Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của các phân đoạn dịch chiết hoàng liên ô rô (mahonia nepalensis DC , họ berberidaceae)

Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y- DƢỢC PHAN KẾ SƠN ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINSTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN Ô RÔ (Mahonia Nepalensis DC., HỌ Berberidaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2017 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y- DƢỢC Ngƣời thực hiện: PHAN KẾ SƠN ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINSTERASE IN VITRO CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT HOÀNG LIÊN Ô RÔ (Mahonia Nepalensis DC., HỌ Berberidaceae) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC KHÓA: QH.2012.Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS BÙI THANH TÙNG HÀ NỘI – 2017 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 LỜI CẢM ƠN Khi nhận đề tài khóa luận này, cảm thấy người may mắn có hội làm nghiên cứu lĩnh vực mà đam mê theo đuổi lâu Và bây giờ, hoàn thành khóa luận, cảm thấy người may mắn có hội học hỏi nhiều điều Trong trình thực khóa luận tốt nghiệp, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô, bạn bè người thân yêu gia đình Lời đầu tiên, xin gửi đến người thầy mà vô kính mến ngưỡng mộ - TS Bùi Thanh Tùng – Phó trưởng phòng Quản lý khoa học hợp tác phát triển - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy không người hướng dẫn cho thực đề tài khóa luận, thầy hình mẫu để tin sống có người vô dễ mến tốt bụng, sẵn sàng giúp đỡ người khác không lý Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, toàn thể thầy cô môn Dược lý – Dược lâm sàng, môn Bào chế Công nghệ Dược phẩm, môn Hóa Dược Kiểm nghiệm thuốc hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thực nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn Trung tâm thông tin – thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp cho tài liệu cần thiết bổ ích trình thực khóa luận Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn yêu thương đến gia đình, người thân bạn bè, người bên cổ vũ, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Phan Kế Sơn Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACh AChE ATCI DTNB EtOAc FDA nAChRs n-BuOH SD ⃐ Acetylcholin Enzym acetylcholinsterase Acetylthiocholin iodid Acid 5-5‟-dithiobis-2-nitrobenzoic Ethylacetate Hiệp hội Quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ Receptor nicotinic acetylcholin n-buthanol Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Giá trị trung bình Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Tên bảng Trang Thành phần hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng 25 nồng độ dung dịch chất ACTI thuốc thử DTNB đến phương pháp thử Thành phần hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng 26 hoạt độ enzym đến phương pháp thử Ảnh hưởng nồng độ chất ACTI thuốc thử 29 DTNB đến phương pháp thử Thành phần hỗn hợp phản ứng 31 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ Hoàng liên 34 ô rô Berberin clorid Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình 1.1 Tên hình Sơ đồ trình sinh tổng hợp Acetylcholin Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Ba vị trí hoạt động bề mặt enzym acetylcholin Hai khung alcaloid có nhân Isoquinolin Hai alcaloid có khung protoBerberin tìm thấy Hoàng liên ô rô Cấu trúc phân tử Palmatine Một số alcaloid có khung bisbenzylisoquinoline Hoàng liên ô rô Cấu trúc phân tử Magnoflorine Sơ đồ phản ứng tạo màu với thuốc thử Ellman Sơ đồ chiết xuất phân đoạn thân Hoàng liên ô rô Đồ thị biểu diễn tương quan độ hấp thụ quang thời gian phản ứng hỗn hợp mức hoạt độ enzym AChE Sơ đồ quy trình phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế hoạt độ enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế hoạt độ enzym AChE Berberin clorid Đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng chất ACTI nồng độ khác Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết nBuOH Đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng phân đoạn dịch chiết Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 1.7 Hình 2.1 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Trang 10 17 18 18 19 19 23 28 30 32 33 34 36 37 38 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Hình 3.9 n-BuOH nồng độ khác Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định số ức chế Ki Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 39 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Alzheimer 1.1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.1.2 Dịch tễ học yếu tố nguy 1.1.3 Đặc điểm lâm sàng 1.1.4 Điều trị bệnh Alzheimer 1.2 Acetylcholin, enzym acetylcholinsterase giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer 1.2.1 Acetylcholin 1.2.2 Enzym acetylcholinsterase 10 1.3 Một số phƣơng pháp thƣờng dùng nghiên cứu ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro 12 1.3.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman 12 1.3.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B 14 1.4 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật chi Mahonia, phân bố số loài Việt Nam đặc điểm Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC.)………… 15 1.4.1 Vị trí phân loại thực vật 15 1.4.2 Phân bố, số loài Việt Nam 15 1.4.3 Đặc điểm thực vật học Hoàng liên ô rô 16 1.4.4 Thành phần hóa thực vật 17 1.4.5 Tác dụng công dụng 20 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 21 2.1.3 Hóa chất, thiết bị 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô 28 3.2 Xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 28 3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae) 33 Chƣơng BÀN LUẬN 40 4.1 Về xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 40 4.2 Về đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae) 41 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 10 of 169 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer bệnh thoái hóa thần kinh tiến triển liên quan đến tuổi, làm suy giảm khả nhớ nhận thức, vấn đề đáng lo ngại, đặc biệt người cao tuổi [38] Bệnh Alzheimer chưa có liệu pháp chữa trị hay phòng ngừa hiệu Thống kê châu Á cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh Alzheimer, số dự đoán tăng gấp đôi vào năm 2050, lên tới 62,8 triệu người Việt Nam có khoảng triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình Alzheimer [9] Bệnh nhân bị Alzheimer bị giảm khả xét đoán, định hướng không gian thời gian, ngôn ngữ, tư nhận thức, hành động,… ảnh hưởng nặng nề đến chức chất lượng sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh, cho gia đình cộng đồng xã hội Theo giả thuyết cholinergic, việc phát sinh bệnh Alzheimer có liên quan đến thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin não tới gần 90% [74] Acetylcholin (ACh) có vai trò quan trọng hoạt động hệ thần kinh Nó chất dẫn truyền thần kinh khe synap, nồng độ ACh trì ổn định enzym acetylcholinsterase (AChE) AChE enzym có chức làm ngăn chặn dẫn truyền xung động thần kinh synap thần kinh cholinergic thông qua việc thủy phân ACh tạo thành cholin acid acetic Khi nồng độ chất enzym trạng thái cân hoạt động hệ thần kinh trì mức bình thường Ở bệnh nhân Alzheimer, có tích tụ mảng lão hóa β-amyloid đám rối thần kinh, khiến cho nồng độ ACh bị suy giảm đáng kể [37] Việc ức chế AChE trì nồng độ thời gian hoạt động ACh khe synap, từ có tác dụng trì khả ghi nhớ học tập Do vậy, thuốc ức chế enzym AChE đóng vai trò quan trọng việc ngăn chặn tiến triển bệnh Alzheimer Theo ước tính, gần 20 năm trở lại có khoảng 50% thuốc đưa thị trường trực tiếp gián tiếp có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [45] Do đó, hợp chất thiên nhiên nguồn quan trọng cung cấp hợp chất tiềm dùng điều trị bệnh khác nhau, có bệnh Alzheimer Các thuốc điều trị chủ yếu chất Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 10 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 46 of 169 Động học ức chế enzym AChE mô tả đồ thị LineweaverBurk, xây dựng từ đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng chất ACTI nồng độ khác hình 3.6 Tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô thể hình 3.7 (Đồ thị Lineweaver-Burk plot) Từ đồ thị Lineweaver-Burk ta xác định kiểu ức chế enzym phân đoạn dịch chiết n-BuOH ức chế hỗn hợp [17,26] 1/Tốc độ phản ứng (abs/min) 50 40 30 20 10 -1 1/[ACTI] mM-1 Hình 3.7 Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH Kí hiệu:●: 0; ○: 2,5; ▼: 5; ∆: 10 µg/mL phân đoạn dịch chiết n-BuOH Nồng độ chất ACTI sử dụng 5; 2,5; 1,25 mM 37 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 46 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 47 of 169 n-BuOH 2,5 µg/mL n-BuOH µg/mL 0.5 ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI mM Độ hấp thụ quang (Abs) 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Độ hấp thụ quang (Abs) 0.8 ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI mM 0.4 0.3 0.2 0.1 0.1 0.0 50 0.0 50 100 150 200 250 300 100 150 200 250 300 350 Thời gian (s) 350 Thời gian (s) n-BuOH µg/mL n-BuOH 10 µg/mL 0.30 ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI mM 0.4 0.3 0.2 0.1 Độ hấp thụ quang (Abs) Độ hấp thụ quang (Abs) 0.5 ACTI 1.25 mM ACTI 2.5 mM ACTI mM 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.0 50 100 150 200 250 300 0.00 350 Thời gian (s) 50 100 150 200 250 300 350 Thời gian (s) Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng phân đoạn dịch chiết n-BuOH nồng độ khác Đồ thị động học Dixon phân đoạn dịch chiết n-BuOH xây dựng dựa đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng phân đoạn dịch chiết n-BuOH nồng độ 0; 2,5; 5; 10 µg/mL hình 3.8 38 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 47 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 48 of 169 1/Tốc độ phản ứng (abs/min) 50 40 30 20 10 -8 -6 -4 -2 10 12 -10 Nồng độ phân đoạn n-BuOH (µg/mL) Hình 3.9 Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH để xác định số ức chế Ki Kí hiệu: ●: 1,25; ○: 2,5; ▼: mM ACTI Nồng độ phân đoạn nBuOH sử dụng 0; 2,5; 5; 10 µg/mL Đồ thị động học Dixon hình 3.9 đoạn dịch chiết n-BuOH có tính chất đặc trưng chất ức chế cạnh tranh [17,26,64], số ức chế Ki xác định giá trị tuyệt đối từ điểm giao đường trục Ox đồ thị 3,416 ± 0,05 µg/mL Giá trị Ki nhỏ chứng tỏ dịch chiết Hoàng liên ô rô có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh 39 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 48 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 49 of 169 Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 Về xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE Dược liệu tự nhiên nguồn đa dạng, phong phú hợp chất sinh học hóa học Các cấu trúc độc đáo phức tạp hợp chất tự nhiên khó tổng hợp phương pháp tổng hợp hóa học Hiện nay, nhiều loại dược liệu sử dụng thuốc y học cổ truyền, mang lại hiệu cao điều trị bệnh Việc nghiên cứu sàng lọc dược liệu sử dụng theo kinh nghiệm dân gian phục hồi trí nhớ, an thần ích trí theo hướng ức chế enzym AChE hướng nghiên cứu tìm kiếm thuốc có tác dụng cải thiện trí nhớ bệnh Alzheimer nhiều nhà khoa học tiếp cận Trong trình nghiên cứu sàng lọc dược liệu tìm kiếm hợp chất có tác dụng ức chế enzym AChE, phương pháp đo quang in vitro đề cập có hai phương pháp khác sử dụng phương pháp ex vivo phương pháp in vivo Tùy vào điều kiện thí nghiệm mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp nghiên cứu phù hợp Phương pháp in vitro lựa giai đoạn nghiên cứu sàng lọc ban đầu mẫu dịch chiết từ dược liệu, phương pháp có ưu điểm cho kết nhanh, tiến hành đồng thời nhiều mẫu tốn Ở giai đoạn tiếp theo, lựa chọn mẫu thử có hoạt tính in vitro mạnh, nghiên cứu sâu sử dụng phương pháp ex vivo in vivo [5] Sau tiến hành nghiên cứu tiền lâm sàng nêu trên, chất ức chế enzym AChE đưa vào thử nghiệm lâm sàng qua pha Hiện phần lớn nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế enzym AChE sử dụng phương pháp đo quang in vitro tác giả Ellman, điểu kiện thử nghiệm thường có khác nghiên cứu cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Sau tiến hành khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro, xác định số điều kiện tối ưu cho phương pháp gồm: nồng độ dung dịch chất ATCI 2,5 mM; nồng độ 40 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 49 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 50 of 169 dung dịch thuốc thử DTNB 2,5 mM; hoạt độ AChE 0,5 IU/mL; thời điểm đo độ hấp thụ mẫu thử sau phản ứng xẩy 10 phút Khi tiến hành phương pháp in vitro, bên cạnh việc xác định điều kiện thử nghiệm phù hợp, việc lựa chọn chất chuẩn dương có vai trò quan trọng nghiên cứu, giúp định lượng tương đối tác dụng mẫu nghiên cứu so sánh với chất chuẩn Với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, chất chuẩn dương thường sử dụng galanthamin, tacrin berberin clorid [35,50,55] Mặc dù berberin clorid chưa sử dụng lâm sàng để điều trị bệnh Alzheimer, berberin clorid lựa chọn làm chất chuẩn dương số nghiên cứu in vitro có tác dụng ức chế AChE in vitro mạnh, đồng thời sẵn có giá thành rẻ nhiều so với chất lại Vì vậy, việc lựa chọn berberin clorid làm chất chuẩn dương nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu trước sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro phù hợp với điều kiện thực tiễn Việt Nam 4.2 Về đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae) Bệnh Alzheimer chứng trí nhớ phổ biến giới liên quan đến lão hóa Ở nhiều nước, loại thuốc thảo dược truyền thống sử dụng để ngăn ngừa điều trị rối loạn thoái hóa thần kinh, số phát triển thành thực phẩm chức thuốc dùng lâm sàng Các triệu chứng xuất lắng đọng mảng β-amyloid đám rối thần kinh [18] Bệnh lý học bệnh Alzheimer liên quan đến thiếu hụt Acetylcholin não Để điều trị, người ta nâng cao chức cholinergic việc sử dụng chất ức chế AChE nhằm cải thiện phần bệnh tật AChE nằm synap hệ thần kinh trung ương vai trò thủy phân ACh, thành choline acid acetic Ức chế enzym AChE đích quan trọng để điều trị chứng rối loạn thần kinh để tìm kiếm hợp chất điều trị Alzheimer [48] ACh chất dẫn truyền thần kinh quan trọng hệ thống thần kinh trung ương 41 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 50 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 51 of 169 ngoại biên, khả ức chế enzym AChE đóng vai trò marker sinh học điểm liên quan đến rối loạn thần kinh Tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô nghiên cứu 25oC phương pháp Ellman Phương pháp sử dụng chất acetylthiocholine iodide Khi acetylthiocholine iodide bị thủy phân enzym AChE tạo thiocholin chất phản ứng với 5-5‟dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo sản phẩm màu vàng Kết cho thấy tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ Phân đoạn dịch chiết n-BuOH dịch chiết tổng EtOH cho thấy có tác dụng ức chế cao với giá trị IC50 tương ứng 3,38 ± 0.07 µg/mL 12,08 ± 0,33 µg/mL Tiếp theo phân đoạn n-hexan có giá trị IC50 23,51 ± 1,21 µg/mL Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp với IC50 126,74 ± 2,16 µg/mL, so với IC50 chất chuẩn dương berberin clorid 0,282 ± 0,03 µg/mL Từ kết cho thấy, chất có tác dụng ức chế enzym AChE tập trung nhiều phân đoạn dịch chiết n-BuOH, so với phân đoạn khác n-Hexan EtOAc Do vậy, phân đoạn dịch chiết n-BuOH có khả chứa nhiều hợp chất sinh học có tác dụng ức chế enzym AChE Động học ức chế enzym AChE dịch chiết từ Hoàng liên ô rô chưa nghiên cứu trước Ngoài ra, phân đoạn dịch chiết n-BuOH có giá trị IC50 thấp phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô (tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất) nên sử dụng phân đoạn dịch chiết để nghiên cứu động học ức chế enzym AChE Đồ thị Lineweaver– Burk mô tả động học ức chế enzym phân đoạn dịch chiết n-BuOH Đồ thị động học Lineweaver–Burk hình 3.7 có tính chất trung gian kiểu ức chế cạnh tranh không cạnh tranh, cho thấy kiểu ức chế phân đoạn dịch chiết n-BuOH kiểu ức chế hỗn hợp [17,26] (trong đồ thị Lineweaver– Burk hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km) Đồ thị động học Dixon hình 3.9 có tính chất đặc trưng chất ức chế cạnh tranh [17,26,64] Hằng số ức chế Ki xác định giá trị tuyệt đối từ điểm giao đường trục Ox đồ thị Dixon, vẽ theo 42 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 51 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 52 of 169 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH Giá trị Ki xác định theo đồ thị Dixon hình 3.9 3,416 ± 0,05 µg/mL Ki số ức chế enzym cho phép đánh giá độ mạnh yếu chất ức chế Ki gọi số phân ly phức hợp Enzym – Chất ức chế (E – I) không hoạt động biểu tác dụng ức chế Nếu phức hợp E – I có khuynh hướng dễ tách (Ki cao) enzym tự hoạt động bình thường, hiệu ức chế yếu Nếu số Ki nhỏ, chất ức chế bị liên kết chặt với enzym nên lượng enzym hoạt động nhỏ, tác dụng ức chế mạnh [26,64] Phân đoạn n-BuOH dịch chiết Hoàng liên ô rô có giá trị số Ki nhỏ chứng tỏ có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh Kiểu ức chế hỗn hợp kiểu ức chế đặc trưng dược liệu, nguyên nhân thành phần dịch chiết có chứa loạt hợp chất có nhiều chế tác dụng khác [27] Cơ chế ức chế cho thấy hợp chất có hoạt tính phân đoạn dịch chiết n-BuOH cạnh tranh với ACTI để gắn vào trung tâm hoạt động – vị trí liên kết với chất enzym AChE kết hợp với enzym AChE kết hợp với phức hợp AChE-ACTI Trong trường hợp ACTI nồng độ cao, hợp chất có hoạt tính phân đoạn dịch chiết liên kết vào vùng định (không phải trung tâm hoạt động) enzym AChE, làm biến đổi cấu hình phân tử enzym khiến enzym không liên kết với chất Điều khẳng định quan sát đồ thị thấy giá trị Kmax tăng Vmax giảm nồng độ phân đoạn dịch chiết nBuOH tăng Phân đoạn n-BuOH dịch chiết Hoàng liên ô rô có chứa hợp chất có hoạt tính sinh học, có tác dụng ức chế enzym AChE cao phân đoạn dịch chiết Tuy nhiên, kết tác dụng hiệp đồng nhiều hợp chất phân đoạn dịch chiết Vì vậy, cần tiếp tục phân lập thành phần mang hoạt tính làm sáng tỏ chế tác dụng chúng Nghiên cứu nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE dịch chiết Hoàng liên ô rô Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu sâu để phân lập xác định thành phần hợp chất có hoạt tính dịch chiết Hoàng liên ô rô cần thiết quan trọng 43 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 52 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 53 of 169 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Về xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE Đã xác định số điều kiện tối ưu cho phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro gồm: nồng độ dung dịch chất ATCI 2,5 mM; nồng độ dung dịch thuốc thử DTNB 2,5 mM; hoạt độ enzym AChE 0,5 IU/mL; thời điểm đo độ hấp thụ mẫu thử sau phản ứng xẩy 10 phút Về đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae) Đã đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô Phân đoạn dịch chiết n-BuOH có tác dụng ức chế enzym AChE cao (IC50 = 3,38 ± 0,07 µg/mL), so với phân đoạn n-Hexan EtOAc; tác dụng ức chế enzym AChE theo kiểu động học enzym ức chế hỗn hợp, kiểu ức chế đặc trưng dược liệu Phân đoạn có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh với số ức chế Ki phân đoạn dịch chiết nhỏ (Ki = 3,416 ± 0,05 µg/mL) KIẾN NGHỊ Nghiên cứu sâu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết n-BuOH để phân tách hoạt chất tinh khiết có tiềm phòng, điều trị bệnh liên quan đến Alzheimer rối loạn thần kinh để phục vụ cho nghiên cứu khoa học ứng dụng lâm sàng Tiếp tục sàng lọc số tác dụng khác phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô đánh giá tác dụng hợp chất phân lập 44 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 53 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 54 of 169 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn Dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu phần I – II, Đại học Dược Hà Nội Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuẩt Y học Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội Vũ Kim Công, Nguyễn Thị Lang, Nông Văn Duy (2012), “Kết điều tra phân bố Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC.) khu vực núi LangBian tỉnh Lâm Đồng”, Viện Sinh học Tây Nguyên Hoàng Việt Dũng (2014), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase hai loài Piper thomsonii (C DC.) Hook f var thomsonii Piper hymenophyllum Miq., Họ Hồ tiêu (Piperaceae)”, Luận án Tiến sĩ Dược học, 121-122 Nguyễn Văn Đản, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, Nhà xuất Y học Nguyễn Thu Hằng (2001), “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng kháng khuẩn Hoàng liên ô rô mọc Đèo Gió – tỉnh Cao Bằng” Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1996 – 2001 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam 1, Nhà xuất Trẻ, Hà Nội Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất Y học 10 Trần Văn Lâm (2006), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng chống oxy hóa Hoàng liên ô rô mọc Đèo Gió – Cao Bằng Mahonia Nepalensis DC., Berberidceae”, Luận văn Thạc sĩ Dược học 11 Nguyễn Liêm, Phạm Gia Khôi, Vũ Văn Chuyên (1975), “Phát nguồn berberin số thuốc nam”, Thông báo dược liệu, (4), 158 – 159 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 54 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 55 of 169 12 13 14 15 16 17 18 19 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, 190-192 Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), “Chất lượng sống bệnh nhân Alzheimer, người chăm sóc đánh giá hiệu số biện pháp can thiệp không dùng thuốc”, Luận án Tiến sỹ Y học, 26 – 28 Nhà xuất Từ điển bách khoa Hà Nội (1999), Từ điển bách khoa Dược học, Hà Nội Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học, tập 1, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, 69-71 Nguyễn Tập (2007), “Cẩm nang Cây thuốc cần bảo vệ Việt Nam” Mạng lưới Lâm sản gỗ Việt Nam, Hà Nội, 129-130 Nguyễn Xuân Thắng (2007), Hóa sinh học, Nhà xuất Y học Trần Văn Tuấn, A J M Loonen, F M van Hasselt (2012), Dược lâm sàng – Những nguyên lý điều trị sử dụng thuốc, Nhà xuất Y học, 387 – 396 Viện dược liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội, 502-505 Tiếng Anh 20 Adewusi E A., Steenkamp V (2011), "In vitro screening for acetylcholinsterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from southern Africa", Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 829-835 21 Adsersen, A., et al (2006), “Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinsterase inhibitory activity”, Journal of Ethnopharmacology 104(3), 418-422 22 American Psychiatric Association (2013), “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”,fifth ed American Psychiatric Publishing, Arlington, VA Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 55 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 56 of 169 23 24 25 Barnes, D.E., Yaffe, K (2011), “The projected effect of risk factor reduction on Alzheimer‟s disease prevalence” Lancet Neurol 10, 819– 828 Barril, X.; Orozco, M.; Luque, F.J (2001), “Towards improved acetylcholinsterase inhibitors: a structural and computational approach”, Mini Rev Med Chem 1(3), 255-266 Bettens, K., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C (2012), “Genetic insights in Alzheimer‟s disease”, Lancet Neurol 12, 92–104 26 Bisswanger, H (2002), Enzym Kinetics: Principles and Methods, 27 28 29 30 31 32 33 WILEYVCH verlag GmbH, Weinheim, Germany Bone K, Mills S (2013), Principles and practice of phytotherapy: modern herbal medicine Elsevier Health Sciences Bretsky, P.M., Buckwalter, J.G., Seeman, T.E (1999), “Evidence for an interaction between apolipoprotein E genotype, gender, and Alzheimer disease”, Alzheimer Dis Assoc Disord 13, 216–221 Catherine Megan Crowch (2009), “Kinetics of acetylcholinsterase inhibitory activities by aqueous extracts of Acacia nilotica (L.) and Rhamnus prinoides (L‟Hér.)”, African Journal of Pharmacy and Pharmacology 3(10) 469-475 Challerjeet R (1944), “ A chemical study”, J Amer Assoc 33,210 212 Chunlaratthanaphorn S., Lertprasertsuke N., Srisawat U (2007), "Acute and subchronic toxicity study from P nigrum", Songklanakarin J Sci Technol 29,109-124 Cronquist A (1988), The evolution and classification of flowering plants, Second Edition, Bronx NY: The New York Botanical Garden Danelutte A P., Lago J H., Young M C (2003), "Antifungal flavanones and prenylated hydroquinones from Piper crassinervium Kunth", Phytochemistry 64, 555-559 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 56 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 57 of 169 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 De Oliveira Chaves M C., De Oliveira A H., De Oliveira Santos B V (2006), "Aristolactams from Piper marginatum Jacq (Piperaceae)", Biochemical Systematics and Ecology 34,75-77 Di Giovanni S., Borloz A., Urbain A (2008), “In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinsterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods”, Eur J Pharm Sci 33(2),109-119 Ellman, G.L (1961), “A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinsterase activity”, Biochemical Pharmacology 7(2), 88-95 Elzbieta Mikiciuk-Olasik (2007), “Diagnostics and therapy of Alzheimer‟s disease”, Indian Journal of Experimental Biology, 45, 325325 Essa, M.M (2012), "Neuroprotective effect of natural products against Alzheimer‟s disease" Neurochemical research 37(9):1829-1842 Ezio Giacobini (2000), Cholinesterase and cholinesterase inhibitors, London Farrer, L.A., Cupples, L.A., Haines, J.L (1997), “Effects of age, sex, and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease” JAMA 278,1349–1356 Ferri, C.P., Prince, M., Brayne, C (2005), “Global prevalence of dementia:a Delphi consensus study” Lancet 366,2112–2117 Genin, E., Hannequin, D., Wallon, D (2011), “APOE and Alzheimer disease: a major gene with semi-dominant inheritance” Mol Psychiatr 16, 903–907 Gieler U et al (1995), “Mahonia aquifolium – A new type of topical treament for psoriasis”, Journal of Dematological treament, 31 – 34 44 Govindachari R T et al (1957), “Alkaloids of Mahonia nepalensis D.C.”, J Amer Assoc., 41 – 48 Hawkins, K.I and C.E Knittle (1972), "Comparison of acetylcholinsterase determinations by the Michel and Ellman methods" Analytical chemistry 44(2),416-417 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 57 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 58 of 169 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Hippins H., Neundorfer G (2003), “The discovery of Alzheimer‟s disease”, Dialogues Clin Neurosci 5(1), 101, 105 – 107 Houghton P J., Ren Y., Howes M J (2005), "Acetylcholinsterase inhibitors from plants and fungi", Natural product report 23, 181 -199 Kása P, Rakonczay Z, Gulya K (1997), "The cholinergic system in Alzheimer's disease", Progress in neurobiology, 52(6),511-535 Khadri A., Neffati M., Smiti S (2010), "Antioxidant, antiacetylcholinsterase and antimicrobial activities of Cymbopogon schoenanthus L Spreng (lemon grass) from Tunisia", LWT - Food Science and Technology, 43,331-336 Langjae R., Bussarawit S., Yuenyongsawad S (2007), "Acetylcholinsterase-inhibiting steroidal alkaloid from the sponge Corticiu sp.", Steroids, 72,682-685 Leduc V., Domenger, D., De Beaumont, L (2011), “Function and comorbidities of apolipoprotein E in Alzheimer‟s disease” Int J Alzheimer’s Dis.http://dx.doi.org/10.4061/2011/974361 Nguyen Thi Mai, Tran Anh Tuan, Hoang Thanh Phuong (2009), “Bisbenzylisoquinoline alkaloids from Mahonia nepalensis”, Journal of Chemistry 47 (3), 368 – 373 Marston A (2010), "Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry", Journal of Chromatography A 1218, 2676-2683 Martinez (2000), “N – benzylpiperidine derivatives of 1,2,4thiadiazolidinone as new acetylcholinsterase inhibitors”, Eur J Med Chem 35(10), 913-922 Min B S., To D C., Lee J.-S et al (2010), "Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus Buds", Arch Pharm Res., 33 (10), 1665-1670 Musicco, M., Adorni, F., Di Santo, S (2013), “Inverse occurrence of cancer and Alzheimer disease” Neurology 81, 322–328 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 58 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 59 of 169 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 Pohanka, M Cholinesterases (2011), “a target of pharmacology and toxicology”, Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 155 (3), 219-229 Rollinger (2004), “Acetylcholinsterase inhibitory activity of scopolin and scopoletin discovered by virtual screening of natural products”, J Med Chem 47, 6248 – 6254 Satheeshkumar, N (2010), “Acetylcholinsterase enzym inhibitory potential of standardized extract of Trigonella foenum graecum L and its constituents”, Phytomedicine 17(3-4), 292-295 Schiff P L (1997), “Bisbenzylisoquinoline alkaloids”, J Nat Prod 60, 934 – 953 Selkoe D J (2001), "Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy" Physiological Reviews, 81(2), 741-766 Tang Z M., Wang Z Y., Kang J W (2007), "Screening of acetylcholinsterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophoretically mediated microanalysis technique", Electrophoresis 28,360-365 Van Asperen, K (1962), “A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method” Journal of Insect Physiology 8(4), 401416 Weijiu Liu (2012), Introduction to Modeling Biological Cellular Control Systems, Springer Milan Whitehouse PJ (1982), “Alzheimer‟s disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain”, (1), 45 Yang Z., Zhang X., Duan D (2009), "Modified TLC bioautographic method for screening acetylcholinsterase inhibitors from plant extracts", J.Sep Sci 32,3257-3259 Ziegler-Graham, K., Brookmeyer, R., Johnson, E., Arrighi, H.M (2008), “Worldwide variation in the doubling time of Alzheimer‟s disease incidence rates”, Alzheimers Dement 4,316–323 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 59 of 169 Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 60 of 169 PHỤ LỤC GIẢI THƢỞNG KHOA HỌC VÀ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài Khóa luận tốt nghiệp đạt Giải Nhì, Hội nghị Khoa học Sinh viên năm 2017 Khoa Y Dược, ĐH QGHN, Tiểu ban Y Dược học sở Bài báo khoa học đăng Kỷ yếu Hội nghị Tail lieu,luan van thac si , luan an tien si 60 of 169 ... 28 3.1 Chiết xuất phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô 28 3.2 Xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 28 3.3 Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro dƣợc... Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô (Mahonia Nepalensis DC., Họ Berberidaceae) với hai mục tiêu: Xây dựng phương pháp đánh giá tác. .. pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro dược liệu Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae) Tail