Biến nạp plasmid pGII0229 trgus cp148 luc vào vi khuẩn agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây jatropha curcas l

Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha cursas L.” được thực hiện từ 1512012 đến 1072012 tại viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm với mục đích xác định một kỹ thuật phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao.Có nhiều phương pháp được sử dụng để chuyển gen ở thực vật, trong đó sử dụng vi khuẩn đất Agrobacterium để chuyển gen là một trong những phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ khả năng gắn gen ngoại lai vào tế bào một cách chính xác và ổn định. Bằng cách đó có thể nhanh chóng tạo ra những giống cây trồng mang tính trạng mong muốn.Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc mang do Jabcobsen thiết kế mang các gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA được ly trích từ vi khuẩn và biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580. Vi khuẩn sau khi biến nạp đã được sàng lọc trên môi trường có chứa kháng sinh kanamycin và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc. Kết quả kiểm tra vi khuẩn cho thấy có sự hiện diện của plasmid và gen mục tiêu trên plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực hiện việc chuyển gen. Hạt giống Jatropha của Úc được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen. Mẫu phôi Jatropha được thu nhận từ hạt được tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn sau khi biến nạp. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen như nguồn mẫu, thời gian ngâm mẫu, nồng độ acetosyringone đã được khảo sát với mục đích tìm ra được quy trình chuyển gen hiệu quả nhất. Kết quả nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dương tính đối với thuốc thử Xgluc khá cao ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 41,67 – 75%. Nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS đạt 70,87% tuy không phải là nghiệm thức cao nhất nhưng lại ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu. Mẫu phôi tiền nuôi cấy hai ngày cho tỷ lệ biểu hiện GUS (66,67%) cao hơn so với mẫu phôi không tiền nuôi cấy (54,17%) và ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu hơn. Phương pháp xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha đang nảy mầm với ưu điểm không trải qua bước nuôi cấy in vivo được thực hiện bằng ba cách: tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào hạt, chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm, lắc hạt với dịch khuẩn. Kết quả bước đầu sau khi nhuộm GUS cho thấy tỉ lệ biểu hiện GUS từ 40 – 60%, sau khi sàng lọc với PPT ở nồng độ 400 mgl, thu được 5% cây giả định được chuyển gen (15 cây).Quá trình loại bỏ vi khuẩn sau khi lây nhiễm với mẫu chưa hiệu quả. Các loại kháng sinh cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin không có khả năng loại bỏ vi khuẩn một cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm. 

LỜI CẢM ƠN Để trưởng thành đạt kết ngày hôm nay, trước tiên xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ba-Mẹ hai em bên cạnh, động viên, cảm ơn đại Gia đình quan tâm, lo lắng cho con. Gia đình động lực giúp vượt qua khó khăn sống. Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí quan tâm, tận tình bảo cho em ý tưởng, định hướng đề tài, tạo điều kiện tốt cho em trình làm đề tài. Em xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ trực tiếp hướng dẫn tận tình truyền đạt cho em kiến thức quý báu. Xin cảm ơn người bạn nhóm nghiên cứu: Tuấn, Tài, Quyết, Linh, Hiền hỗ trợ trình làm đề tài. Cảm ơn người bạn thân thiết bên cạnh, chia sẻ niềm vui, nỗi buồn suốt bốn năm đại học. Cảm ơn tập thể lớp DH08SH cho kỷ niệm đẹp thời sinh viên quan tâm, động viên lúc làm đề tài. Cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM tạo điều kiện cho em bốn năm học tập trường. Các Thầy-Cô dạy dỗ Quí Thầy-Cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học truyền đạt cho em kiến thức chuyên ngành bổ ích. Em trân trọng giúp đỡ ban lãnh đạo Viện anh chị làm việc Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học Môi Trường tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này. Xin cảm ơn dự án SIDA/SAREC Công nghệ Sinh học hỗ trợ kinh phí thực đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! TÓM TẮT Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu Jatropha cursas L.” thực từ 15/1/2012 đến 10/7/2012 viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm với mục đích xác định kỹ thuật phù hợp để chuyển gen vào Jatropha đạt hiệu cao. Có nhiều phương pháp sử dụng để chuyển gen thực vật, sử dụng vi khuẩn đất Agrobacterium để chuyển gen phương pháp hiệu phổ biến nhờ khả gắn gen ngoại lai vào tế bào cách xác ổn định. Bằng cách nhanh chóng tạo giống trồng mang tính trạng mong muốn. Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc mang Jabcobsen thiết kế mang gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin gen thị gusA ly trích từ vi khuẩn biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580. Vi khuẩn sau biến nạp sàng lọc môi trường có chứa kháng sinh kanamycin kiểm tra kỹ thuật PCR khuẩn lạc. Kết kiểm tra vi khuẩn cho thấy có diện plasmid gen mục tiêu plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực việc chuyển gen. Hạt giống Jatropha Úc sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen. Mẫu phôi Jatropha thu nhận từ hạt tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn sau biến nạp. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen nguồn mẫu, thời gian ngâm mẫu, nồng độ acetosyringone khảo sát với mục đích tìm quy trình chuyển gen hiệu nhất. Kết nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dương tính thuốc thử X-gluc cao tất nghiệm thức biến thiên từ 41,67 – 75%. Nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu GUS đạt 70,87% nghiệm thức cao lại ảnh hưởng đến sức sống mẫu. Mẫu phôi tiền nuôi cấy hai ngày cho tỷ lệ biểu GUS (66,67%) cao so với mẫu phôi không tiền nuôi cấy (54,17%) ảnh hưởng đến sức sống mẫu hơn. Phương pháp xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha nảy mầm với ưu điểm không trải qua bước nuôi cấy in vivo thực ba cách: tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào hạt, chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm, lắc hạt với dịch khuẩn. Kết bước đầu sau nhuộm GUS cho thấy tỉ lệ biểu GUS từ 40 – 60%, sau sàng lọc với PPT nồng độ 400 mg/l, thu 5% giả định chuyển gen (15 cây). Quá trình loại bỏ vi khuẩn sau lây nhiễm với mẫu chưa hiệu quả. Các loại kháng sinh cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin khả loại bỏ vi khuẩn cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm. SUMMARY The topic: “Transfomation of plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc into Agrobacterium tumefaciens and establishment of gene transformation protocol for Jatropha curcas L.”. A. tumefaciens is established as a vector for gene transfomation in many plants. The use of Agrobacterium to transfer genes into plants could simplify the transformation and improvement of important crop plants. A. tumefaciens harboring a binary vector pGII0229 Trgus cp148 luc carrying βglucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator was provided by Jacobsen. Plasmid was isolated and transformed into A. tumefaciens strain GV3580. The presence of binary plasmid and bar gene were screened by clonies selection on LB media supplemented with kanamycin and confirmed by colony’PCR. An efficient system for A. tumefaciens mediated transformation of Jatropha curcas was developed in this study. Several factors affecting the transformation efficiency were optimized, including preculture periods, usage of acetosyringone and dipping time of explant in Agrobacterium suspension. A genetic transformation procedure for J.curcas was established via Agrobacterium tumefaciens infection of embryo explants. Trangenic embryo were confirmed by the GUS assay. The percent tage of transient GUS expression was higher in 2-day precultured embryo explant (66,67%) as compared to embryo explant (54,17%) and less impact on the vitality of explants. 2-day precultured embryo explants were transformed by co-cultivation with Agrobacterium. After days of co-cultivation, the transient GUS expression shown in all treatments. Results showed that positive rate for X-gluc reagent was high in all treatments ranged from 41,67 – 75%. Concentration of acetosyringone 100 μM, coincubated in Agrobacterium suspension for 30 mins resulted transient GUS activity (70,83%), was found the best treatment. The germinating seeds were injected with A. tumefaciens, followed by sonication, co-cultivation with shaking, and injection. Compared with transformation of embryo, that of germinating seeds was simple and repeatable, since it required no prior tissue culture steps and produced transgenic plants more efficiently. The embryo of the germinating seed was demonstrated by the detection of β-glucuronidase activity in the primary transformants. T0 seedlings were screened by PPT selection at 400 mg/l. About 5% of T0 seedlings examined were found to be transgenic. The elimination of the bacteria after cocultivation process was not efficient. The antibiotic cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin could not remove bacteria effectively lead to re-infection. MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt .ii Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt .x Danh sách bảng xi Danh sách hình sơ đồ .xii Phần 1. MỞ ĐẦU .1 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Yêu cầu 1.3. Nội dung thực Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1. Sơ lược đặc điểm Jatropha .3 2.1.1. Phân loại .3 2.1.2. Nguồn gốc phân bố .3 2.1.3. Đặc điểm hình thái – đặc tính sinh học .3 2.1.4. Các ưu điểm sinh học giá trị Jatropha .4 2.1.4.1.Ý nghĩa mặt kinh tế, xã hội .4 2.1.4.2. Ý nghĩa mặt môi trường .5 2.1.4.3. Sử dụng làm phân bón thức ăn gia súc 2.1.4.4. Công dụng chữa trị bệnh .5 2.2. Hiện tượng biến nạp 2.2. Phương pháp biến nạp vi khuẩn 2.2.1. Giới thiệu phương pháp biến nạp .6 2.2.2. Cơ chế biến nạp 2.2.3. Vai trò biến nạp .6 2.3. Giới thiệu chung phương pháp chuyển gen thực vật .6 2.3.1. Khái niệm .6 2.3.2. Thành phần gen chuyển nạp 2.3.2.1. Promoter terminator .7 2.3.2.2. Gen thông báo .8 2.3.2.3. Chỉ thị chọn lọc .8 2.3.3. Một số phương pháp chuyển gen thực vật .8 2.3.3.1. Chuyển nạp gen phương pháp PGE .9 2.3.3.2. Chuyển nạp gen phương pháp sử dụng xung điện 2.3.3.3. Chuyển gen phương pháp bắn gen 2.3.3.4. Chuyển gen vi tiêm 10 2.3.3.5. Chuyển gen phương pháp SAAT – chuyển gen gián tiếp sử dụng Agrobacterium với hỗ trợ sóng siêu âm .10 2.3.3.6. Một số phương pháp chuyển gen in vivo 11 2.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium .12 2.4.1. Phân loại .12 2.4.2. Đặc điểm hình thái, di truyền gây bệnh 12 2.4.3. Ti plasmid .13 2.4.3.1. Vùng T-DNA 13 2.4.3.2. Vùng gen vir 14 2.4.4. Cơ chế phân tử trình xâm nhiễm chuyển gen vào thực vật 14 2.4.5. Acetosyringone vai trò trình xâm nhiễm 16 2.4.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen .16 2.4.6.1. Vật liệu chuyển gen 17 2.4.6.2. Dòng vi khuẩn .17 2.4.6.3. Nhiệt độ .18 2.4.6.4. Chất hoạt động bề mặt 18 2.4.6.5. Kháng sinh 18 2.4.6.6. Thời gian đồng nuôi cấy mật số vi khuẩn .19 2.4.6.7. Các yếu tố ảnh hưởng khác .20 2.5. Các phương pháp kiểm tra chuyển gen 20 2.5.1. Phương pháp thử GUS .20 2.5.2. Phương pháp thử khả kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ PPT 20 2.5.3. Sử dụng PCR đánh giá kết chuyển gen thục vật .21 2.5.4. Phương pháp Southern blot xác định gen ngoại lai gene 21 2.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen Việt Nam 22 2.7. Một số nghiên cứu nước chuyển gen vào Jatropha .24 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 3.1. Thời gian địa điểm .27 3.2. Vật liệu thí nghiệm 27 3.2.1. Giống 27 3.2.2. Chủng vi khuẩn vector chuyển gen 27 3.2.3. Hóa chất .28 3.2.3.1. Hóa chất dùng hệ thống tái sinh 28 3.2.3.2. Hóa chất dùng biến nạp chuyển gen 28 3.2.3.3. Hóa chất phản ứng PCR 28 3.2.4. Thiết bị dùng thí nghiệm 28 3.3. Phương pháp thí nghiệm .29 3.3.1. Khảo sát khả diệt khuẩn loại kháng sinh cefotaxim, meropenem ciprofloxacin lên chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101 .29 3.3.2. Tạo dòng vi khuẩn mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc .30 3.3.2.1. Kiểm tra diện plasmid pGII0229 Trgus cp148 .30 3.3.2.2. Chuẩn bị tế bào khả nạp 31 3.3.2.3. Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 31 3.3.2.4. Kiểm tra diện plasmid gen bar chủng vi khuẩn GV3580 sau biến nạp 32 3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng PPT đến sinh trưởng Jatropha in vivo 33 3.3.4. Lây nhiễm mẫu Jatropha với vi khuẩn A. tumefaciens 34 3.3.4.1. Chuẩn bị vi khuẩn .34 3.3.4.2. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào phôi J.curcas .34 3.3.4.3. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào hạt Jatropha nảy mầm .36 3.3.5. Xử lý số liệu .37 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1. Kết khảo sát khả diệt khuẩn ba loại kháng sinh .38 4.2. Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang gen bar 41 4.2.1. Kết kiểm tra diện plasmid vi khuẩn 41 4.2.2. Kết biến nạp plasmid vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens GV3580 42 4.3. Kết khảo sát ảnh hưởng PPT lên sinh trưởng Jatropha in vivo 43 4.4. Kết khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen vào phôi 44 4.4.1. Kết khảo sát ảnh hưởng mẫu tiền nuôi cấy không tiền nuôi cấy lên hiệu chuyển gen .44 4.4.2. Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu nồng độ acetosyringone đến hiệu chuyển gen vi khuẩn A. tumefaciens .46 4.5. Kết chuyển gen vào hạt Jatropha nảy mầm .49 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1 Kết luận 53 5.2. Đề nghị 53 TÀI LIÊU THAM KHẢO .55 Phụ lục DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens J. curcas Jatropha curcas Linn bxn bromoxynil nitrilase nptII neomycin phospho transferase AS Acetosyringone PAT phosphinothricin acetyl transferase PEG polyethylene glycol IBA Indolebutyric acid BA 6-benzyl adenin GA3 Gibberellic acid NT Nghiệm thức BAP 6-benzyl aminopurine NAA α-naphthaleneacetic acid IAA indole-3-acetic acid Ti-plasmid Tumor-inducing plasmid vir Virulence OD Mật độ quang (Optical density) PPT DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid gusA β–glucuronidase X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide DNA Deoxiribonucleic Acid PCR Polymerase Chain Reaction bp base pair g gram mg miligram l lit ml mililit µl microlit mM miliMol µM microMol 10 Sangwan ctv, 1992; Michughen ctv 1989 (trích dẫn He ctv, 2008) cho mẫu trình tiền nuôi cấy kết hợp với phytohormones có môi trường xúc tiến phân chia tế bào. Hoạt động phân chia tế bào có ảnh hưởng đến trình nhận xác nhập T-DNA. Vì thời điểm tốt cho vi khuẩn xâm nhiễm vào mẫu. Dựa vào tỷ lệ biểu GUS số lượng mẫu sống sau đồng nuôi cấy hai ngày, cho mẫu tiền nuôi cho hiệu chuyển nạp gen cao nghiệm thức chọn để làm nguồn vật liệu để khảo sát hai thông số nồng độ acetosyringone thời gian ngâm mẫu. B A Hình 4.6 Mẫu phôi Jatropha sau đồng nuôi cấy ngày với vi khuẩn A. tumefaciens; A. Mẫu tiền nuôi cấy; B. Mẫu không tiền nuôi cấy. 4.4.2. Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu nồng độ acetosyringone đến hiệu chuyển gen vi khuẩn A. tumefaciens Theo Shahla Donald (1987) acetosyringone chất hỗ trợ đắc lực giúp tăng hiệu biến nạp chuyển nạp gen Agrobacterium. Tuy nhiên, đối tượng thực vật khác thích ứng với chất nồng độ khác nhau. Hiệu acetosyringone thể qua số mẫu dương tính với thuốc thử GUS số mẫu sống sót sau ngày đồng nuôi cấy. Kết phân tích thống kê (bảng 4.4) cho thấy không bổ sung acetosyringone, tỷ lệ biểu GUS tăng theo thời gian ngâm mẫu, khác biệt ý nghĩa nghiệm thức. Ở nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu GUS cao nhất, bổ sung 200 µM acetosyringone biểu GUS cao lại 45 phút. Tuy nhiên trường hợp 61 khác nghiệm thức ý nghĩa mặt thống kê, có khác biệt lớn so với nghiệm thức ngâm mẫu 15 phút. Số lượng mẫu có biểu màu xanh chàm đặc trưng cao tổng số mẫu quan sát NT9, 75%, NT5 (70,83 %), NT6, NT8 (66,67%) thấp NT1 (41,67%) NT4 (45,83%). Dựa vào kết xử lý thấy có khác biệt NT9 nhóm nghiệm thức lại, cho thấy hai yếu tố thời gian ngâm mẫu nồng độ acetosyringone ảnh hưởng đến biểu GUS (P < 0,05). Bảng 4.4 Kết nhuộm GUS nghiệm thức chuyển gen Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 Nồng độ acetosyringone (µM) 100 200 Thời gian ngâm mẫu 15 30 45 15 30 45 15 30 45 Tỷ lệ mẫu biểu gen gusA (%) 41,67c 58,33abc 54,17bc 45,83c 70,87ab 66,67ab 54,17bc 66,67ab 7500a Trong cột số trung bình có ký tự khác biệt mặt thống kê mức P[...]... qua vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen vào cây Jatropha l hướng đi cần thiết Đề tài: Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha curcas L. ” được thực hiện nhằm xác định kỹ thuật phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao Từ nghiên cứu này, có thể phát triển các nghiên cứu chuyển nạp những gen khác vào cây Jatropha. .. .20 Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc .27 Hình 3.2 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc .27 Hình 3.3 Quy trình khử trùng hạt Jatropha 29 Hình 3.4 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 32 Hình 3.5 Sơ đồ các bước quy trình nhuộm GUS 35 Hình 4.1 Kết quả điện di plasmid pGII0229 từ vi khuẩn 41 Hình 4.2 Khuẩn l c vi khuẩn A tumefaciens GV3580... nhằm cải thiện năng suất, tăng sản l ợng dầu trong hạt và tăng tính chống chịu của cây Jatropha curcas L 1.2 Yêu cầu - Biến nạp thành công plasmid pGII0229 cp148 luc vào chủng vi khuẩn A tumefaciens GV3580 - L y nhiễm chủng vi khuẩn A tumefaciens GV3580 đã được biến nạp plasmid thành công với mẫu cây cọc rào ( J curcas L. ) - Kiểm chứng kết quả chuyển gen vào mô cây Jatropha bằng kỹ thuật nhuộm GUS 1.3... sát khả năng diệt vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA101 của ba loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và ciprofloxacin - Tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc Tiến hành l y nhiễm vi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào mẫu phôi và mẫu hạt nảy mầm, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp - Phân tích mẫu đã tiến hành chuyển gen bằng phương... thể chuyển gen và cho phép đo l ờng mức độ biểu hiện của gen ngoại lai Gen gusA của vi khuẩn E.coli thường được sử dụng l m gen thông báo Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase Enzyme này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành sản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng Glucuronidae thường dùng l 5–bromo–4– chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc) Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase... của vi khuẩn vào DNA tế bào thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) 2.4.3.2 Vùng gen vir Quá trình vận chuyển T-DNA l sự phối hợp nhịp nhàng bởi hoạt động của các protein được mã hóa trong vùng gen vir (vùng gen gây bệnh) của Ti plasmid và một số gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn Vùng gen vir dài 30 – 40 kb bao gồm ít nhất 6 operon quan trọng (virA, virB, virC, virD, virE, virG) và 2 operon... 1974, Miller và ctv ứng dụng phương pháp chuyển gen SAAT trên mô rễ cây Vicia faba; đến năm 1990 Joersbo và Brunstedt chuyển vào protoplast của Nicotiana tabacum và Beta vulgaris, Trick và Finer thực hiện trên cây đậu nành, bắp, l a mì vào năm 1997, v.v Gần đây, một số nghiên cứu của Zaochang Liu và ctv (2005) trên hạt Phaseolus vulgaris L. , Byong-Jin Park và ctv (2005) trên Raphanus sativus L đã kết... vọng chuyển những gen có ý nghĩa kinh tế vào cây trồng, kỹ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen Tuy nhiên hiệu quả chuyển gen vào mô thực vật bằng Agrobacterium chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, và quy trình tái sinh cây chuyển gen rất khó, tốn thời gian, cây dễ sinh những biến dị bất thường (Larkin và Scowcroft, 1981) và thường mất khả năng sinh sản (Scholl và ctv,... thống Ti plasmid Bên cạnh đó còn có các phương pháp chuyển gen trực tiếp khác như phương pháp PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp sử dụng xung điện (electroporation), phương pháp bắn gen (biolistic) và một vài kỹ thuật mới 2.3.3.1 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol) Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật l n thực... được điều đó vào một thời kỳ cụ thể trong chu kỳ sinh trưởng khi chúng tạo ra một loại protein đặc biệt gọi l yếu tố khả biến Ở giai đoạn này, vi khuẩn được gọi l khả nạp Một số loài vi khuẩn không có khả năng thu nhận DNA một cách tự nhiên nhưng ta có thể tạo ra tính khả nạp in vitro bằng cách ngâm các tế bào vào dung dịch calcium chloride l nh đông Vi c biến nạp đoạn DNA vào tế bào khả nạp được thực . tài: Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha cursas L. ” được thực hiện từ 15/1/2012 đến 10/7/2012 tại vi n Nghiên. l do trên, vi c sử dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen vào cây Jatropha l hướng đi cần thiết. Đề tài: Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn. ciprofloxacin. - Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc. - Tiến hành l y nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào mẫu phôi và mẫu