Đánh giá tác dụng ức chế Enzym Acetylcholinesterase In Vitro của các phân đoạn dịch chiết hoàng liên (Coptis Chinensis Franch)

Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN BÍCH HẠNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN (COPTIS CHINENSIS FRANCH) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN BÍCH HẠNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN (COPTIS CHINENSIS FRANCH) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2012.Y Người hướng dẫn: TS BÙI THANH TÙNG HÀ NỘI - 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy cô bạn Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn TS Bùi Thanh Tùng – giảng viên môn Dược lý – Dược lâm sàng Khoa Y Dược - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội tận tình bảo, hướng dẫn giúp đỡ suốt trình thực hoàn thành nghiên cứu Trong trình thực khóa luận, nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Khoa Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y dược tạo điều kiện tốt sở vật chất, dụng cụ phòng thí nghiệm cho thực tốt đề tài nghiên cứu Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới toàn thầy cô môn Dược lý – Dược lâm sàng toàn thể thầy cô Khoa Y Dược giúp đỡ, trang bị cho nhiều điều bổ ích thực hành trang quý báu giúp thêm vững bước đường tới Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đặc biệt ý nghĩa tới ông bà, bố mẹ, người thân bạn bè bảo, động viên, chia sẻ, sát cánh bên để vượt qua khó khăn trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Bích Hạnh Footer Page of 116 Header Page of 116 A ACh AChE ACTI BuOH CV DTNB EtOAc EtOH HCl HPLC IC50 IU MeOH NXB pH RSD SD STT TCL UV Footer Page of 116 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Độ hấp thụ (Absorbance) Acetylcholin Enzym actylcholinesterase Acetylthiocholine iodid Butanol Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic Ethyl acetat Ethanol Acid hydro clorid Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) Đơn vị quốc tế (International Unit) Methanol Nhà xuất Chỉ số đo hoạt động ion hidro (Hydrogen power) Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Số thứ tự Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Giá trị trung bình Tia tử ngoại (Ultraviolet) Header Page of 116 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng Bảng 3.2 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên chân gà Berberin clorid Footer Page of 116 Trang 27 28 Header Page of 116 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) Hình 1.2 Công thức cấu tạo số chất thân rễ Hoàng liên .7 Hình 1.3 Các vị trí hoạt động enzym AChE 14 Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn dược liệu Hoàng liên 20 Hình 2.2 Quá trình phản ứng diễn phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 21 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế AChE in vitro 23 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro 25 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà 29 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE Berberin clorid 29 Hình 3.3 Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH 31 Hình 3.4 Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định số ức chế Ki 31 Footer Page of 116 Header Page of 116 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) – Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Phân bố, trồng trọt thu hái 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 13 1.2.1 Acetylcholin, enzym Acetylcholinesterase giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer 13 1.2.2 Một số phương pháp thường dùng nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro 15 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên vật liệu 19 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 19 2.1.2 Hóa chất, dung môi 19 2.1.3 Máy móc, thiết bị dụng cụ 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 19 2.2.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE 24 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25 Footer Page of 116 Header Page of 116 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Kết đánh giá tác dụng ức chế AChE 27 3.2 Kết đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE 30 3.3 Bàn luận 32 3.3.1 Về kết đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32 3.3.2 Về kết đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym Acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết Hoàng liên 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Footer Page of 116 Header Page of 116 MỞ ĐẦU Cuộc sống đại ngày phát triển với gia tăng bệnh suy giảm trí nhớ - đặc biệt Alzheimer không người cao tuổi mà chí người trẻ tuổi mắc phải Năm 2012, Tổ chức y tế giới cảnh báo mối lo ngại bệnh gây đưa bệnh Alzheimer vào vấn đề sức khỏe cộng đồng cần ưu tiên [11] Nghiên cứu cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, thống kê châu Á có khoảng gần 13 triệu người mắc bệnh Alzheimer, dự đoán đến năm 2050 số tăng lên đến 62,8 triệu người Việt Nam có khoảng triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng điển hình Alzheimer Đây coi bệnh nặng nhóm bệnh sa sút trí tuệ, mối quan tâm hàng đầu nhà lão khoa toàn giới nước ta tuổi thọ trung bình ngày cao, số người mắc bệnh ngày nhiều [6] Bệnh nhân bị Alzheimer bị giảm khả xét đoán, định hướng không gian thời gian, ngôn ngữ, tư nhận thức hành động ảnh hưởng nặng nề đến chức chất lượng sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình xã hội Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm thuốc ức chế cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D – Aspartat, thuốc tăng cường hoạt tính serotonin Ba nhóm thuốc đa số thuốc tân dược, giá thành tương đối cao có nhiều tác dụng phụ không mong muốn Do nhu cầu nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ điều trị Alzheimer cần thiết Acetylcholinesterase (AChE) enzym có mặt khe synap hệ thần kinh trung ương có vai trò trì ổn định nồng độ chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin [8] Với việc Whitehouse lần đưa giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer vào năm 1982, AChE xác định đích phân tử bệnh Trên sở đó, vài phương pháp thử in vitro xây dựng Trong đó, phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman sử dụng phổ biến nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro Đây hướng quan trọng nhận nhiều quan tâm nhà khoa học Footer Page of 116 Header Page 10 of 116 giới nước, đặc biệt thuốc có nguồn gốc dược liệu [27,34] Theo Y học cổ truyền Trung Quốc, Hoàng liên thân rễ phơi khô nhiều loại Hoàng liên chân gà như: Coptis chinensis Franch, Coptis teeta Wall, Coptis teetoides C.Y Cheng, Coptis deltoidea C.Y Cheng et Hsisao, Coptis quinquesecta… thuộc họ Hoàng liên – Ranunculaceae biết đến với nhiều công dụng kháng khuẩn, chống virus, chống viêm Ở Việt Nam, Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) dùng phổ biến thuốc với nhiều tác dụng tốt Gần đây, số nghiên cứu cho thấy hợp chất berberin số alkaloid chiết xuất từ dược liệu có tiềm ức chế enzym AChE cao mở hướng điều trị bệnh Alzheimer Nhận thấy, dịch chiết Hoàng liên có chứa lượng lớn alkaloid đặc biệt berberin có tiềm lớn nghiên cứu phát triển thuốc từ dược liệu để phòng điều trị bệnh thần kinh, suy giảm trí nhớ Alzheimer Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)” với mục tiêu: Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) Mục tiêu 2: Đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Footer Page 10 of 116 Header Page 35 of 116 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết đánh giá tác dụng ức chế AChE Thân rễ khô Hoàng liên rửa sạch, phơi sấy khô 50oC, thái nhỏ 50 gam dược liệu (hàm ẩm 10%) chiết với 500ml dung môi EtOH 90o phương pháp siêu âm ngấm kiệt; chiết lặp lại lần Gộp dịch chiết lọc qua giấy lọc; tiến hành cô quay chân không dịch chiết bình cầu 1,5 lít thu g cắn ethanol Hòa cắn với khoảng 100 ml nước cất ấm khuấy Thêm khoảng 100ml dung môi n-Hexan, khuấy hỗn hợp phễu thời gian 20 phút Để yên cho dung môi phân lớp Gạn lấy lớp dung môi n-Hexan Lớp nước bình thêm tiếp 100ml n-Hexan Tiến hành lặp lại lần Sau thu dịch chiết n-Hexan tiến hành cô quay thu cắn Tiếp theo, tiến hành tương tự với dung môi Ethyl acetat (EtOAc) n-BuOH Mỗi dung môi 100 ml lặp lại lần Cắn từ dịch chiết n-Hexan 2,3 (g); EtOAc 3,2 (g); n-BuOH 3,5 (g) bảo quản để tiến hành thử nghiệm Lựa chọn điều kiện thích hợp cho phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro sau: Thành phần hỗn hợp phản ứng trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng STT Thành phần Đệm natri phosphat pH=8 Mẫu thử Berberin clorid AChE 0,25 IU/ml DTNB 2,5 mM ACTI 2,5 mM Tổng thể tích (µl) Footer Page 35 of 116 Mẫu thử (µl) Mẫu trắng mẫu thử (µl) Mẫu chứng dương (µl) 700 800 700 Mẫu trắng mẫu chứng dương (µl) 800 100 100 50 50 1000 100 0 50 50 1000 100 100 50 50 1000 100 50 50 1000 27 Header Page 36 of 116  Tiến hành đo quang theo phương pháp đo quang Ellman Hỗn hợp phản ứng bao gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphate (pH = 8,0); 100 µl dung dịch thử nồng độ khác 100 µl dung dịch enzym AChE 0,25 IU/ml Trộn cuvet cm đem ủ 15 phút 25 C Các dịch chiết thử chất chuẩn dương (Berberin chlorid) hòa tan methanol Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2,5 mM 50 µl ACTI 2,5 mM trộn Tiếp tục ủ hỗn hợp 10 phút 25 0C Sau đó, dung dịch đo độ hấp thụ bước sóng 412 nm Tất thí nghiệm lặp lại lần  Kết đánh giá tác dụng ức chế AChE Kết tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà berberin clorid trình bày bảng 3.2 hình 3.1, hình 3.2 Bảng 3.2 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên chân gà Berberin clorid Footer Page 36 of 116 Mẫu thử IC50 (µg/ml) EtOH 15,62 ± 0,26 n- hexan 57,86 ± 0,86 EtOAc 105,83 ± 1,95 n-BuOH 10,44 ± 0,16 Berberin clorid 0,282 ± 0,03 28 Header Page 37 of 116 100 % Ức chế AChE 80 60 40 n-hexan EtOAc n-BuOH EtOH 20 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Log (Nồng độ) (μg/ml) Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết tính dựa vào đồ thị chuyển từ log [µg/ml] sang µg/ml 110 100 % Ức chế AChE 90 80 70 60 50 • Berberin clorid 40 30 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 Log (Nồng độ) (µg/mL) Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả ức chế hoạt độ enzym AChE Berberin clorid Giá trị IC50 Berberin clorid tính dựa vào đồ thị chuyển từ log [µg/ml] sang µg/ml Footer Page 37 of 116 29 Header Page 38 of 116 Nhận xét: Kết bảng 3.2 cho thấy tất mẫu cắn có tác dụng ức chế AChE mức độ khác Tác dụng ức chế AChE phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp với IC50 105,83 ± 1,95 µg/ml hoạt tính yếu hoạt tính mẫu toàn phần EtOH Phân đoạn dịch chiết nBuOH dịch chiết tổng EtOH cho thấy có tác dụng ức chế enzym AChE cao với IC50 10,44 ± 0,16 15,62 ± 0,26 µg/ml Tiếp phân đoạn nHexan có tác dụng ức chế enzym AChE với IC50 57,86 ± 0,86 µg/ml Tuy nhiên, hoạt tính phân đoạn n-BuOH EtOH yếu hoạt tính chuẩn dương berberin clorid với giá trị IC50 0,282 ± 0,03 µg/ml Với tác dụng ức chế mạnh AChE nồng độ thấp, phân đoạn dịch chiết n-BuOH lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu động học Hình 3.1 3.2 thể mối tương quan giá trị Log nồng độ mẫu thử Berberin clorid so với phần trăm tác dụng ức chế enzym AChE 3.2 Kết đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE  Tiến hành đánh giá động học ức chế AchE Động học ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết n-BuOH tiến hành theo phương pháp mô tả trước với chút thay đổi cho phù hợp với phòng thí nghiệm Hỗn hợp phản ứng gồm 700 µl dung dịch đệm natri phosphat (pH 8,0); 100 µl dung dịch thử nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH (0; ; 10 15 μg/ml) 100 µl dung dịch enzym AChE 0,25 IU/ml Trộn đem ủ 15 phút 25oC Sau đó, thêm 50 µl of DTNB 2.5 mM 50 µl với nồng độ khác chất ACTI (5; 2,5; 1,25 mM) trộn Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch bước sóng 412 nm vòng phút Tất thí nghiệm lặp lại lần Sử dụng đồ thị 1/[ACTI] 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk plot) để xác định kiểu động học ức chế enzym Hằng số ức chế Ki xác định điểm giao đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH] với 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Dixon plot)  Kết đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE in vitro Đồ thị Lineweaver–Burk mô tả động học ức chế enzym phân đoạn dịch chiết n-BuOH Hình 3.3 cho thấy kiểu ức chế kiểu ức chế hỗn hợp Footer Page 38 of 116 30 Header Page 39 of 116 (trong đồ thị Lineweaver–Burk hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km) Hằng số Ki xác định giá trị tuyệt đối từ điểm giao trục ox đường đồ thị Dixon, vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng 2Dxác Graph độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH định1 hình 3.4 100 80 Y Data 1/Tốc độ phản ứng (abs/min) 120 60 40 20 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 X DatamM-1 1/[ACTI] Hình 3.3 Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH Kí hiệu:Col●:1 vs0;Colo:2 5; ▼: 10; ∆: 15 µg/mL phân đoạn dịch chiết n-BuOH Col vs Col Nồng độ chất Col 1ACTI vs Col sử dụng 5; 2,5; 1,25mM 2D Graph 1/Tốc độ phản ứng (abs/min) Col vs Col Plot Regr 140 120 100 Y Data 80 60 40 20 -10 -5 10 15 20 X Data Nồng độ phân đoạn n-BuOH (mM) Hình 3.4 Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định Col vs Col Col vs Col Plot Regr số ức chế Ki Kí hiệu: ● : 1,25; o : 2,5; ▼: mM ACTI Nồng độ phân đoạn nBuOH sử dụng 0; 5; 10; 15 µg/ml Col vs Col Footer Page 39 of 116 31 Header Page 40 of 116 Hằng số Ki xác định giá trị tuyệt đối từ điểm giao trục Ox đường Nhận xét: Từ hình 3.4 cho ta thấy giá trị Ki xác định theo đồ thị hình 8,36 ± 0,05 µg/ml Kiểu ức chế AChE phân đoạn n-BuOH kiểu ức chế hỗn hợp Điều khẳng định quan sát đồ thị thấy giá trị Kmax tăng Vmax giảm nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH tăng 3.3 Bàn luận Bệnh Alzheimer bệnh thần kinh di truyền, trí nhớ, nguyên nhân bệnh chưa rõ dẫn chứng cho thấy chuyển hóa não rối loạn dẫn đến β-amyloid protein tạo nên xốp não [22] Enzym Acetylcholinesterase chủ yếu có mặt hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh Ở bệnh nhân Alzheimer quan sát có giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh Tình trạng gây suy giảm khả nhận thức người bệnh [22] Giả thuyết hệ cholinergic bệnh Alzheimer có vai trò quan trọng trình nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer Theo giả thuyết này, chất ức chế hoạt động AChE làm tăng nồng độ thời gian hoạt động ACh synap thần kinh từ cải thiện triệu chứng bệnh Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) dược liệu quý chứa nhiều hợp chất cấu trúc alkaloid chủ yếu berberin, worenin, coptisin, palmatin [47,48] với nhiều tác dụng chống vi khuẩn, virus, chống viêm, chống ung thư đặc biệt tác dụng hệ thần kinh Dựa số nghiên cứu sàng lọc gần cho thấy hợp chất berberin thể tác dụng ức chế AChE in vitro Hơn nữa, thành phần dịch chiết Hoàng liên chân gà xác định chứa berberin số alkaloid khác có tiềm ức chế AChE cần nghiên cứu làm rõ 3.3.1 Về kết đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinesterase in vitro phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch)  Về kết chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên Trong nghiên cứu khóa luận này, dược liệu Hoàng liên chân gà chiết xuất dung môi EtOH tiếp tục chiết phân đoạn với dung môi n-Hexan, EtOAc n-BuOH Các dịch chiết phân đoạn cô thành cắn Footer Page 40 of 116 32 Header Page 41 of 116 (EtOH g; n-Hexan 2,3 g; EtOAc 3,2 g n-BuOH 3,5 g) dùng để đánh giá tác dụng enzym AChE in vitro  Về phương pháp đánh giá sàng lọc in vitro Phương pháp in vitro lựa chọn ưu điểm cho kết nhanh, tiến hành đồng thời nhiều mẫu tốn Đồng thời, qua thu thập tài liệu cho thấy, hầu hết nghiên cứu liên quan ức chế AChE sử dụng phương pháp đo quang Ellman với cách tiến hành đòi hỏi điều kiẹn phòng thí nghiệm đơn giản, cho kết đáng tin cậy phương pháp Fast Blue B Vì vây, nghiên cứu sử dụng phương pháp đo quang Ellman để đánh giá với thay đổi yếu tố để phù hợp với điều kiện nghiên cứu  Về kết đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE Đánh giá tác dụng ức chế dịch chiết phân đoạn Hoàng liên chân gà cho thấy tất phân đoạn dịch chiết thể tác dụng ức chế enzym AChE, kết phù hợp với kết số nghiên cứu trước Hengqiang Zhaoa cộng [26]; Dorothea Kaufmann cộng [17] Tuy nhiên, mức độ ức chế phân đoạn dịch chiết khác với giá trị IC50 thay đổi từ 10,44-105,83 µg/ml So với chất đối chứng dương berberin clorid, tác dụng ức chế phân đoạn dịch chiết yếu khoảng từ 37-375 lần Trong phân đoạn dịch chiết nghiên cứu đánh giá, phân đoạn dịch chiết n-Butanol cho thấy tác dụng ức chế mạnh nhất; phân đoạn dịch chiết Ethyl acetat cho tác dụng ức chế yếu Phân đoạn nBuOH dịch chiết Hoàng liên sử dụng để đánh giá đặc điểm động học ức chế 3.3.2 Về kết đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym Acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết Hoàng liên Động học ức chế enzym AChE dịch chiết từ Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) chưa công bố trước Động học ức chế enzym AChE thể qua đồ thị Lineweaver–Burk cho thấy hệ số góc = Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km Giá trị Ki xác định theo đồ thị giá trị tuyệt đối từ điểm giao trục Ox đường đồ thị Dixon, vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH xác định 8,36 ± 0,05 µg/ml Footer Page 41 of 116 33 Header Page 42 of 116 Từ đồ thị cho thấy, kiểu ức chế hỗn hợp kiểu ức chế đặc trưng dược liệu, dược liệu có chứa hợp chất có nhiều đường tác dụng khác [25] Cơ chế ức chế cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH cạnh tranh với ACTI để gắn vào vị trí liên kết chất AChE liên kết vào vị trí khác vị trí liên kết chất AChE Điều khẳng định quan sát đồ thị thấy giá trị Kmax tăng Vmax giảm nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH tăng Mặc dù kết nghiên cứu khóa luận không tìm hợp chất sở hữu tác dụng ức chế AChE phân đoạn dịch chiết, nhiên, nghiên cứu tiến hành đánh giá tác dụng ức chế AChE phân đoạn dịch chiết EtOH; n-Hexan; EtOAC n-BuOH Hoàng liên chân gà Đồng thời, đặc điểm động học ức chế AChE nghiên cứu kiểu ức chế hỗn hợp phân đoạn dịch chiết Hoàng liên Vì vậy, kết khóa luận góp phần bổ sung thông tin cho sở liệu loại có tác dụng ức chế AChE nói chung Cơ sở liệu cho nghiên cứu tìm kiếm hợp chất tinh khiết có tác dụng đặc hiệu ức chế AChE Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) ứng dụng hỗ trợ phòng điều trị bệnh thần kinh tương lai Footer Page 42 of 116 34 Header Page 43 of 116 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Nghiên cứu thu kết sau: - Đã chiết xuất phân lập phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch): EtOH, n-Hexan, EtOAc n-BuOH - Đã đánh giá tác dụng ức chế AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên: + Phương pháp đo quang Ellman sử dụng + Các phân đoạn dịch chiết khảo sát nồng độ 1000 µg/ml; 500µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml; 15,625 µg/ml; 7,8125 µg/ml có so sánh đối chứng với mẫu berberin clorid chuẩn + Phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho tác dụng ức chế mạnh với IC50 10,44 ± 0,16 µg/ml - Đã đánh giá đặc điểm động học ức chế AChE phân đoạn dịch chiết n-BuOH Hoàng liên chân gà + Kiểu ức chế enzym phân đoạn dịch chiết Hoàng liên kiểu ức chế hỗn hợp với số Ki tìm 8,36 ± 0,05 µg/ml ĐỀ XUẤT - Tiếp tục nghiên cứu tinh chế hợp chất tinh khiết phân đoạn dịch chiết Hoàng liên chân gà (Coptis chinensis Franch) - Thử tác dụng ức chế AChE chất phân lập - Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE Hoàng liên in vivo nghiên cứu lâm sàng Footer Page 43 of 116 35 Header Page 44 of 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 TIẾNG VIỆT Phạm Thị Phương Anh (2001), “Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chế biến vị thuốc Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) đến thành phần hóa học tác dụng sinh học”, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Bộ Khoa học Công nghệ (1996), Sách Đỏ Việt Nam Phần thực vật (Red data book of Việt Nam volum plants), NXB Khoa Học Kĩ Thuật,100 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam, NXB Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học,565 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam tập 1, NXB Trẻ,325 Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất Y học Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,189 Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học, NXB Giáo dục Việt Nam,(1):69-71 Viện Dược liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa Học Kĩ Thuật,497 TIẾNG ANH Adsersen A., Gauguin B Gudiksen L et al (2006), “Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for Acetylcholinesterase inhibitory activity”, Journal of ethnopharmacology, 104:418-422 Alzheimer's A (2012), "2012 Alzheimer’s disease facts and figures", Alzheimer's & Dementia, 8(2): 131-168 Chen L, Wang L, Zhang Q, Zhang S, Ye W (2012), “Non-alkaloid chemical constituents from Coptis chinensis”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, May;37(9):1241-4 Cullar Mj, Giner R.M et al (2001), “Topical anti inflammatory activity of some Asian medical plants used in dermatological disorders”, Fitoterapia (Milano),72(3):221-229 Footer Page 44 of 116 Header Page 45 of 116 14 Department of pharmacy, National University of Singapore (1993), “Displacement of bilirubin from albumin by berberin”, Biol-Neonate, 63(4):201-8 15 Di Giovanni S., Borloz A Urbain A et al (2008), “In vitro screening assays to identify natural or synthetic Acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods”, European journal of pharmaceutical sciences, 33:109-119 16 Dongqing Jiang, Dianhui Wang, Xianghua Zhuang, Zhanqing Wang, Yihong Ni, Shihong Chen, Fudun Sun (2016), “Berberine increases adipose triglyceride lipase in 3T3-L1 adipocytes through the AMPK pathway”, Lipids in Health and Disease, Dec 9;15(1):214 17 Dorothea Kaufmann, Anudeep Kaur Dogra, Ahmad Tahrani, Florian Herrmann, Michael Wink (2016), “Extracts from Traditional Chinese Medicinal Plants Inhibit Acetylcholinesterase, A Known Alzheimer’s Disease Target”, Molecules, Aug 31;21(9) 18 Ellman G L., Courtney K D., Andres V et al (1961), “A new and rapid colorimetric determination of Acetylcholinesterase activity”, Biochemical pharmacology,(7):88-95 19 Enhui Cui, Xiaoyan Zhi, Ying Chen, Yuanyuan Gao, Yunpeng Fan, Weimin Zhang, Wuren Ma, Weifeng Hou, Chao Guo, and Xiaoping Song (2014), “Coptis chinensis and Myrobalan (Terminalia chebula) Can Synergistically Inhibit Inflammatory Response In Vitro and In Vivo”, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2014:510157 20 Eunhee Kim, Sejin Ahn, Hae-ik Rhee, Deug-chan Lee (2016), “Coptis chinensis Franch extract up-regulate type I helper T-cell cytokine through MAPK activation in MOLT-4 T cell”, Journal of Ethnopharmacology, Aug 2;189:126-31 21 Fan Jia, Gang Zou, Jingjing Fan, Zhiming Yuan (2010), “Indentification of palmatine as an inhibitor of West Nile virus”, Archives of Virology, Aug; 155(8):1325-9 Footer Page 45 of 116 Header Page 46 of 116 22 Francis PT, Palmer AM, Snape M, Wilcock GK (1999), "The cholinergic hypothesis of Alzheimer’s disease: a review of progress", Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry, 66(2): 137-147 23 George T Grossberg (2003), “Cholinesterase Inhibitors for the Treatment of Alzheimer’s Disease: Getting On and Staying On”, Current Therapeutic Research, 64:216-235 24 Hang Ma, Yinran Hu, Zongyao Zou, Min Feng, Xiaoli Ye, Xuegang Li (2016), “Antihyperglycemia and Antihyperlipidemia Effect of Protoberberine Alkaloids From Rhizoma Coptidis in HepG2 Cell and Diabetic KK-Ay Mice”, Drug Development Research, Jun;77(4):163-70 25 Hawkins, K.I and C.E Knittle (1972), "Comparison of Acetylcholinesterase determinations by the Michel and Ellman methods" Analytical chemistry 44(2): p 416-417 26 Hengqiang Zhaoa, , Siduo Zhoua, Minmin Zhang, Jinhong Feng, Shanshan Wang, Daijie Wang, Yanling Geng, Xiao Wang (2016), “An in vitro AChE inhibition assay combined with UF-HPLC-ESI-QTOF/MS approach for screening and characterizing of AChE inhibitors from roots of Coptis chinensis Franch”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Feb 20;120:235-40 27 H P J., Ren Y Howes M J (2005,) “Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi” Natural product report 28 Hui-Li Tan, Kok-Gan Chan, Priyia Pusparajah, Acharaporn Duangjai et al (2016), “Rhizoma Coptidis: A Potential Cardiovascular Protective Agent”, Frontiers on Pharmacology, Oct 7;7:362 29 Jae Sue Choi, Ji-Hye Kim, Md Yousof Ali, Hee Jin Jung, Byung-Sun Min, Ran Joo Choi, Gun-Do Kim, Hyun Ah Jun (2015), “Antiadipogenic effect of epiberberine is mediated by regulation of the Raf/MEK1/2/ERK1/2 and AMPKα/Akt pathways”, Archives of Pharmacal Research, Dec;38(12):2153-62 30 Kobayashi Y, Yamashita Y et al (1995), “Inhibitors of DNA topoisomerase I and II isolated from the Coptis rhizome”, Planta Med., Oct; 61(5):414-8 Footer Page 46 of 116 Header Page 47 of 116 31 Kong LD, Cheng CH, Tan RX (2001), “Monoamine oxidase inhibitors from rhizoma of Coptis chinensis”, Planta Med., Feb;67(1):74-6 32 Li C, Xie J et al (2016), “Comparison of Helicobacter pylori Urease Inhibition by Rhizoma Coptidis, Cortex Phellodendri and Berberin: Mechanisms of Interaction with the Sulfhydyl Group”, Planta Med., Mar;82(4):305-11 33 Liang Peng, Zhengxing Rong, Hao Wang, Biyun Shao, Lei Kang, Hong Qi, Hongzhuan Chen (2017), “A novel assay to determine Acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer's disease”, Biomedical Chromatography, Mar 10 34 Ma X., Tan C Zhu D et al (2007), “Huperzine A from Huperzia species - An ethnopharmacological review”, Journal of ethnopharmacology, 113 35 Ruifang Liu, Zhifei Cao et al (2013), “Jatrorrhizine hydrochloride inhibits the proliferation and neovascularization of C8161 metastatic melanoma cells”, Anticancer Drugs, Aug;24(7):667-76 36 Schinella GR et al (2002), “Inhibition of Trypanosoma cruzi growth by medical plant extracts”, Dec;73(7-8):569-75 37 Shuang Jiang, Yahong Wang, Dayong Ren et al (2015), “Antidiabetic mechanism of Coptis chinensis polysaccharide through its antioxidant property involving the JNK pathway”, Pharmaceutical Biology, Jun;53(7):1022-9 38 Tang Z M., Wang Z Y, Kang J W (2007), “Screening of Acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophortically mediated microanalysis techique”, Electrophoresis, (28):360-365 39 Tao Luo, Xiuyin Shen, Sheng Li, Ting Ouyang, Huaqiao Wang (2016), “The Protective Effect of Jatrorrhizine against Oxidative Stress in Primary Rat Cortical Neurons”, CNS & Neurological Disorders - Drug Targets, Jun 10 40 Thomas Friedmann, Bejamin Otto et al (2014), “Coptis chinensis Franch exhibits neuroprotective properties against oxidative stress in Footer Page 47 of 116 Header Page 48 of 116 41 42 43 44 45 46 47 48 human neuroblastoma cells”, Journal of Ethnopharmacology, Aug 8;155(1):607-15 Thomas Friedmann, Yue Ying, Weigang Wang (2016), “Neuroprotective Effect of Coptis chinensis in MPP+ and MPTP-Induced Parkison’s Disease Models”,The American Journal of Chinese Medicine, 44(5):90725 Van Asperen K (1962), “A study of housefly esterase by means of a sensitive colorimetric method” J Ins Physiol, 8, 401-416 Weina Ma, Man Zhu, Dongdong Zhang, Liu Yang, Tianfeng Yang, Xin Li, Yanmin Zhang (2017), “Berberine inhibits the proliferation and migration of breast cancer ZR-75-30 cells by targeting Ephrin-B2”, Phytomedicine, Feb 15; 25:45-51 Weiwei Yang, Liping She, Kun Yu, Shan Yan, Xuefeng Zhang, Xiaoyi Tian, Shuren Ma, Xiwen Zhang (2016), “Jatrorrhizine hydrochloride attenuates hyperlipidemia in a high-fat diet-induced obesity mouse model”, Molecular Medicine Reports, Oct;14(4):3277-84 Wu J, Zhang H, Hu B et al (2016), “Coptisine from Coptis chinensis inhibits production of inflammatory mediators in lipolysaccharidestimulated RAW 264.7 murine macrophage cells”, European Journal of Pharmacology, Jun 5;780:106-14 Xiaoquan Ban, Bo Huang, Jingsheng He et al (2011), “In vitro and In vivo Antioxidant Properties of Extracts from Coptis chinensis Inflorescence”, Plant Foods of Human Nutrition, Jun;66(2):175-80 Xiumei Lv, Yan Li, Ce Tang, Yi Zhang, Jing Zhang & Gang Fan (2016), “Integration of HPLC-based fingerprint and quantitative analyses for differentiating botanical species and geographical growing origins of Rhizoma Coptidis”, Pharmaceutical Biology, Dec;54(12):3264-3271 Yanfang Yang, Jingling Peng et al (2017), “Determination of Alkaloid Contents in Various Tissues of Coptis Chinensis Franch By Reversed Phase-High Performance Lipuid Chromatography and Ultraviolet Spectrophotometry”, Journal of Chromatographic Science, 55(5):556563 Footer Page 48 of 116 Header Page 49 of 116 49 Yuan Yue, Lili Dou, Xin Wang, Hui Xue, Yanhong Song, Xiaoni Li (2015), “Screening β1AR inhibitors by cell membrane chromatography and offline UPLC/MS method for protecting myocardial ischemia”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Nov 10;115:33944 50 Zheng‑ Hua Huang, Hong‑ Fang Zheng, Wei‑ Lu Wang, Yong Wang, Long‑ Fei Zhong, Jiu‑ Long Wu, Qiao‑ Xing Li (2014), “Berberine targets epidermal growth factor receptor signaling to suppress prostate cancer proliferation in vitro”, Molecular Medicine Reports, Mar;11(3):2125-8 51 Zhou JT, Li CL, Tan LH, Xu YF, Liu YH, Mo ZZ, Dou YX, Su R, Su ZR, Huang P, Xie JH (2017), “Inhibition of Helicobacter pylori and Its Associated Urease by Palmatine: Investigation on the Potential Mechanism”, PloS One, Jan 3;12(1):0168944 52 Zhu Qin-Wei, Li Yong-Guang (2016), “Berberine attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by suppressing the activation of PI3K/AKT signaling”, Experimental and Therapeutic Medicine, Mar;11(3):978-984 Footer Page 49 of 116 ... Mục tiêu 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) Mục tiêu 2: Đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Footer... Acetylcholinesterase in vitro phân đoạn dịch chiết Hoàng liên (Coptis chinensis Franch) 32 3.3.2 Về kết đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym Acetylcholinesterase phân đoạn dịch chiết Hoàng liên 33 KẾT... HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN BÍCH HẠNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN (COPTIS CHINENSIS FRANCH) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC