xác định mã vạch adn và xây dựng qui trình định lượng friedelin trong cây sâm đất côn đảo (parietaria debilis g forst , urticaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ MẪU XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG CÂY SÂM ĐẤT CƠN ĐẢO (PARIETARIA DEBILIS G.FORST., URTICACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ Nguyễn Thị Mẫu XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG CÂY SÂM ĐẤT CÔN ĐẢO (PARIETARIA DEBILIS G FORST., URTICACEAE) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN MINH PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN Hồ Chí Minh - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC – KHÓA 2017 – 2019 Ngành Kiểm nghiệm thuốc Độc chất – Mã số: 8720210 XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG CÂY SÂM ĐẤT CƠN ĐẢO ( PARIETARIA DEBILIS G FORST., URTICACEAE) Nguyễn Thị Mẫu Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Văn Minh PGS.TS Trần Cơng Luận Từ khóa: Sâm đất Cơn Đảo, Parietaria debilis, friedelin, mã vạch ADN, matK, ITS, rcbL Mở đầu Sâm đất Côn Đảo sử dụng nhiều dân gian với quy mơ ngày rộng Tuy nhiên chưa có báo cáo khoa học việc định danh, thành phần hóa học, tác dụng dược lý Sâm đất Côn Đảo Đề tài tiến hành nhằm mục đích góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm ngun liệu phục vụ cho nghiên cứu sau Đối tượng phương pháp nghiên cứu Khảo sát đặc điểm hình thái; đặc điểm vi phẫu thân, lá, cuống lá, rễ củ; đặc điểm bột mặt đất, bột rễ củ Sâm đất Côn Đảo Xác định thành phần hóa thực vật theo quy trình cải tiến từ quy trình Ciuley (Rumani) Chiết xuất AND tổng số, khuếch đại giải trình tự đoạn gen ITS – rADN, matK, rcbL Sâm đất Côn Đảo Xác định độ tinh khiết bột rễ củ Sâm đất Côn Đảo theo DĐVN V Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất thẩm định quy trình định lượng friedelin theo hướng dẫn ICH Kết Mô tả đặc điểm thực vật học Sâm đất Côn Đảo Xác định rễ Sâm đất Cơn Đảo có chứa chất béo, triterpenoid tự do, flavonoid, tannin, saponin, chất khử hợp chất polyuronid Khuếch đại giải trình tự thành cơng vùng gen ITS - rADN kích thước 703 bp, matK kích thước 875 bp, rcbL kích thước 633 bp lồi Sâm đất Cơn Đảo Quy trình định lượng friedelin thẩm định theo hướng dẫn ICH đạt tính đặc hiệu, tính tuyến tính (R2=0,9987), độ lặp lại (RSD = 1,89%), độ từ 99,74 đến 100,44% cho phép ứng dụng để định lượng friedelin rễ củ Sâm đất Côn Đảo Kết hàm lượng friedelin rễ củ Sâm đất CĐ 0,0740 ± 0,0008% tính khối lượng dược liệu khô Kết luận Đề tài đưa kết quan trọng phục vụ cho cơng tác định danh lồi Parietaria debilis G Forst., Urticaceae sau Master’s Thesis of Pharmaceutical – Acedemic course 2017 – 2019 Speciality: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210 INDENTIFICATION OF DNA BARCODES AND DEVELOPMENT OF A PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF FRIEDELIN IN PARIETARIA DEBILIS G FORST., URTICACEAE Nguyen Thi Mau Supervisor: Dr Le Van Minh Assoc Prof Dr Tran Cong Luan Key words: Parietaria debilis, friedelin, DNA barcode, matK, ITS, rcbL Introduction: Parietaria debilis G Forst., Urticaceae is a well – known herb in Con Dao, Ba Ria-Vung Tau There has been no documents regulating about identification, chemical composition and pharmacological effects of the P debilis The purpose of the research is contribution to build the P debilis raw materials standard Objects and method of study Investigating botany of P debilis content description, microsurgery of leaf, petiole, trunk, tuberous roots, characteristics of shoot system and tuberous roots powder Determining chemical composition of P debilis tuberous roots by following an improved procedure from the procedure of Ciuley (Rumani) Extraction of the total DNA, amplified and sequenced genes ITS - rADN, matK, rcbL of P debilis Determining the purity of tuberous roots powder according to Viet Nam pharmacopoeia V Constructing the procedure to extract friedelin from P debilis tuberous roots, investigating solvent and time The analytical procedure was evaluated according to ICH guidelines Result Botanical properties of P debilis were determined P debilis tuberous roots extract were found to be good sources of lipid, free triterpenoid, flavonoid, tannin, saponin and polyuronid compounds Amplification and sequence success for barcoding regions: ITS - rDNA length of 703 bp, matK length of 875 bp, rcbL length of 633 bp The method to determine friedelin has specificity, good linearity with R2 = 0,9987, accuracy was in the range from 99,74-100,44%, repeatability had RSD% = 1,89% The developed method was applied to the P debilis tuberous roots, the result showed that it contained 0,0740±0,0008% friedelin Conclussion The research gave important results for identification of P debilis in the future ii MỤC LỤC MỤC LỤC II DANH MỤC HÌNH .VI DANH MỤC BẢNG VIII DANH MỤC SƠ ĐỒ .IX DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT X LỜI CẢM ƠN XI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC Họ Urticaceae Chi Parietaria Loài Parietaria debilis G.Forst 1.2 TỔNG QUAN VỀ HÓA HỌC Thành phần hóa học họ Urticaceae Thành phần hóa học chi Parietaria Thành phần hóa học lồi Parietaria debilis G.Forst 1.3 TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ Tác dụng dược lý họ Urticaceae Tác dụng dược lý chi Parietaria Tác dụng dược lý loài Parietaria debilis G.Forst iii 1.4 PHƯƠNG PHÁP CHỈ THỊ MÃ VẠCH Giới thiệu phương pháp mã vạch ADN Các barcode thực vật thường sử dụng Quy trình xác định mã vạch ADN 10 1.5 FRIEDELIN 14 1.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC 15 Các thông số đặc trưng phương pháp HPLC 15 Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình định lượng chất chiết dược liệu 16 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 Mẫu chuẩn 19 Mẫu thử 19 2.2 TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 19 Trang thiết bị 19 Dụng cụ 20 Hóa chất 20 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 Khảo sát thực vật học 21 Xác định đoạn mã vạch ADN cho lồi Sâm đất Cơn đảo 21 Khảo sát thành phần hóa thực vật 24 iv 2.4 THỬ TINH KHIẾT 26 2.5 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ 30 3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC 30 Đặc điểm hình thái 30 Bóc tách biểu bì 32 Đặc điểm vi phẫu 33 Đặc điểm bột dược liệu 39 3.2 XÁC ĐỊNH ĐOẠN MÃ VẠCH ADN 41 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu nghiên cứu 41 Khuếch đại đoạn ADN mã vạch quan tâm 41 Phân tích trình tự nucleotid đoạn ADN nhân 42 3.3 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT 46 3.4 THỬ TINH KHIẾT 47 Xác định độ ẩm 47 Xác định độ tro toàn phần 47 Xác định độ tro không tan acid 47 3.5 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 47 Khảo sát điều kiện chiết xuất 48 Thẩm định quy trình phân tích 51 Quy trình định lượng friedelin mẫu rễ củ Sâm đất CĐ 57 v 3.6 BÀN LUẬN 59 Khảo sát thực vật học 59 Khảo sát thành phần hóa thực vật 59 Xác định đoạn mã vạch ADN 59 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 KẾT LUẬN 61 ĐỀ NGHỊ 61 TAI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 69 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các vùng gen thực vật Hình 1.2 Công thức cấu tạo friedelin 14 Hình 2.1 Nguyên vật liệu 19 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái loài Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace 31 Hình 3.2 Hoa thức hoa đồ hoa 32 Hình 3.3 Hoa thức hoa đồ hoa đực 32 Hình 3.4 Lơng che chở biểu bì thân 32 Hình 3.5 Biểu bì thân với nhiều lơng tiết 32 Hình 3.6 Biểu bì 33 Hình 3.7 Biểu bì có nhiều bào thạch 33 Hình 3.8 Lỗ khí kiểu hỗn bào biểu bì 33 Hình 3.9 Vi phẫu cắt ngang rễ củ Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace 35 Hình 3.10 Vi phẫu cắt ngang thân Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace 36 Hình 3.11 Vi phẫu cắt ngang Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace 37 Hình 3.12 Vi phẫu cắt ngang cuống Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace 38 Hình 3.13 Thành phần bột toàn thân mặt đất Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace 39 Hình 3.14 Thành phần bột rễ củ Parietaria debilis G.Forst., Urticaceace 40 Hình 3.15 Kết chạy điện di 41 Hình 3.16 Kết điện di đồ vùng gen ITS-rADN 43 Hình 3.17 Kết điện di đồ vùng gen matK 44 Hình 3.18 Kết điện di đồ vùng gen rcbL 45 Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu thử chiết methanol 50% 49 Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu thử chiết methanol 80% 49 Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu thử chiết methanol 100% 49 PL13 PL14 PL15 Phụ lục Phổ COSY friedelin PL16 PL17 PL18 Phụ lục Phổ NOESY friedelin PL19 PL20 PL21 PL22 Phụ lục Phổ DEFT friedelin PL23 Phụ lục Phiếu định danh Phụ lục 10 Kết giải trình tự barcode ITS-rADN TAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTG CGGNAGGATCATTGTCGAAACCTGCTAAGCAGAACAACCAGCGA ACATGTTTACAATTATCTCGACGTGTTTTTTGGCCTTTCGGGGCCA CAAACTCGCCGTGTGTCGGGGGCCCCTGACAACTAACAAATTTTA GCGCGGAATGCGCCAAGGAAATATTTAAGGAGATCGATAGCGAT CCACATTGGGGGTGACCCCGGGTGAGATTACTATCGTTCGACTGC TTCTAATCTTAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCA TCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCA GAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAG GCCGTCAGGTTGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACGCACCGTTG CCCCGTTGTACAAACCCGGCACTAACGGGATTTGGTAATGGGGC GGAAAATGGCCTCCCATGCGCTTGTTCTTGTGGTTGGCTTAAAAA TTGCGTCACTGGCTATGTTTTCAGCGACATTCGGTGGTTTCGTTCA ATCGGTGCCCCGTCGCGATGTCAAAGCTCTGTGACTCCAACTCAA GACCCCAAGGCGTATCGATGTTTTTGTCGGTGCGCCCTAATTGAG ACCCCAGGTCAGGCGGGGCTACCCGCTGAGT Phụ lục 11 Kết giải trình tự barcode matK AAATTCCTACATTTAAATTATGTATCAGATGTTCTAATACCCTACC CGATTCATCTGGAAATCTTAGTTCAAACCCTTCGTTACTGGGTAA AAGATGCTTCCTCTTTGTATTTATTATGTTTTTTTATTTATGAGTAT TCTAGTTTTAATTGGAATAGTCTTATTATTACAAACAAATTTCTAG CTAAATCTATTTCTATTTTTTCAAAAAGTAATCCAAGATTTTTTTT GTTTCTGTATAATTCTCATCTTTCTGAATACGAATCCATCTTACTT TTTCTCCGCAACAAATCTTCTCATTTACGATTAACAACTTTTGGTG TTTTTTTTGAGCGAATTTTTTTATATGTAAAAATAAAGCCTTCCGT AGAAGACGCCCTTGCTAATGATTTTCCGATCAGCCTATGGTTTCT ACAGGATCTGTTTATGCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCAAT TCTGGCTTTAACGAATATGCCTCTTTTGATAAATAAATGGAAAAA GTTCTTTGTACATTTATGGCAATATCATTTTTATGTGTGGTCTCAA TCAGGAAGGATGTATATAAATCAATTATGCAATCGTTCCCTTGGC TTTTTGGGTTATCTTTCAAGTATGCGAATAAATCTTTCGGTGGTAC GGACCAAAATGGCAGAAATTTCATTTATAACGGATAATTCTATAA AGAAGATTGATACATTAATTCCAAAGAGTACTCTGATTGGATCGT TGGCTAAAATTAAATTTTGTAATGTATTAGGACATCCCGTTAGTA AGTCAACTTGGGTCGATTTATCGGATTTTGAGATTATTGATCGAT TTGTGCGTATATGCAGAAATATTTTTCATTATTACAGTGGATCCTC AAAAAAAAA Phụ lục 12 Kết giải trình tự barcode rbcL TAAAGCAAGTGTTGGATTCAAAGCTGGTGTTAAAGATTATAAATT GACGTATTACACTCCCGAATATGAAACCAAAGATACTGATATTTT AGCAGCATTTCGAGTAACTCCTCAACCTGGAGTTCCCCCTGAAGA AGCAGGGGCTGCGGTAGCAGCTGAATCTTCTACTGGTACGTGGA CAACTGTATGGACTGACGGACTTACCAGTCTTGATCGCTACAAAG GTAGATGCTACCACATCGAGCCTGTTGCTGGAGAAGAAAATCAA TATATTGCTTATGTAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTT CTGTTACTAACATGTTTACTTCCATTGTGGGCAATGTATTTGGGTT CAAGGCCCTGCGCGCGCTACGTCTGGAGGATTTGCGAATCCCTAC TGCTTACATTAAAACTTTCCAAGGCCCGCCGCATGGTATCCAAGT TGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGCCGGCCCCTATTGGGAT GTACTATTAAACCTAAATTGGGGTTATCCGCTAAGAATTATGGTA GAGCAGTTTATGAATGTCTTCGCGGTGGACTTGATTTTACCAAAG ATGATGAGAACGTGAATTCTCAACCATTTATGCGGTGGAGAGATC GTTT ... (4R,4aS,6aS,6aS,6bR,8aR,12aR,14aS,14bS)- 4,4 a,6a,6b,8a,1 1,1 1,1 4aoctamethyl- 2,4 , 5,6 ,6 a, 7,8 , 9,1 0,1 2,1 2a,1 3,1 4,1 4b-tetradecahydro-1H-picen-3one Friedelin có tác dụng giảm đau, kháng viêm, hạ sốt Friedelin. .. XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG CÂY SÂM ĐẤT CÔN ĐẢO ( PARIETARIA DEBILIS G FORST. , URTICACEAE) Nguyễn Thị Mẫu Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Văn Minh PGS.TS...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - BỘ Y TẾ Nguyễn Thị Mẫu XÁC ĐỊNH MÃ VẠCH ADN VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FRIEDELIN TRONG CÂY SÂM ĐẤT CÔN ĐẢO (PARIETARIA DEBILIS