Nghiên cứu phân lập và định lượng cryptotanshinon từ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) phục vụ công tác đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm

Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Khóa : QH.2012.Y Ngƣời hƣớng dẫn : TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội – 2017 Footer Page of 116 Header Page of 116 LỜI CẢM ƠN Với tất lịng kính trọng biết ơn em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ dìu dắt em q trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp Nhờ có bảo thầy mà em trưởng thành cố gắng học hỏi thêm nhiều để hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, thầy cô Khoa Y Dược đặc biệt Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc giúp đỡ tạo điều kiện tốt giúp em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED)- Đề tài mã số 106-YS.05-2015.05 tài trợ cho em trình làm thực nghiệm đề tài Cảm ơn thành viên lớp K57 Dược học đặc biệt bạn Bích, Huệ, Hào - người đồng hành suốt thời gian qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người ln giúp đỡ, động viên, chia sẻ với con, giúp có thêm động lực cố gắng ngày Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2017 Đặng Thị Ngần Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR ESI-MS Carbon (13) Nuclear magnetic resonance Khối phổ - ion hóa phun mù electron (Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol Proton nuclear magnetic resonance H-NMR HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectrum) MeOH Methanol Mp Điểm nóng chảy LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SKĐ Sắc ký đồ TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Tử ngoại (Ultraviolet) Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc số abietane diterpenoid Hình 1.2 Cấu trúc số acid phenolic Hình 1.3 Cấu trúc số triterpenoid có chi Salvia L Hình 1.4 Cấu trúc cryptotanshinon Hình 1.5 Sắc ký đồ chất thơng số đặc trưng 15 Hình 2.1 Một số hình ảnh đan sâm thu hái vườn dược liệu Sa Pa 19 Hình 3.1 Cấu trúc cryptotanshinon 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC cryptotanshinon tinh chế 30 Hình 3.3 Sắc ký đồ cryptotanshinon mẫu trắng 31 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc nồng độ & diện tích pic cryptotanshinon 35 Footer Page of 116 Header Page of 116 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Bảng Trang Bảng 3.1 Kết đo phổ NMR cryptotanshinon phân lập 28 Bảng 3.2 Kết đo nhiệt độ nóng chảy cryptotanshinon tinh chế 29 Bảng 3.3 Kết phân tích độ tinh khiết cryptotanshinon tinh chế 31 Bảng 3.4 Chương trình sắc ký HPLC 32 Bảng 3.5 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng cryptotanshinon tinh chế 33 Bảng 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 34 Bảng 3.7 Kết phân tích độ lặp lại phương pháp 36 Bảng 3.8 Kết phân tích độ phương pháp 37 Bảng 3.9 Kết phân tích định lượng cryptotanshinon đan sâm Sa Pa 37 Footer Page of 116 Header Page of 116 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG - TỔNG QUAN…………………………………………………… .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học đan sâm 1.1.3 Tác dụng sinh học đan sâm 1.1.4 Tác dụng công dụng theo y học cổ truyền 1.2 TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON 1.3 TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU 1.3.1 Phương pháp sắc ký 1.3.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 12 1.3.3 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 13 1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 14 1.3.5 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 18 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 19 2.1.3 Thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 20 2.2.2 Xây dựng phương pháp HPLC 21 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 Footer Page of 116 Header Page of 116 3.1.1 Chiết xuất tinh chế cryptotanshinon từ đan sâm 24 3.1.2 Xác định cấu trúc cryptotanshinon 27 3.1.3 Đánh giá độ tinh khiết phân tích tạp chất 29 3.1.4 Xây dựng phương pháp định lượng HPLC 31 3.1.5 Sử dụng phương pháp phân tích HPLC khảo sát vào phân tích định tính, định lượng mẫu đan sâm thu hái Sa Pa- Lào Cai 37 3.2 THẢO LUẬN 38 3.2.1 Phân lập xác định cấu trúc cryptotanshinon 38 3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích định lượng cryptotanshinon 38 3.2.3 Phân tích cryptotanshinon mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái Lào Cai 39 KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Footer Page of 116 Header Page of 116 MỞ ĐẦU Đan sâm có tên khoa học Salvia miltiorrhiza Bunge (họ Lamiaceae), thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc trồng nhiều sinh trưởng tốt vùng Tây Bắc nước ta Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) rễ phơi khô sấy khô đan sâm, thường dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không đều, phong thấp, thần kinh suy nhược, ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc, đan sâm thuốc tăng cường tuần hoàn máu, chữa đau nhói ngực bụng, nhiễm khuẩn da, bồn chồn, chứng to gan lách, đau thắt ngực, đột quỵ [7,14,20] Nghiên cứu y học đại cho thấy đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch, làm giãn mạch tăng lưu lượng động mạch vành, cải thiện vi tuần hồn, phịng chống tích cực tình trạng thiếu máu, làm chậm việc hình thành mảng xơ vữa động mạch [1] Ở Việt Nam, nghiên cứu đan sâm quan tâm để phát triển ứng dụng dược liệu quý Các kết nghiên cứu hóa thực vật cho thấy đan sâm có thành phần tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester, trijuganon B, cryptotanshinon, tanshinon IIA tanshinon I… Trong đó, cryptotanshinon (1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl- (R) -phenanthro (1,2-b) furan10,11-dion) thành phần tanshinon đan sâm [25] Cryptotanshinon màu nâu, khơng hịa tan nước tan số dung môi hữu cơ; có nhiều hoạt tính sinh học dược lý kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, [3] Trên sở kế thừa nghiên cứu đan sâm công bố nước quốc tế, với mục tiêu xây dựng sở khoa học thành phần hoạt chất dược liệu đan sâm, đề tài “Nghiên cứu phân lập định lƣợng cryptotanshinon từ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan sâm” tiến hành với mục tiêu chiết xuất, phân lập phân tích cryptotanshinon dược liệu đan sâm bao gồm nội dung nghiên cứu sau: - Chiết xuất, phân lập xác minh cấu trúc cryptotanshinon từ rễ đan sâm thu hái Lào Cai Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích cryptotanshinon sử dụng HPLC Footer Page of 116 Header Page 10 of 116 CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) thuộc chi Salvia, họ Bạc hà (Lamiaceae) gọi đơn sâm, huyết sâm, xích sâm; cỏ sống lâu năm, cao 30-80 cm, tồn thân mang lơng ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vng có gân dọc Lá kép, mọc đối 3-5 chét, đặc biệt có Lá chét mọc thường lớn Lá kép có cuống dài, cuống chét ngắn có dìa Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm Mép chét có cưa tù Mặt chét màu xanh, có lơng mềm màu trắng, mặt màu xanh tro, có lơng dài Gân mặt dưới, chia phiến thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc thành chùm đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, vòng 3-10 hoa, thường hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, mơi, mơi trơng nghiêng hình lưỡi liềm, mơi xẻ thùy, thùy có cưa trịn Hai nhị mơi dưới, bầu có vịi dài lịi mơi Quả nhỏ, dài mm, rộng 1,5 mm [1,14] Salvia miltiorrhiza Bunge phân bố rộng rãi miền Bắc Trung Quốc Nó có mặt Nhật Bản [33] Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc thích hợp với đất cát ẩm, trồng rễ vào mùa xuân [1,6] Cây trồng trại thuốc Sa Pa (Viện Dược liệu) thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, hoa hàng năm Một số đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng Cây trồng tốt vào tháng 2-3 để đến tháng 11-12 thu hoạch [1] Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa tháng 6-9 [14] Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6] 1.1.2 Thành phần hóa học đan sâm Thành phần hóa học đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) acid phenolic, diterpenoid, flavonoid số thành phần khác Bộ phận mặt đất lồi có chứa flavonoid, triterpenoid monoterpenoid đặc biệt hoa Trong đó, diterpenoid acid phenolic lại tìm thấy chủ yếu rễ [31] Footer Page 10 of 116 ... KHOA Y DƢỢC ĐẶNG THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... hoạt chất dược liệu đan sâm, đề tài ? ?Nghiên cứu phân lập định lƣợng cryptotanshinon từ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan sâm? ?? tiến hành với mục... xuất, phân lập phân tích cryptotanshinon dược liệu đan sâm bao gồm nội dung nghiên cứu sau: - Chiết xuất, phân lập xác minh cấu trúc cryptotanshinon từ rễ đan sâm thu hái Lào Cai Xây dựng thẩm định