoàng liên được sử dụng để đánh giá đặc điểm động học ức chế tiếp theo.
3.3.2. Về kết quả đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym Acetylcholinesterase của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên.
Động học ức chế enzym AChE của dịch chiết từ Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) chưa từng được công bố trước đây. Động học ức chế enzym AChE thể hiện qua đồ thị Lineweaver–Burk cho thấy hệ số góc = Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km. Giá trị Ki được xác định theo đồ thị là giá trị tuyệt đối từ điểm giao trên trục Ox của 3 đường trên đồ thị Dixon, được vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH xác định được là 8,36 ± 0,05 µg/ml.
Từ đồ thị cho thấy, kiểu ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế đặc trưng của dược liệu, vì dược liệu có chứa các hợp chất có nhiều con đường tác dụng khác nhau [25]. Cơ chế ức chế cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH có thể cạnh tranh với ACTI để gắn vào vị trí liên kết cơ chất của AChE hoặc có thể liên kết vào vị trí khác vị trí liên kết cơ chất của AChE. Điều này được khẳng định khi quan sát trên đồ thị thấy giá trị Kmax tăng và Vmax giảm khi nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH tăng.
Mặc dù kết quả nghiên cứu của khóa luận không tìm ra được hợp chất nào sở hữu tác dụng ức chế AChE của từng phân đoạn dịch chiết, tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành đánh giá tác dụng ức chế AChE của cả 4 phân đoạn dịch chiết EtOH; n-Hexan; EtOAC và n-BuOH của Hoàng liên chân gà. Đồng thời, đặc điểm động học ức chế AChE cũng được nghiên cứu chỉ ra kiểu ức chế hỗn hợp của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên. Vì vậy, kết quả của khóa luận cũng đã góp phần bổ sung những thông tin cho cơ sở dữ liệu về những loại cây có tác dụng ức chế AChE nói chung. Cơ sở dữ liệu này là căn cứ cho những nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất tinh khiết có tác dụng đặc hiệu ức chế AChE của Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) ứng dụng trong hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh về thần kinh trong tương lai.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN
Nghiên cứu này đã thu được những kết quả như sau:
- Đã chiết xuất phân lập được các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch): EtOH, n-Hexan, EtOAc và n-BuOH.
- Đã đánh giá được tác dụng ức chế AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên:
+ Phương pháp đo quang Ellman được sử dụng
+ Các phân đoạn dịch chiết được khảo sát ở các nồng độ 1000 µg/ml; 500µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,625 µg/ml; và 7,8125 µg/ml có so sánh đối chứng với mẫu berberin clorid chuẩn.
+ Phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho tác dụng ức chế mạnh nhất với IC50 là 10,44 ± 0,16 µg/ml.
- Đã đánh giá được đặc điểm động học ức chế AChE của phân đoạn dịch chiết n-BuOH của Hoàng liên chân gà.
+ Kiểu ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết Hoàng liên là kiểu ức chế hỗn hợp với hằng số Ki tìm được là 8,36 ± 0,05 µg/ml.
ĐỀ XUẤT
- Tiếp tục nghiên cứu tinh chế các hợp chất tinh khiết trong các phân đoạn dịch chiết của Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch).
- Thử tác dụng ức chế AChE của các chất phân lập được.
- Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE của Hoàng liên in vivo và nghiên cứu lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Phạm Thị Phương Anh (2001), “Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp chế biến vị thuốc Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) đến thành phần hóa học và tác dụng sinh học”, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2. Bộ Khoa học và Công nghệ (1996), Sách Đỏ Việt Nam. Phần thực vật
(Red data book of Việt Nam volum 2 plants), NXB Khoa Học Kĩ
Thuật,100.
3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam, NXB Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học,565. 5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam tập 1, NXB Trẻ,325. 6. Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất bản Y học.
7. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,189.
8. Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học, NXB Giáo dục Việt Nam,(1):69-71.
9. Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kĩ Thuật,497.
TIẾNG ANH
10. Adsersen A., Gauguin B. và Gudiksen L. et al (2006), “Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for Acetylcholinesterase inhibitory activity”, Journal of
ethnopharmacology, 104:418-422.
11. Alzheimer's A. (2012), "2012 Alzheimer’s disease facts and figures",
Alzheimer's & Dementia, 8(2): 131-168.
12. Chen L, Wang L, Zhang Q, Zhang S, Ye W (2012), “Non-alkaloid chemical constituents from Coptis chinensis”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, May;37(9):1241-4.
13. Cullar Mj, Giner R.M et al (2001), “Topical anti inflammatory activity of some Asian medical plants used in dermatological disorders”,
14. Department of pharmacy, National University of Singapore (1993), “Displacement of bilirubin from albumin by berberin”, Biol-Neonate, 63(4):201-8.
15. Di Giovanni S., Borloz A. và Urbain A. et al (2008), “In vitro screening assays to identify natural or synthetic Acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods”, European
journal of pharmaceutical sciences, 33:109-119.
16. Dongqing Jiang, Dianhui Wang, Xianghua Zhuang, Zhanqing Wang, Yihong Ni, Shihong Chen, Fudun Sun (2016), “Berberine increases adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes through the AMPK pathway”, Lipids in Health and Disease, Dec 9;15(1):214.
17. Dorothea Kaufmann, Anudeep Kaur Dogra, Ahmad Tahrani, Florian Herrmann, Michael Wink (2016), “Extracts from Traditional Chinese Medicinal Plants Inhibit Acetylcholinesterase, A Known Alzheimer’s Disease Target”, Molecules, Aug 31;21(9).
18. Ellman G. L., Courtney K. D., Andres V. et al (1961), “A new and rapid colorimetric determination of Acetylcholinesterase activity”,
Biochemical pharmacology,(7):88-95.
19. Enhui Cui, Xiaoyan Zhi, Ying Chen, Yuanyuan Gao, Yunpeng Fan, Weimin Zhang, Wuren Ma, Weifeng Hou, Chao Guo, and Xiaoping Song (2014), “Coptis chinensis and Myrobalan (Terminalia chebula) Can Synergistically Inhibit Inflammatory Response In Vitro and In
Vivo”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,
2014:510157.
20. Eunhee Kim, Sejin Ahn, Hae-ik Rhee, Deug-chan Lee (2016), “Coptis
chinensis Franch. extract up-regulate type I helper T-cell cytokine through MAPK activation in MOLT-4 T cell”, Journal of
Ethnopharmacology, Aug 2;189:126-31.
21. Fan Jia, Gang Zou, Jingjing Fan, Zhiming Yuan (2010), “Indentification of palmatine as an inhibitor of West Nile virus”, Archives of Virology, Aug; 155(8):1325-9.
22. Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK. (1999), "The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress",
Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66(2): 137-147.
23. George T Grossberg (2003), “Cholinesterase Inhibitors for the Treatment of Alzheimer’s Disease: Getting On and Staying On”, Current
Therapeutic Research, 64:216-235.
24. Hang Ma, Yinran Hu, Zongyao Zou, Min Feng, Xiaoli Ye, Xuegang Li (2016), “Antihyperglycemia and Antihyperlipidemia Effect of Protoberberine Alkaloids From Rhizoma Coptidis in HepG2 Cell and Diabetic KK-Ay Mice”, Drug Development Research, Jun;77(4):163-70. 25. Hawkins, K.I. and C.E. Knittle (1972), "Comparison of Acetylcholinesterase determinations by the Michel and Ellman methods". Analytical chemistry 44(2): p. 416-417. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
26. Hengqiang Zhaoa, , Siduo Zhoua, Minmin Zhang, Jinhong Feng, Shanshan Wang, Daijie Wang, Yanling Geng, Xiao Wang (2016), “An
in vitro AChE inhibition assay combined with UF-HPLC-ESI-Q-
TOF/MS approach for screening and characterizing of AChE inhibitors from roots of Coptis chinensis Franch”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Feb 20;120:235-40.
27. H. P. J., Ren Y. và Howes M. J. (2005,) “Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi” Natural product report.
28. Hui-Li Tan, Kok-Gan Chan, Priyia Pusparajah, Acharaporn Duangjai et al (2016), “Rhizoma Coptidis: A Potential Cardiovascular Protective Agent”, Frontiers on Pharmacology, Oct 7;7:362.
29. Jae Sue Choi, Ji-Hye Kim, Md. Yousof Ali, Hee Jin Jung, Byung-Sun Min, Ran Joo Choi, Gun-Do Kim, Hyun Ah Jun (2015), “Anti- adipogenic effect of epiberberine is mediated by regulation of the Raf/MEK1/2/ERK1/2 and AMPKα/Akt pathways”, Archives of
Pharmacal Research, Dec;38(12):2153-62.
30. Kobayashi Y, Yamashita Y et al (1995), “Inhibitors of DNA topoisomerase I and II isolated from the Coptis rhizome”, Planta Med., Oct; 61(5):414-8.
31. Kong LD, Cheng CH, Tan RX (2001), “Monoamine oxidase inhibitors from rhizoma of Coptis chinensis”, Planta Med., Feb;67(1):74-6.
32. Li C, Xie J et al (2016), “Comparison of Helicobacter pylori Urease Inhibition by Rhizoma Coptidis, Cortex Phellodendri and Berberin: Mechanisms of Interaction with the Sulfhydyl Group”, Planta Med., Mar;82(4):305-11.
33. Liang Peng, Zhengxing Rong, Hao Wang, Biyun Shao, Lei Kang, Hong Qi, Hongzhuan Chen (2017), “A novel assay to determine Acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer's disease”, Biomedical Chromatography, Mar 10.
34. Ma X., Tan C. và Zhu D. et al (2007), “Huperzine A from Huperzia species - An ethnopharmacological review”, Journal of
ethnopharmacology, 113.
35. Ruifang Liu, Zhifei Cao et al (2013), “Jatrorrhizine hydrochloride inhibits the proliferation and neovascularization of C8161 metastatic melanoma cells”, Anticancer Drugs, Aug;24(7):667-76.
36. Schinella GR et al (2002), “Inhibition of Trypanosoma cruzi growth by medical plant extracts”, Dec;73(7-8):569-75.
37. Shuang Jiang, Yahong Wang, Dayong Ren et al (2015), “Antidiabetic mechanism of Coptis chinensis polysaccharide through its antioxidant property involving the JNK pathway”, Pharmaceutical Biology, Jun;53(7):1022-9.
38. Tang Z. M., Wang Z. Y, Kang J. W. (2007), “Screening of Acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophortically mediated microanalysis techique”, Electrophoresis, (28):360-365.
39. Tao Luo, Xiuyin Shen, Sheng Li, Ting Ouyang, Huaqiao Wang (2016), “The Protective Effect of Jatrorrhizine against Oxidative Stress in Primary Rat Cortical Neurons”, CNS & Neurological Disorders - Drug
Targets, Jun 10.
40. Thomas Friedmann, Bejamin Otto et al (2014), “Coptis chinensis
human neuroblastoma cells”, Journal of Ethnopharmacology, Aug 8;155(1):607-15.
41. Thomas Friedmann, Yue Ying, Weigang Wang (2016), “Neuroprotective Effect of Coptis chinensis in MPP+ and MPTP-Induced Parkison’s Disease Models”,The American Journal of Chinese Medicine, 44(5):907- 25.
42. Van Asperen K. (1962), “A study of housefly esterase by means of a sensitive colorimetric method”. J. Ins. Physiol, 8, 401-416.
43. Weina Ma, Man Zhu, Dongdong Zhang, Liu Yang, Tianfeng Yang, Xin Li, Yanmin Zhang (2017), “Berberine inhibits the proliferation and migration of breast cancer ZR-75-30 cells by targeting Ephrin-B2”,
Phytomedicine, Feb 15; 25:45-51.
44. Weiwei Yang, Liping She, Kun Yu, Shan Yan, Xuefeng Zhang, Xiaoyi Tian, Shuren Ma, Xiwen Zhang (2016), “Jatrorrhizine hydrochloride attenuates hyperlipidemia in a high-fat diet-induced obesity mouse model”, Molecular Medicine Reports, Oct;14(4):3277-84.
45. Wu J, Zhang H, Hu B et al (2016), “Coptisine from Coptis chinensis
inhibits production of inflammatory mediators in lipolysaccharide- stimulated RAW 264.7 murine macrophage cells”, European Journal of
Pharmacology, Jun 5;780:106-14.
46. Xiaoquan Ban, Bo Huang, Jingsheng He et al (2011), “In vitro and In vivo Antioxidant Properties of Extracts from Coptis chinensis (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Inflorescence”, Plant Foods of Human Nutrition, Jun;66(2):175-80. 47. Xiumei Lv, Yan Li, Ce Tang, Yi Zhang, Jing Zhang & Gang Fan (2016),
“Integration of HPLC-based fingerprint and quantitative analyses for differentiating botanical species and geographical growing origins of
Rhizoma Coptidis”, Pharmaceutical Biology, Dec;54(12):3264-3271.
48. Yanfang Yang, Jingling Peng et al (2017), “Determination of Alkaloid Contents in Various Tissues of Coptis Chinensis Franch. By Reversed Phase-High Performance Lipuid Chromatography and Ultraviolet Spectrophotometry”, Journal of Chromatographic Science, 55(5):556- 563.
49. Yuan Yue, Lili Dou, Xin Wang, Hui Xue, Yanhong Song, Xiaoni Li (2015), “Screening β1AR inhibitors by cell membrane chromatography and offline UPLC/MS method for protecting myocardial ischemia”,
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Nov 10;115:339-
44.
50. Zheng‑Hua Huang, Hong‑Fang Zheng, Wei‑Lu Wang, Yong Wang,
Long‑Fei Zhong, Jiu‑ Long Wu, Qiao‑Xing Li (2014), “Berberine targets epidermal growth factor receptor signaling to suppress prostate cancer proliferation in vitro”, Molecular Medicine Reports, Mar;11(3):2125-8.
51. Zhou JT, Li CL, Tan LH, Xu YF, Liu YH, Mo ZZ, Dou YX, Su R, Su ZR, Huang P, Xie JH (2017), “Inhibition of Helicobacter pylori and Its Associated Urease by Palmatine: Investigation on the Potential Mechanism”, PloS One, Jan 3;12(1):0168944.
52. Zhu Qin-Wei, Li Yong-Guang (2016), “Berberine attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by suppressing the activation of PI3K/AKT signaling”, Experimental and Therapeutic Medicine, Mar;11(3):978-984.