dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)
Bệnh Alzheimer là chứng mất trí nhớ phổ biến nhất trên thế giới liên quan đến lão hóa. Ở nhiều nước, các loại thuốc thảo dược truyền thống được sử dụng để ngăn ngừa hoặc điều trị các rối loạn thoái hóa thần kinh, và một số đã được phát triển thành thực phẩm chức năng và thuốc dùng trên lâm sàng. Các triệu chứng xuất hiện do lắng đọng các mảng β-amyloid và các đám rối thần kinh [18]. Bệnh lý học của bệnh Alzheimer liên quan đến sự thiếu hụt Acetylcholin trong não. Để điều trị, người ta nâng cao chức năng cholinergic bằng việc sử dụng chất ức chế AChE nhằm cải thiện một phần bệnh tật. AChE nằm ở synap hệ thần kinh trung ương và vai trò chính là thủy phân ACh, thành choline và acid acetic. Ức chế enzym AChE là một trong các đích quan trọng để điều trị các chứng rối loạn thần kinh và để tìm kiếm các hợp chất mới trong điều trị Alzheimer [48]. ACh là một trong những chất dẫn truyền thần kinh quan trọng nhất trong hệ thống thần kinh trung ương và
ngoại biên, do vậy khả năng ức chế enzym AChE đóng vai trò như một marker sinh học chỉ điểm liên quan đến các rối loạn thần kinh.
Tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô được nghiên cứu ở 25o
C bằng phương pháp Ellman. Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholine iodide. Khi acetylthiocholine iodide bị thủy phân do enzym AChE tạo ra thiocholin và chất này phản ứng với 5-5‟- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo ra sản phẩm màu vàng. Kết quả cho thấy tác dụng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch chiết tăng dần theo nồng độ. Phân đoạn dịch chiết n-BuOH và dịch chiết tổng EtOH cho thấy có tác dụng ức chế cao nhất với giá trị IC50 tương ứng là 3,38 ± 0.07 µg/mL và 12,08 ± 0,33 µg/mL. Tiếp theo là phân đoạn n-hexan có giá trị IC50 là 23,51 ± 1,21 µg/mL. Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp nhất với IC50 là 126,74 ± 2,16 µg/mL, so với IC50 của chất chuẩn dương berberin clorid là 0,282 ± 0,03 µg/mL. Từ các kết quả này cho thấy, các chất có tác dụng ức chế enzym AChE tập trung nhiều trong phân đoạn dịch chiết n-BuOH, so với các phân đoạn khác n-Hexan và EtOAc. Do vậy, trong phân đoạn dịch chiết n-BuOH có khả năng chứa nhiều các hợp chất sinh học có tác dụng ức chế enzym AChE.
Động học ức chế enzym AChE của dịch chiết từ cây Hoàng liên ô rô chưa được nghiên cứu trước đây. Ngoài ra, do phân đoạn dịch chiết n-BuOH có giá trị IC50 thấp nhất trong các phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô (tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất) nên chúng tôi sử dụng phân đoạn dịch chiết này để nghiên cứu động học ức chế enzym AChE. Đồ thị Lineweaver– Burk mô tả động học ức chế enzym của phân đoạn dịch chiết n-BuOH. Đồ thị động học Lineweaver–Burk trong hình 3.7 có tính chất trung gian giữa 2 kiểu ức chế cạnh tranh và không cạnh tranh, cho thấy kiểu ức chế của phân đoạn dịch chiết n-BuOH là kiểu ức chế hỗn hợp [17,26] (trong đồ thị Lineweaver– Burk thì hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km).
Đồ thị động học Dixon trong hình 3.9 có tính chất đặc trưng của chất ức chế cạnh tranh [17,26,64]. Hằng số ức chế Ki được xác định là giá trị tuyệt đối từ điểm giao của 3 đường trên trục Ox trên đồ thị Dixon, được vẽ theo
1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH. Giá trị Ki
được xác định theo đồ thị Dixon trong hình 3.9 là 3,416 ± 0,05 µg/mL. Ki là hằng số ức chế enzym cho phép đánh giá độ mạnh yếu của chất ức chế. Ki còn gọi là hằng số phân ly của phức hợp Enzym – Chất ức chế (E – I) không hoạt động và biểu hiện tác dụng ức chế. Nếu phức hợp E – I có khuynh hướng dễ tách ra (Ki cao) enzym sẽ tự do hoạt động bình thường, do vậy hiệu quả ức chế sẽ yếu. Nếu hằng số Ki nhỏ, chất ức chế bị liên kết chặt với enzym nên lượng enzym hoạt động sẽ nhỏ, do vậy tác dụng ức chế mạnh [26,64]. Phân đoạn n-BuOH của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô có giá trị hằng số Ki nhỏ chứng tỏ có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh.
Kiểu ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế đặc trưng của dược liệu, nguyên nhân là do trong thành phần dịch chiết có chứa một loạt các hợp chất có nhiều cơ chế tác dụng khác nhau [27]. Cơ chế ức chế cho thấy các hợp chất có hoạt tính trong phân đoạn dịch chiết n-BuOH có thể cạnh tranh với ACTI để gắn vào trung tâm hoạt động – vị trí liên kết với cơ chất của enzym AChE hoặc kết hợp với enzym AChE hoặc kết hợp với phức hợp AChE-ACTI. Trong trường hợp ACTI ở nồng độ cao, các hợp chất có hoạt tính trong phân đoạn dịch chiết có thể liên kết vào một vùng nhất định (không phải trung tâm hoạt động) của enzym AChE, làm biến đổi cấu hình phân tử enzym khiến enzym không liên kết được với cơ chất. Điều này được khẳng định khi quan sát trên đồ thị thấy giá trị Kmax tăng và Vmax giảm khi nồng độ phân đoạn dịch chiết n- BuOH tăng.
Phân đoạn n-BuOH của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất trong các phân đoạn dịch chiết. Tuy nhiên, kết quả này có thể là do tác dụng hiệp đồng của nhiều hợp chất trong phân đoạn dịch chiết này. Vì vậy, cần tiếp tục phân lập các thành phần mang hoạt tính và làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của chúng. Nghiên cứu của chúng tôi là nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô. Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để phân lập và xác định thành phần các hợp chất có hoạt tính trong dịch chiết cây Hoàng liên ô rô là rất cần thiết và quan trọng.
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Về xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE
Đã xác định được một số điều kiện tối ưu cho phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro gồm: nồng độ dung dịch cơ chất ATCI là 2,5 mM; nồng độ dung dịch thuốc thử DTNB là 2,5 mM; hoạt độ enzym AChE là 0,5 IU/mL; thời điểm đo độ hấp thụ của mẫu thử là sau khi phản ứng xẩy ra là 10 phút.
2. Về đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của dƣợc liệu Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)
Đã đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên ô rô. Phân đoạn dịch chiết n-BuOH có tác dụng ức chế enzym AChE cao nhất (IC50 = 3,38 ± 0,07 µg/mL), so với các phân đoạn n-Hexan và EtOAc; tác dụng ức chế enzym AChE theo kiểu động học enzym ức chế hỗn hợp, một kiểu ức chế đặc trưng của dược liệu. Phân đoạn này có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh với hằng số ức chế Ki của phân đoạn dịch chiết nhỏ (Ki = 3,416 ± 0,05 µg/mL).
KIẾN NGHỊ
1. Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết n-BuOH để phân tách được hoạt chất tinh khiết có tiềm năng trong phòng, điều trị các bệnh liên quan đến Alzheimer và rối loạn thần kinh để phục vụ cho nghiên cứu khoa học và ứng dụng trên lâm sàng.
2. Tiếp tục sàng lọc một số tác dụng khác của các phân đoạn dịch chiết cây Hoàng liên ô rô và đánh giá tác dụng của các hợp chất phân lập được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ môn Dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu phần I – II, Đại học Dược Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuẩt bản Y học.
3. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
4. Vũ Kim Công, Nguyễn Thị Lang, Nông Văn Duy (2012), “Kết quả điều tra phân bố cây Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC.) ở khu vực núi LangBian tỉnh Lâm Đồng”, Viện Sinh học Tây Nguyên.
5. Hoàng Việt Dũng (2014), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase của hai loài
Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii và Piper
hymenophyllum Miq., Họ Hồ tiêu (Piperaceae)”, Luận án Tiến sĩ Dược học, 121-122.
6. Nguyễn Văn Đản, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu
hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học.
7. Nguyễn Thu Hằng (2001), “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của cây Hoàng liên ô rô mọc ở Đèo Gió – tỉnh Cao Bằng”. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 1996 – 2001.
8. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam quyển 1, Nhà xuất bản Trẻ,
Hà Nội.
9. Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất bản Y học.
10. Trần Văn Lâm (2006), “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa của cây Hoàng liên ô rô mọc ở Đèo Gió – Cao Bằng Mahonia Nepalensis DC., Berberidceae”, Luận văn Thạc sĩ
Dược học.
11. Nguyễn Liêm, Phạm Gia Khôi, Vũ Văn Chuyên (1975), “Phát hiện nguồn berberin ở một số cây thuốc nam”, Thông báo dược liệu, 7 (4), 158 – 159.
12. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, 190-192.
13. Nguyễn Thị Bích Ngọc (2014), “Chất lượng cuộc sống của bệnh nhân Alzheimer, người chăm sóc và đánh giá hiệu quả của một số biện pháp can thiệp không dùng thuốc”, Luận án Tiến sỹ Y học, 26 – 28.
14. Nhà xuất bản Từ điển bách khoa Hà Nội (1999), Từ điển bách khoa
Dược học, Hà Nội.
15. Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, Nguyễn Trọng Thông (2011), Dược lý học, tập 1, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, 69-71. 16. Nguyễn Tập (2007), “Cẩm nang Cây thuốc cần bảo vệ ở Việt Nam”
Mạng lưới Lâm sản ngoài gỗ Việt Nam, Hà Nội, 129-130.
17. Nguyễn Xuân Thắng (2007), Hóa sinh học, Nhà xuất bản Y học.
18. Trần Văn Tuấn, A. J. M. Loonen, F. M. van Hasselt (2012), Dược lâm
sàng – Những nguyên lý cơ bản trong điều trị và sử dụng thuốc, Nhà
xuất bản Y học, 387 – 396.
19. Viện dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, 502-505.
Tiếng Anh
20. Adewusi E. A., Steenkamp V. (2011), "In vitro screening for acetylcholinsterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from southern Africa", Asian Pacific Journal of Tropical
Medicine, 829-835.
21. Adsersen, A., et al. (2006), “Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinsterase inhibitory activity”, Journal of Ethnopharmacology 104(3), 418-422.
22. American Psychiatric Association (2013), “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”,fifth ed. American Psychiatric Publishing, Arlington, VA.
23. Barnes, D.E., Yaffe, K. (2011), “The projected effect of risk factor reduction on Alzheimer‟s disease prevalence”. Lancet Neurol 10, 819– 828.
24. Barril, X.; Orozco, M.; Luque, F.J. (2001), “Towards improved acetylcholinsterase inhibitors: a structural and computational approach”, Mini Rev. Med. Chem 1(3), 255-266.
25. Bettens, K., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. (2012), “Genetic insights in Alzheimer‟s disease”, Lancet Neurol. 12, 92–104.
26.
Bisswanger, H. (2002), Enzym Kinetics: Principles and Methods, WILEYVCH verlag GmbH, Weinheim, Germany.27. Bone K, Mills S. (2013), Principles and practice of phytotherapy:
modern herbal medicine. Elsevier Health Sciences.
28. Bretsky, P.M., Buckwalter, J.G., Seeman, T.E. (1999), “Evidence for an interaction between apolipoprotein E genotype, gender, and Alzheimer disease”, Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 13, 216–221.
29. Catherine Megan Crowch (2009), “Kinetics of acetylcholinsterase inhibitory activities by aqueous extracts of Acacia nilotica (L.) and Rhamnus prinoides (L‟Hér.)”, African Journal of Pharmacy and
Pharmacology 3(10). 469-475.
30. Challerjeet R. (1944), “ A chemical study”, J. Amer. Assoc. 33,210 -
212.
31. Chunlaratthanaphorn S., Lertprasertsuke N., Srisawat U. (2007), "Acute and subchronic toxicity study from P. nigrum", Songklanakarin
J. Sci. Technol 29,109-124.
32. Cronquist A. (1988), The evolution and classification of flowering
plants, Second Edition, Bronx NY: The New York Botanical Garden.
33. Danelutte A. P., Lago J. H., Young M. C. (2003), "Antifungal flavanones and prenylated hydroquinones from Piper crassinervium Kunth", Phytochemistry 64, 555-559.
34. De Oliveira Chaves M. C., De Oliveira A. H., De Oliveira Santos B. V. (2006), "Aristolactams from Piper marginatum Jacq (Piperaceae)",
Biochemical Systematics and Ecology 34,75-77.
35. Di Giovanni S., Borloz A., Urbain A. (2008), “In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinsterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods”, Eur J Pharm Sci 33(2),109-119.
36. Ellman, G.L. (1961), “A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinsterase activity”, Biochemical Pharmacology 7(2), 88-95. 37. Elzbieta Mikiciuk-Olasik (2007), “Diagnostics and therapy of
Alzheimer‟s disease”, Indian Journal of Experimental Biology, 45, 325- 325.
38. Essa, M.M. (2012), "Neuroprotective effect of natural products against Alzheimer‟s disease". Neurochemical research 37(9):1829-1842.
39. Ezio Giacobini (2000), Cholinesterase and cholinesterase inhibitors, London.
40. Farrer, L.A., Cupples, L.A., Haines, J.L. (1997), “Effects of age, sex, and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease”. JAMA 278,1349–1356.
41. Ferri, C.P., Prince, M., Brayne, C. (2005), “Global prevalence of dementia:a Delphi consensus study”. Lancet 366,2112–2117.
42. Genin, E., Hannequin, D., Wallon, D. (2011), “APOE and Alzheimer disease: a major gene with semi-dominant inheritance”. Mol. Psychiatr.
16, 903–907.
43. Gieler U et al (1995), “Mahonia aquifolium – A new type of topical treament for psoriasis”, Journal of Dematological treament, 31 – 34. 44 44. Govindachari R. T. et al (1957), “Alkaloids of Mahonia nepalensis
D.C.”, J. Amer. Assoc., 41 – 48.
45. Hawkins, K.I. and C.E. Knittle (1972), "Comparison of acetylcholinsterase determinations by the Michel and Ellman methods".
46. Hippins H., Neundorfer G (2003), “The discovery of Alzheimer‟s disease”, Dialogues Clin Neurosci 5(1), 101, 105 – 107.
47. Houghton P. J., Ren Y., Howes M. J. (2005), "Acetylcholinsterase inhibitors from plants and fungi", Natural product report 23, 181 -199. 48. Kása P, Rakonczay Z, Gulya K (1997), "The cholinergic system in
Alzheimer's disease", Progress in neurobiology, 52(6),511-535.
49. Khadri A., Neffati M., Smiti S. (2010), "Antioxidant, antiacetylcholinsterase and antimicrobial activities of Cymbopogon schoenanthus L. Spreng (lemon grass) from Tunisia", LWT - Food
Science and Technology, 43,331-336.
50. Langjae R., Bussarawit S., Yuenyongsawad S. (2007), "Acetylcholinsterase-inhibiting steroidal alkaloid from the sponge Corticiu sp.", Steroids, 72,682-685.
51. Leduc V., Domenger, D., De Beaumont, L. (2011), “Function and comorbidities of apolipoprotein E in Alzheimer‟s disease”. Int. J.
Alzheimer’s Dis.http://dx.doi.org/10.4061/2011/974361.
52. Nguyen Thi Mai, Tran Anh Tuan, Hoang Thanh Phuong (2009), “Bisbenzylisoquinoline alkaloids from Mahonia nepalensis”, Journal
of Chemistry 47 (3), 368 – 373.
53. Marston A. (2010), "Thin-layer chromatography with biological
detection in phytochemistry", Journal of Chromatography A 1218,
2676-2683.
54. Martinez (2000), “N – benzylpiperidine derivatives of 1,2,4- thiadiazolidinone as new acetylcholinsterase inhibitors”, Eur J Med Chem 35(10), 913-922.
55. Min B. S., To D. C., Lee. J.-S. et al (2010), "Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus Buds", Arch. Pharm. Res., 33 (10), 1665-1670.
56. Musicco, M., Adorni, F., Di Santo, S. (2013), “Inverse occurrence of cancer and Alzheimer disease”. Neurology 81, 322–328.
57. Pohanka, M. Cholinesterases (2011), “a target of pharmacology and toxicology”, Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech.
Repub 155 (3), 219-229.
58. Rollinger (2004), “Acetylcholinsterase inhibitory activity of scopolin and scopoletin discovered by virtual screening of natural products”, J.
Med. Chem 47, 6248 – 6254.
59. Satheeshkumar, N. (2010), “Acetylcholinsterase enzym inhibitory potential of standardized extract of Trigonella foenum graecum L and its constituents”, Phytomedicine 17(3-4), 292-295.
60. Schiff P. L. (1997), “Bisbenzylisoquinoline alkaloids”, J. Nat. Prod 60, 934 – 953.
61. Selkoe D. J. (2001), "Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy"
Physiological Reviews, 81(2), 741-766.
62. Tang Z. M., Wang Z. Y., Kang J. W. (2007), "Screening of acetylcholinsterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophoretically mediated microanalysis technique", Electrophoresis
28,360-365.
63. Van Asperen, K. (1962), “A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method” Journal of Insect Physiology 8(4), 401- 416.
64. Weijiu Liu (2012), Introduction to Modeling Biological Cellular
Control Systems, Springer Milan.
65. Whitehouse PJ. (1982), “Alzheimer‟s disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain”, 1 (1), 45.
66. Yang Z., Zhang X., Duan D. (2009), "Modified TLC bioautographic method for screening acetylcholinsterase inhibitors from plant extracts", J.Sep. Sci. 32,3257-3259.
67. Ziegler-Graham, K., Brookmeyer, R., Johnson, E., Arrighi, H.M. (2008), “Worldwide variation in the doubling time of Alzheimer‟s
