Từ mẫu cắn đã được lựa chọn trên kết quả khảo sát trước về tác dụng ức chế AChE in vtro, tiếp tục tiến hành đánh giá động học ức chế AChE với phân đoạn dịch chiết này ở các nồng độ gần sát giá trị nồng độ ức chế IC50 để nghiên cứu động học ức chế.
Cách pha nồng độ mẫu thử
Cân chính xác 1mg cắn n-BuOH của dịch chiết Hoàng liên chân gà hòa tan trong 1 ml dung dịch MeOH thu được dung dịch có nồng độ 1 mg/ml.
Dung dịch này được dùng để pha loãng thành các dung dịch thử có nồng độ 5 µg/ml; 10 µg/ml; và 15 µg/ml.
Cách pha nồng độ cơ chất
Cân chính xác 9,90 mg ACTI (M = 289,18) pha trong 1370 ml nước cất; thu được dung dịch cơ chất nồng độ 25 mM.
Từ dung dịch này tiến hành pha loãng thành các dung dịch cơ chất có nồng độ 5 µg/ml; 2,5 µg/ml; và 1,25 µg/ml để tiến hành nghiên cứu.
- Mẫu có nồng độ ức chế AChE IC50 thấp nhất sẽ được tiếp tục pha thêm dải nồng độ gần với nồng độ IC50 đo được để tiếp tục đánh giá.
- Dung dịch cơ chất ACTI cũng được pha thành các nồng độ khác nhau để khảo sát.
- Tiến hành phản ứng như trên với từng nồng độ mẫu thử và nồng độ cơ chất ACTI đã pha. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym.
- Hằng số ức chế Ki được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết IC50 nhỏ nhất] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon - Dixon plot).
Quá trình tiến hành thí nghiệm được tóm tắt trong hình 2.4.
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro