Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1961 bởi tác giả Ellman. Phương pháp đo quang của Ellman được nhiều tác giả trên thế giới sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE. Tuy nhiên, một số điều kiện thử nghiệm như: nồng độ cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB, hoạt độ enzym AChE, thời gian phản ứng… thường có sự khác nhau giữa các nghiên cứu, do đặc điểm và điều kiện của từng nghiên cứu. Vì vậy, hiện chưa có một
Thân cây Hoàng liên ô rô phơi khô, thái nhỏ (1kg)
Cao Ethanol (78,45g) Cao n-hexan (17,45g) Cao Ethylacetat (20,86g) Cao n-buthanol (25,06g) Chiết với Ethanol 96% (3 lần)
điều kiện tối ưu nào cho phương pháp thử này. Với mục tiêu xây dựng được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Khoa, cũng như để chủ động trong quá trình tiến hành nghiên cứu, một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp đã được khảo sát.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử được khảo sát ở 3 nồng độ là 1,25; 2,5 và 5 mM. Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử
Mẫu Độ hấp thụ quang đo đƣợc ở nồng độ cơ chất ACTI
và thuốc thử DTNB khảo sát 1,25 mM 2,5 mM 5 mM 1 0,6411 0,9890 1,1155 2 0,6502 1,0344 1,0443 3 0,6255 1,0522 1,0670 Trung bình 0,6389± 0,0125 1,0252 ± 0,0326 1,0756 ± 0,0364 t-student test p1-2=<0,001; p2-3 = 0,148; p1-3= <0,001
Từ kết quả ở bảng 3.1 cho thấy khi nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB thay đổi, độ hấp thụ của mẫu thử cũng thay đổi và tăng dần theo nồng độ cơ chất và thuốc thử. Giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp phản ứng thấp nhất khi nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB là 1,25 mM. Giữa hai mức nồng độ cơ chất và thuốc thử còn lại được khảo sát là 2,5 và 5 mM, chênh lệch về độ hấp thụ và độ lệch chuẩn tương đối không đáng kể, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p=0,148>0,05. Tuy nhiên, mức nồng độ cơ chất và thuốc thử là 2,5 mM được chọn cho những nghiên cứu khảo sát tiếp theo để giảm lượng cơ chất và thuốc thử phải dùng trong nghiên cứu nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác của các thử nghiệm. Đồng thời, mức nồng độ bằng 2,5 mM này cũng nằm trong khoảng
nồng độ của cơ chất ATCI và thuốc thử DTNB đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây lần lượt là 1-75 mM và 1,5-10 mM [35,49,50,59].
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ AChE đến phương pháp thử và lựa chọn thời điểm đo độ hấp thụ
Hoạt độ enzym AChE được khảo sát ở 3 mức hoạt độ là 0,25; 0,5 và 1,0 IU/mL. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian ở 3 mức hoạt độ enzym AChE khảo sát được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa độ hấp thụ quang và thời gian phản ứng của các hỗn hợp ở 3 mức hoạt độ enzym AChE
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy hoạt độ enzym ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng thủy phân cơ chất. Ở hoạt độ enzym 0,25 IU/mL, tốc độ phản ứng diễn ra rất chậm tương ứng với độ hấp thụ của mẫu thử là thấp nhất khi so sánh với độ hấp thụ của các mẫu thử tương tự đo ở điều kiện hoạt độ enzym cao hơn tại cùng một thời điểm. Do vậy, ở điều kiện này, kết quả thử nghiệm sẽ gặp phải sai số lớn hơn đặc biệt với những mẫu thử có tác dụng ức chế AChE mạnh. Ở hoạt độ enzym 0,5 IU/mL, tốc độ phản ứng diễn ra vừa phải. Thời gian để phản ứng đạt tới trạng thái bão hòa khoảng 10 phút. Trong khoảng thời gian từ 3-6 phút, tương quan giữa độ hấp thụ của mẫu thử và thời
5 10 15 20 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Độ hấ p thụ qua ng (Abs )
gian phản ứng là khá tuyến tính với hệ số tương quan R2 = 0,9901. Tuy nhiên, ở hoạt độ enzym 1,0 IU/mL, tốc độ phản ứng diễn ra nhanh nhất và chỉ sau khoảng 7 phút, phản ứng đã đạt tới trạng thái bão hòa. Khi tốc độ của phản ứng thủy phân được xúc tác bởi enzym AChE diễn ra quá nhanh, cùng với ảnh hưởng của những yếu tố khách quan sẽ gây sai số lớn.
Vì vậy, mức hoạt độ AChE là 0,5 IU/mL được lựa chọn sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo và thời điểm đo độ hấp thụ của mẫu thử được xác định là 10 phút sau khi phản ứng bắt đầu xẩy ra. Đồng thời, mức hoạt độ enzym là 0,5 IU/mL được lựa chọn sử dụng cũng nằm trong khoảng hoạt độ AChE đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây là từ 0,2-5,0 IU/mL [20,35,59].
Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro
Dựa vào kết quả khảo sát, đã xác định được điều kiện cho phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro như sau:
Bảng 3.2. Thành phần của hỗn hợp phản ứng STT Thành phần Thể tích (µL) 1 Đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0) 700 2 Mẫu thử 100 3 AChE 100 4 DTNB 50 5 ACTI 50 Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng 1000
Quy trình của phương pháp đánh giá tác dụng enzym AChE được tiến hành như sau:
Hỗn hợp phản ứng bao gồm 700 µL dung dịch đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0); 100 µL dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và 100 µL dung dịch enzym AChE 0,5 IU/mL. Trộn đều và đem ủ 15 phút tại 25oC. Các phân đoạn dịch chiết được thử và chất chuẩn dương (Berberin chloride) được hòa tan trong methanol. Sau đó, thêm 50 µL dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 µL dung dịch ACTI 2,5 mM và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong 10 phút ở 25oC. Sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm. Tất cả các
thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Berberin clorid được sử dụng làm chứng dương. Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức CT1.
Hình 3.3. Sơ đồ quy trình phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE
Quy trình phương pháp xác định đặc điểm động học ức chế enzym AChE
Động học ức chế enzym AChE của phân đoạn dich chiết có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất được tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây. Hỗn hợp phản ứng gồm 700 µL dung dịch đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8.0); 100 µL dung dịch thử ở các nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH
700 µL dd đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8) 100 µL mẫu thử ở các nồng độ khác nhau 100 µL dd enzym AChE 0,5 IU/mL Hỗn hợp, trộn đều, ủ 15 phút (25oC) 50 µL dd DNTB 2,5 mM 50 µL dd ACTI 2,5 mM Trộn đều, ủ 10 phút (25oC) Đo độ hấp thụ quang ở 412nm
(0; 2,5; 5 và 10 µg/mL) và 100 µL dung dịch enzym AChE 0,5 IU/mL. Trộn đều và đem ủ 15 phút tại 25oC. Sau đó, thêm 50 µL dung dịch DTNB 2,5 mM và 50 µL với các nồng độ khác nhau của cơ chất ACTI (1,25; 2,5; 5 mM) và trộn đều. Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch thu được ở bước sóng 412 nm trong vòng 5 phút. Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym. Từ đồ thị Dixon plot, hằng số ức chế Ki
được xác định là điểm giao của các đường [nồng độ phân đoạn dịch chiết n- BuOH] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) trên trục Ox.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});