Biến nạp plasmid pGII0229 trgus cp148 luc vào vi khuẩn agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây jatropha curcas l

Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha cursas L.” được thực hiện từ 1512012 đến 1072012 tại viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm với mục đích xác định một kỹ thuật phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao.Có nhiều phương pháp được sử dụng để chuyển gen ở thực vật, trong đó sử dụng vi khuẩn đất Agrobacterium để chuyển gen là một trong những phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ khả năng gắn gen ngoại lai vào tế bào một cách chính xác và ổn định. Bằng cách đó có thể nhanh chóng tạo ra những giống cây trồng mang tính trạng mong muốn.Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc mang do Jabcobsen thiết kế mang các gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA được ly trích từ vi khuẩn và biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580. Vi khuẩn sau khi biến nạp đã được sàng lọc trên môi trường có chứa kháng sinh kanamycin và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc. Kết quả kiểm tra vi khuẩn cho thấy có sự hiện diện của plasmid và gen mục tiêu trên plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực hiện việc chuyển gen. Hạt giống Jatropha của Úc được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen. Mẫu phôi Jatropha được thu nhận từ hạt được tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn sau khi biến nạp. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen như nguồn mẫu, thời gian ngâm mẫu, nồng độ acetosyringone đã được khảo sát với mục đích tìm ra được quy trình chuyển gen hiệu quả nhất. Kết quả nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dương tính đối với thuốc thử Xgluc khá cao ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 41,67 – 75%. Nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS đạt 70,87% tuy không phải là nghiệm thức cao nhất nhưng lại ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu. Mẫu phôi tiền nuôi cấy hai ngày cho tỷ lệ biểu hiện GUS (66,67%) cao hơn so với mẫu phôi không tiền nuôi cấy (54,17%) và ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu hơn. Phương pháp xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha đang nảy mầm với ưu điểm không trải qua bước nuôi cấy in vivo được thực hiện bằng ba cách: tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào hạt, chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm, lắc hạt với dịch khuẩn. Kết quả bước đầu sau khi nhuộm GUS cho thấy tỉ lệ biểu hiện GUS từ 40 – 60%, sau khi sàng lọc với PPT ở nồng độ 400 mgl, thu được 5% cây giả định được chuyển gen (15 cây).Quá trình loại bỏ vi khuẩn sau khi lây nhiễm với mẫu chưa hiệu quả. Các loại kháng sinh cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin không có khả năng loại bỏ vi khuẩn một cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm. 

LỜI CẢM ƠN

Để trưởng thành và đạt được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên con xin gửilòng biết ơn sâu sắc đến Ba-Mẹ và hai em đã luôn bên cạnh, động viên, cảm ơn cả đạiGia đình luôn quan tâm, lo lắng cho con Gia đình luôn là động lực giúp con vượt quanhững khó khăn trong cuộc sống

Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí đã quan tâm, tận tình chỉbảo và cho em những ý tưởng, định hướng đề tài, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho emtrong quá trình làm đề tài

Em cũng xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ đã trực tiếp hướng dẫn tậntình và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu

Xin cảm ơn những người bạn trong nhóm nghiên cứu: Tuấn, Tài, Quyết, Linh,Hiền đã hỗ trợ tôi trong quá trình làm đề tài

Cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ những niềm vui,nỗi buồn cùng tôi trong suốt bốn năm đại học

Cảm ơn tập thể lớp DH08SH đã cho mình những kỷ niệm đẹp của thời sinh viên

và luôn quan tâm, động viên nhau trong lúc làm đề tài

Cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện cho

em trong bốn năm học tập tại trường Các Thầy-Cô đã từng dạy dỗ và Quí Thầy-Côthuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyênngành bổ ích

Em rất trân trọng sự giúp đỡ của ban lãnh đạo Viện cùng các anh chị làm việc tạiViện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học và Môi Trường đã tạo điều kiện cho em hoànthành khóa luận này

Xin cảm ơn dự án SIDA/SAREC về Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ kinh phí thựchiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi

khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha cursas L.” được thực hiện từ 15/1/2012 đến 10/7/2012 tại viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh

Học và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm với mục đích xác định một kỹ thuật

phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao.

Có nhiều phương pháp được sử dụng để chuyển gen ở thực vật, trong đó sử dụng

vi khuẩn đất Agrobacterium để chuyển gen là một trong những phương pháp hiệu quả

và phổ biến nhất hiện nay nhờ khả năng gắn gen ngoại lai vào tế bào một cách chínhxác và ổn định Bằng cách đó có thể nhanh chóng tạo ra những giống cây trồng mangtính trạng mong muốn

Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc mang do Jabcobsen thiết kế mang các gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA được ly trích từ vi khuẩn và biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580 Vi khuẩn sau khi biến

nạp đã được sàng lọc trên môi trường có chứa kháng sinh kanamycin và kiểm tra bằng

kỹ thuật PCR khuẩn lạc Kết quả kiểm tra vi khuẩn cho thấy có sự hiện diện củaplasmid và gen mục tiêu trên plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt yêu cầu để thực hiện việcchuyển gen

Hạt giống Jatropha của Úc được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen Mẫu phôi Jatropha được thu nhận từ hạt được tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn sau

khi biến nạp Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen như nguồn mẫu, thờigian ngâm mẫu, nồng độ acetosyringone đã được khảo sát với mục đích tìm ra đượcquy trình chuyển gen hiệu quả nhất Kết quả nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dương tính đốivới thuốc thử X-gluc khá cao ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 41,67 – 75%.Nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS đạt70,87% tuy không phải là nghiệm thức cao nhất nhưng lại ít ảnh hưởng đến sức sốngcủa mẫu Mẫu phôi tiền nuôi cấy hai ngày cho tỷ lệ biểu hiện GUS (66,67%) cao hơn

so với mẫu phôi không tiền nuôi cấy (54,17%) và ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫuhơn

Phương pháp xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha đang nảy mầm với ưu điểm không trải qua bước nuôi cấy in vivo được thực hiện bằng ba cách: tiêm trực tiếp dịch

khuẩn vào hạt, chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm, lắc hạt với dịch khuẩn Kết quảbước đầu sau khi nhuộm GUS cho thấy tỉ lệ biểu hiện GUS từ 40 – 60%, sau khi sànglọc với PPT ở nồng độ 400 mg/l, thu được 5% cây giả định được chuyển gen (15 cây).Quá trình loại bỏ vi khuẩn sau khi lây nhiễm với mẫu chưa hiệu quả Các loạikháng sinh cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin không có khả năng loại bỏ vi khuẩnmột cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm

The topic: “Transfomation of plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc into

Agrobacterium tumefaciens and establishment of gene transformation protocol for Jatropha curcas L.”

A tumefaciens is established as a vector for gene transfomation in many plants The use of Agrobacterium to transfer genes into plants could simplify the

transformation and improvement of important crop plants

A tumefaciens harboring a binary vector pGII0229 Trgus cp148 luc carrying glucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator was provided by Jacobsen Plasmid was isolated and transformed into A tumefaciens strain GV3580 The presence of binary plasmid and bar gene were screened by

β-clonies selection on LB media supplemented with kanamycin and confirmed bycolony’PCR

An efficient system for A tumefaciens mediated transformation of Jatropha curcas was developed in this study Several factors affecting the transformation

efficiency were optimized, including preculture periods, usage of acetosyringone and

dipping time of explant in Agrobacterium suspension A genetic transformation procedure for J.curcas was established via Agrobacterium tumefaciens infection of

embryo explants Trangenic embryo were confirmed by the GUS assay The percenttage of transient GUS expression was higher in 2-day precultured embryo explant(66,67%) as compared to embryo explant (54,17%) and less impact on the vitality ofexplants

2-day precultured embryo explants were transformed by co-cultivation with

Agrobacterium After 2 days of co-cultivation, the transient GUS expression shown in

all treatments Results showed that positive rate for X-gluc reagent was high in alltreatments ranged from 41,67 – 75% Concentration of acetosyringone 100 μM, co-

incubated in Agrobacterium suspension for 30 mins resulted transient GUS activity

(70,83%), was found the best treatment

The germinating seeds were injected with A tumefaciens, followed by sonication,

co-cultivation with shaking, and injection Compared with transformation of embryo,that of germinating seeds was simple and repeatable, since it required no prior tissueculture steps and produced transgenic plants more efficiently The embryo of thegerminating seed was demonstrated by the detection of β-glucuronidase activity in theprimary transformants T0 seedlings were screened by PPT selection at 400 mg/l.About 5% of T0 seedlings examined were found to be transgenic

The elimination of the bacteria after cocultivation process was not efficient Theantibiotic cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin could not remove bacteria effectivelylead to re-infection

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình và sơ đồ xii

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về các đặc điểm cây Jatropha 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái – đặc tính sinh học 3

2.1.4 Các ưu điểm sinh học và giá trị cây Jatropha 4

2.1.4.1.Ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội 4

2.1.4.2 Ý nghĩa về mặt môi trường 5

2.1.4.3 Sử dụng làm phân bón và thức ăn gia súc 5

2.1.4.4 Công dụng trong chữa trị bệnh 5

2.2 Hiện tượng biến nạp 5

2.2 Phương pháp biến nạp ở vi khuẩn 5

2.2.1 Giới thiệu về phương pháp biến nạp 6

2.2.2 Cơ chế biến nạp 6

2.2.3 Vai trò của biến nạp 6

2.3 Giới thiệu chung về phương pháp chuyển gen ở thực vật 6

2.3.1 Khái niệm 6

2.3.2 Thành phần gen chuyển nạp 7

2.3.2.1 Promoter và terminator 7

2.3.2.2 Gen thông báo 8

2.3.2.3 Chỉ thị chọn lọc 8

2.3.3 Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật 8

2.3.3.1 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PGE 9

2.3.3.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện 9

2.3.3.3 Chuyển gen bằng phương pháp bắn gen 9

2.3.3.4 Chuyển gen bằng vi tiêm 10

2.3.3.5 Chuyển gen bằng phương pháp SAAT – chuyển gen gián tiếp sử dụng Agrobacterium với sự hỗ trợ sóng siêu âm 10

2.3.3.6 Một số phương pháp chuyển gen in vivo 11

2.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 12

2.4.1 Phân loại 12

2.4.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh 12

2.4.3 Ti plasmid 13

2.4.3.1 Vùng T-DNA 13

2.4.3.2 Vùng gen vir 14

2.4.4 Cơ chế phân tử của quá trình xâm nhiễm và chuyển gen vào thực vật 14

2.4.5 Acetosyringone và vai trò trong quá trình xâm nhiễm 16

2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen 16

2.4.6.1 Vật liệu chuyển gen 17

2.4.6.2 Dòng vi khuẩn 17

2.4.6.3 Nhiệt độ 18

2.4.6.4 Chất hoạt động bề mặt 18

2.4.6.5 Kháng sinh 18

2.4.6.6 Thời gian đồng nuôi cấy và mật số vi khuẩn 19

2.4.6.7 Các yếu tố ảnh hưởng khác 20

2.5 Các phương pháp kiểm tra cây chuyển gen 20

2.5.1 Phương pháp thử GUS 20

2.5.2 Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ PPT 20

2.5.3 Sử dụng PCR đánh giá kết quả chuyển gen ở thục vật 21

2.5.4 Phương pháp Southern blot xác định các gen ngoại lai trong bộ gene cây 21

2.6 Tình hình nghiên cứu cây chuyển gen tại Việt Nam 22

2.7 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chuyển gen vào cây Jatropha 24

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

3.1 Thời gian và địa điểm 27

3.2 Vật liệu thí nghiệm 27

3.2.1 Giống 27

3.2.2 Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen 27

3.2.3 Hóa chất 28

3.2.3.1 Hóa chất dùng trong hệ thống tái sinh 28

3.2.3.2 Hóa chất dùng trong biến nạp và chuyển gen 28

3.2.3.3 Hóa chất phản ứng PCR 28

3.2.4 Thiết bị dùng trong thí nghiệm 28

3.3 Phương pháp thí nghiệm 29

3.3.1 Khảo sát khả năng diệt khuẩn của 3 loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và ciprofloxacin lên chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA101 29

3.3.2 Tạo dòng vi khuẩn mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 30

3.3.2.1 Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 30

3.3.2.2 Chuẩn bị tế bào khả nạp 31

3.3.2.3 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 31

3.3.2.4 Kiểm tra sự hiện diện của plasmid và gen bar trong chủng vi khuẩn GV3580 sau khi biến nạp 32

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến sự sinh trưởng của cây Jatropha in vivo 33

3.3.4 Lây nhiễm mẫu Jatropha với vi khuẩn A tumefaciens 34

3.3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn 34

3.3.4.2 Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào phôi J.curcas 34

3.3.4.3 Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm 36

3.3.5 Xử lý số liệu 37

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của ba loại kháng sinh 38

4.2 Tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang gen bar 41

4.2.1 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong vi khuẩn 41

4.2.2 Kết quả biến nạp plasmid vào chủng vi khuẩn A tumefaciens GV3580 42

4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng cây Jatropha in vivo 43

4.4 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào phôi 44

4.4.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen 44

4.4.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và nồng độ acetosyringone đến hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn A tumefaciens 46

4.5 Kết quả chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm 49

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

5.1 Kết luận 53

5.2 Đề nghị 53

TÀI LIÊU THAM KHẢO 55 Phụ lục

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

J curcas Jatropha curcas Linn

PAT phosphinothricin acetyl transferase

Ti-plasmid Tumor-inducing plasmid

PPT DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid

X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR 32

Bảng 3.2 Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR 33

Bảng 4.1 Kết quả rửa mẫu với ba loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và cyprofloxacin ở các nồng độ và thời gian khác nhau 40

Bảng 4.2 Nồng độ plasmid ly trích từ vi khuẩn Agrobacterium chủng EHA101 43

Bảng 4.3 Kết quả biểu hiện GUS ở mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy 45

Bảng 4.4 Kết quả nhuộm GUS ở các nghiệm thức chuyển gen 47

Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha nảy mầm 50

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L .3

Hình 2.2 Chuyển gen bằng phương pháp SAAT .11

Hình 2.3 Vi khuẩn A tumefaciens 12

Hình 2.4 Cấu trúc của Ti Plasmid 13

Hình 2.5 Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A tumefaciens 16

Hình 2.6 Phản ứng tạo màu X-gluc dưới tác dụng của enzyme β–glucuronidase 20

Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 27

Hình 3.2 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc 27

Hình 3.3 Quy trình khử trùng hạt Jatropha 29

Hình 3.4 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 32

Hình 3.5 Sơ đồ các bước quy trình nhuộm GUS 35

Hình 4.1 Kết quả điện di plasmid pGII0229 từ vi khuẩn 41

Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn A tumefaciens GV3580 42

Hình 4.3 Kết quả của phản ứng PCR khuẩn lạc khuếch đại gen bar 43

Hình 4.4 Kết quả thử PPT trên cây Jatropha 3 tuần tuổi 44

Hình 4.5 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy 45

Hình 4.6 Mẫu phôi Jatropha đồng nuôi cấy 2 ngày với vi khuẩn 46

Hình 4.7 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày 48

Hình 4.8 Mẫu phôi Jatropha ở nồng độ acetosyringone và thời gian khác nhau 49

Hình 4.9 Biểu hiện GUS khi tiến hành xâm nhiễm vào hạt 51

Hình 4.10 Cây Jatropha sau khi được sàng lọc bằng ở nồng độ PPT 400 mg/l 52

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bước vào thế kỷ 21, thế giới phải đối diện với hai mối lo lớn là lương thực vànăng lượng Kỹ thuật tạo giống cổ điển kiểu Mendel đòi hỏi nhiều thời gian và phảitrải qua nhiều thế hệ mới có thể chọn lọc được những tính trạng mong muốn Côngnghệ biến đổi gene trên cây trồng ra đời cho phép nhanh chóng tạo ra giống mới cónăng suất, chất lượng và khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt bằng cách cùnglúc đưa vào những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,không chỉ giữa các loài có họ hàng gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau

Có nhiều phương pháp được sử dụng để chuyển gen ở thực vật như: bắn gen, vitiêm, phương pháp polyethylene glycol, v.v mỗi phương pháp có ưu điểm riêng tùy

vào loại cây Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen vào thực vật là một

trong những phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ khả năng gắn genngoại lai vào tế bào một cách chính xác và ổn định Vì vậy đây là một phương phápđược lựa chọn cho các nghiên cứu cơ bản về thực vật, là kỹ thuật chính để tạo ra câychuyển gen trong lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp (Stafford, 2000; Gelvin,2003) Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển những gen có ý nghĩa kinh tế vào câytrồng, kỹ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của

gen Tuy nhiên hiệu quả chuyển gen vào mô thực vật bằng Agrobacterium chịu ảnh

hưởng bởi nhiều yếu tố, và quy trình tái sinh cây chuyển gen rất khó, tốn thời gian,cây dễ sinh những biến dị bất thường (Larkin và Scowcroft, 1981) và thường mất khảnăng sinh sản (Scholl và ctv, 1981; Ulianietal và ctv, 1996)

Những năm gần đây, nhu cầu năng lượng ngày càng tăng, trong khi nguồn nănglượng chính là dầu mỏ đang cạn kiệt dần Vì vậy cần nghiên cứu phát triển và sớmđưa vào khai thác cũng như sử dụng các nguồn năng lượng mới

Diesel sinh học được chiết xuất từ hạt cây cọc rào được xem là một nguồn nhiênliệu sạch có thể thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt dần Cây

Jatropha curcas với một số ưu điểm so với các loài cây cho dầu khác vì có thể chịu được điều kiện khắc nghiệt Việc phát hiện ra cây Jatropha curcas đã tạo ra một bước

tiến lớn trong lĩnh vực năng lượng và nhiên liệu mới

Tuy nhiên việc phổ biến và ứng dụng dầu của Jatropha còn thấp do giới hạn về năng suất dầu chứa trong hạt thấp Đến nay năng suất hạt của Jatropha vẫn còn là vấn

đề khó khăn, phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác nhau như môi trường (Openshaw,2000), đặc điểm phân nhánh của cây (Achten và ctv, 2009), di truyền học (Ginwal vàctv, 2004), và chăm sóc (Gour, 2006) Sản lượng hạt bị hạn chế bởi một số yếu tố môitrường (abiotic stresses), đặc biệt là lạnh và hạn hán Vì vậy đòi hỏi cần có các công

cụ di truyền, chọn giống hiệu quả

Từ những lý do trên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium để chuyển gen vào cây Jatropha là hướng đi cần thiết Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha curcas L.” được thực hiện nhằm xác định kỹ thuật phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao Từ nghiên cứu này,

có thể phát triển các nghiên cứu chuyển nạp những gen khác vào cây Jatropha nhằm

cải thiện năng suất, tăng sản lượng dầu trong hạt và tăng tính chống chịu của cây

- Kiểm chứng kết quả chuyển gen vào mô cây Jatropha bằng kỹ thuật nhuộm GUS.

1.3 Nội dung thực hiện

- Khảo sát khả năng diệt vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA101 của ba loại kháng

sinh cefotaxim, meropenem và ciprofloxacin

- Tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc.

- Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus

cp148 luc vào mẫu phôi và mẫu hạt nảy mầm, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệuquả biến nạp

- Phân tích mẫu đã tiến hành chuyển gen bằng phương pháp nhuộm GUS

- Khảo sát nồng độ PPT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây Jatropha in vivo.

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Sơ lược về các đặc điểm của cây Cọc rào

2.1.1 Phân loại khoa học

Loài : Jatropha curcas Linn.

Tên tiếng Anh : Physic nut

Tên tiếng Việt : Dầu mè, cọc rào, dầu lai

Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L.

(en.wikipedia.org/wiki/Jatropha_curcas)

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây Jatropha curcas L., thuộc chi Jatropha, họ Thầu dầu Chi Jatropha là một

chi có khoảng 175 loài cây thân mọng, cây bụi hay cây thân gỗ có nguồn gốc từ tiếng

Hy Lạp, ghép từ hai chữ Iatrós (bác sĩ) và trophé (thức ăn), thể hiện công dụng làm

thuốc của cây này Curcas là tên gọi thông thường của cây Physic nut ở Malabar, Ấn

Độ Tên thông dụng ở các nước hiện nay là Jatropha, ở Việt Nam gọi là cây Cọc giậu,

Cọc rào, Bã đậu nam, Dầu mè, v.v (Nguyễn Công Tạn, 2008)

Jatropha là một loài cây có lịch sử 70 triệu năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ Loài Jatropha dại phân bố nhiều ở vùng

thung lũng á nhiệt đới khô nóng và vùng rừng mưa nhiệt đới ẩm, thường ở vùng đồinúi, đất dốc thung lũng có độ cao 700 – 1600 m so với mực nước biển Sau đó chúngđược người Bồ Đào Nha đưa qua Cape Verde, rồi lan truyền sang châu Phi, châu Á,sau đó được trồng ở nhiều nước, trở thành cây bản địa ở khắp các nước nhiệt đới, cậnnhiệt đới trên toàn thế giới (Nguyễn Công Tạn, 2008)

2.1.3 Đặc điểm hình thái – Đặc tính sinh học

Jatropha là cây bụi, gỗ nhỏ, có thể cao đến 5 m Cành xòe, có nhựa mủ, trên cành

có những vết sẹo Thân, vỏ, lá có nhựa nhớt, không màu Lá mọc so le, hình trái xoan,hơi tròn, chia 5 – 7 thùy nông với chiều dài và rộng khỏang 6 – 15 cm Phiến lá dạng

giấy lụa (Nguyễn Công Tạn, 2008) Cụm hoa tận cùng có màu vàng Hoa đơn tính,cùng gốc, đôi khi có hoa lưỡng tính Bộ nhị 10, xếp thành hai vòng riêng biệt, mỗivòng 5, tạo thành cột đơn gần nhau Bộ nhụy có 3 vòi nhụy, dính với nhau ở khoảng2/3 chiều dài, phần trên rời nhau và núm nhụy rẽ đôi (Dehgan và Webster, 1979) Quảnon hình trứng, lúc chín màu vàng, sau nâu xám, chứa hạt màu đen

Cây Jatropha ưa ánh sáng, ưa khí hậu ấm áp, chịu khô hạn, có thể sống trong môi

trường có lượng mưa trung bình năm 520 - 2000 mm, nhiệt độ bình quân năm 11 – 28

oC Cây chịu được đất xấu, đất sỏi, đất đá vôi bạc màu, v.v Cây Jatropha nảy chồi rất

dễ, có thể giâm hom, nếu trồng bằng hạt, cây có rễ chính và 4 rễ ngang, nếu giâm homthì không có rễ chính (Nguyễn Công Tạn, 2008)

Cây Jatropha sinh trưởng nhanh, sau khi trồng 3 năm, cây cao 3 m, sau trồng 1

năm thì cây bắt đầu ra hoa Thời gian ra quả bình thường là 6 – 20 năm, ít thấy hiệntượng ra quả cách năm Ra hoa từ tháng 3 đến giữa tháng 4, thời gian ra hoa kéo dài 4– 5 tháng, chín vào tháng 8 – 9, quả khó rụng

2.1.4 Các ưu điểm sinh học và giá trị của cây Jatropha

Jatropha là loài cây mà hiện nay được các nhà khoa học đánh giá rất cao vì các

ưu điểm sinh học và giá trị của cây

2.1.4.1 Ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội

Phát hiện quan trọng nhất từ Jatropha là lấy hạt làm nguyên liệu sản xuất dầu diesel sinh học (biodiesel) Cây Jatropha có chu kỳ sống lâu có thể lên đến 50 năm,

cho quả, hạt sớm, hàng năm năng suất có thể đạt đến 10 – 12 tấn/ha nếu trồng trên đấttốt và đầu tư cao (chăm sóc, bón phân, tưới tiêu, v.v.), hàm lượng dầu trong hạt caotrung bình 32 – 35% Đây là nguồn nguyên liệu dầu diesel sinh học rất tiềm năng đểdần thay thế các tài nguyên nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng bị cạn kiệt Từ hạt

Jatropha ép ra dầu thô, từ dầu thô tinh luyện được diesel sinh học và glycerin Mặc dù

diesel sinh học được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu: cải dầu, hướng dương, dầu

cọ, mỡ động vật, v.v nhưng sản xuất từ Jatropha có giá thành rẻ nhất và chất lượng tốt tương đương với dầu diesel hóa thạch truyền thống Nếu 1 ha Jatropha đạt năng

suất 8 – 10 tấn hạt/ha/năm có thể sản xuất được 3 tấn diesel sinh học Loại dầu này sẽthay thế được một phần dầu diesel truyền thống đang cạn kiệt, giảm thiểu được lượngkhí thải gây hiệu ứng nhà kính, là loại dầu cháy hết và có ít lưu huỳnh, là loại dầusạch, thân thiện với môi trường

Jatropha còn tạo ra hiệu ứng xã hội rất lớn Do trồng ở các vùng miền núi nghèo, cây Jatropha sẽ tạo nhiều việc làm và thu nhập khả quan cho đồng bào các dân tộc.

Trong khi cho đến nay, trên đất dốc còn lại của các vùng này vẫn chưa tìm kiếm đượcbất cứ cây gì khả dĩ trồng được trên diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị trường ổnđịnh (Nguyễn Công Tạn, 2008)

2.1.4.2 Ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường

Jatropha là cây lâu năm, phủ đất rất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trưởng phát triển

được ở hầu hết các loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, gia súc không ăn

Vì vậy, cây Jatropha trồng trên các vùng đất dốc sẽ được coi là cây “lấp đầy” lỗ hổng

sinh thái ở các vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo ra thảm thực bì dày đặc

chống xói mòn, chống cháy, nâng cao độ phì của đất Không những vậy, Jatropha còn

có thể trồng ở những vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần

phục hồi hệ sinh thái các vùng này Vì vậy, cây Jatropha được đánh giá là “vệ sĩ sinh

thái”, tạo ra hiệu ứng to lớn về bảo vệ môi trường (Nguyễn Công Tạn, 2008)

2.1.4.3 Sử dụng làm phân bón và thức ăn cho gia súc

Hạt Jatropha sau khi ép dầu, hơn 30% là sản phẩm dầu, gần 70% là khô dầu, có

hàm lượng protein khoảng 30%, hàm lượng N 4,14 – 4,78%, P2O5 0,50 – 0,66%, CaO0,60 – 0,65%, MgO 0,17 – 0,21% dùng làm phân hữu cơ rất tốt, nếu khử hết độc tố cóthể làm thức ăn gia súc cao đạm (www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn)

2.1.4.4 Công dụng trong chữa trị bệnh

Trong thành phần cây Jatropha, đã phân tích được những hợp chất chủ yếu như

tecpen, flavon, coumarin, lipid, sterol, alkaloid Nhiều bộ phận của cây này có thểchữa bệnh như lá, vỏ cây, hạt và rễ Trong cây JCL có một số độc tố, nhất làphytotoxin (curcin) trong hạt, nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể cung cấp chochúng ta một loại dược liệu mới (www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn)

2.2 Phương pháp biến nạp ở vi khuẩn

2.2.1 Giới thiệu về phương pháp biến nạp

Biến nạp là phương pháp chuyển gen nhờ sự thu nhận các DNA tự do trong môitrường xung quanh của thể nhận, đây là phương pháp đơn giản nhất để đưa DNA tái

tổ hợp vào tế bào vật chủ

Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn được Ferderrick Griffith mô tả năm 1928, trongthí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp” Một số vi khuẩn có

khả năng hấp thụ DNA một cách tự nhiên Tuy nhiên, chúng chỉ có thể thực hiệnđược điều đó vào một thời kỳ cụ thể trong chu kỳ sinh trưởng khi chúng tạo ra mộtloại protein đặc biệt gọi là yếu tố khả biến Ở giai đoạn này, vi khuẩn được gọi là khảnạp Một số loài vi khuẩn không có khả năng thu nhận DNA một cách tự nhiên nhưng

ta có thể tạo ra tính khả nạp in vitro bằng cách ngâm các tế bào vào dung dịch calcium

chloride lạnh đông Việc biến nạp đoạn DNA vào tế bào khả nạp được thực hiện bằngnhiều kỹ thuật khác nhau:

- Biến nạp bằng sốc nhiệt

- Biến nạp bằng vi tiêm

- Biến nạp bằng hóa chất

- Biến nạp bằng xung điện

2.2.2 Cơ chế của biến nạp

Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào được là do trong một giaiđoạn tăng trưởng nào đó của tế bào, trên bề mặt tế bào có hiện diện những điểm tiếpnhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (compentent factor) Nhân tố này có khả năngtiếp nhận đoạn ngắn từ môi trường ngoài để đưa vào trong tế bào vi khuẩn, nhờ đóxảy ra tái tổ hợp

Muốn thực hiện được biến nạp phải có đủ 2 điều kiện là trong môi trường phải cócác đoạn DNA và khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận Quá trình biến nạpgồm 5 giai đoạn :

- Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận

- Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận

- Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tương đồng của nhiễm sắc thể tế bào nhận

- Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp

- Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp

2.2.3 Vai trò của biến nạp

Biến nạp trong tự nhiên có thể làm gia tăng độc tính Ngoài ra biến nạp còn được

sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp Hiện tượng biến nạp giúp các loài vi khuẩn

có thêm tính mới dễ thích nghi với môi trường sống Đó là cở sở tiến hóa và đa dạngcủa vi sinh vật

2.3 Giới thiệu chung về phương pháp chuyển gen ở thực vật

2.3.1 Khái niệm

Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào cơ thể sinh vật Nhữngthành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọngđối với việc chuyển nạp gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyềnmới (Uchimiya và ctv, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.2 Thành phần của gen chuyển nạp

2.3.2.1 Promoter và terminator

Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình

tự thích hợp đi kèm theo nó Với mỗi promoter cần có các vector tương ứng Hiện

nay, promoter CAMV35S của virus gây bệnh khảm trên cải bông là một trong những

promoter mạnh và được sử dụng phổ biến nhất Theo Heldt (1997) (trích dẫn bởi BùiChí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) promoter này bao gồm các enhancer có khảnăng phiên mã ở mức độ cao

Terminator giúp đảm bảo gen được chuyển kết thúc đúng vị trí và không tạonhững protein thể khảm với các protein từ thực vật Có rất nhiều terminator có tiềm

năng đã được tìm ra nhưng terminator nos (được thu nhận từ gen tổng hợp nopaline của Ti plasmid trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) vẫn là terminator thông

dụng nhất (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.2.2 Gen thông báo (reporter gene)

Bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là chuyển nạp gen gián tiếp bằng vi

khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vẫn cần một

phương pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai (Jacobsen, 2007).Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thôngbáo Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào

đó rất dễ phát hiện trong cây giúp nhận biết tế bào hoặc thể chuyển gen và cho phép

đo lường mức độ biểu hiện của gen ngoại lai Gen gusA của vi khuẩn E.coli thường được sử dụng làm gen thông báo Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase.

Enzyme này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thànhsản phẩm có màu xanh chàm đặc trưng Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc) Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase

không tồn tại trong thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen

thực vật Mặt khác, sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnhhưởng của pH môi trường nên thuận tiện cho việc theo dõi Ngoài ra còn có gen phát

sáng gfp hoặc gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase (CAT), gen lux mã

hóa cho luciferase được lấy từ đom đóm (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.2.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào đãnhận gen mục tiêu và nuôi cấy trên môi trường tái sinh Vì vậy tất cả các plasmid đềuphải có ít nhất một gen chọn lọc để giúp quan sát và chọn lọc những cây chuyển genthành công Các gen này thường mã hóa cho một enzyme có khả năng khử độc tính

của chất chọn lọc như kháng sinh (nptII, hpt…) hoặc thuốc diệt cỏ (bar hay pat) trong

quá trình chuyển hóa Khi các gen chọn lọc biểu hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tụcsinh trưởng trong môi trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinhhay thuốc diệt cỏ Ngoài ra, chúng còn được dùng để phân tích bộ gen của cây đượcchyển gen nhằm xác định việc đoạn DNA đưa vào có hiệu quả hay không

Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen nptII mã hóa enzyme neomycin

phospho transferase II Enzyme này sẽ xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinhkanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này Một chỉ thị chọn lọc phổ biến khác là gen

hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin Gen hph tỏ ra rất thành công trên cây bắp (Walters và ctv, 1992),

cây lúa (Christon và ctv, 1991; Li và ctv, 1993) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và NguyễnThị Lang, 2004)

Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu nhưng đồng thời cũng là một chỉ thị chọn lọc Gen bar mã hóa cho enzyme phosphinothricin

acetyl transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là thành phần chính

trong thuốc diệt cỏ Basta Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme phospho mannose

isomerase đã được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc Gen này hoạt động trên cơ sở phảnứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose Điều này đã mở ra một triểnvọng lớn về an toàn sinh học do không cần sử dụng chất kháng sinh hay hoạt chất diệt

cỏ trong quá trình chọn lọc (Hòa và Bổng, 2002) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu vàNguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.3 Một số phương pháp chuyển gen ở thực vật

Có nhiều phương pháp được phát triển để có được cây trồng chuyển gen Phương

pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn A tumefaciens ngày càng được sử dụng phổ

biến nhờ vào sự cải tiến không ngừng hệ thống Ti–plasmid Bên cạnh đó còn có cácphương pháp chuyển gen trực tiếp khác như phương pháp PEG (polyethylene glycol),phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp sử dụng xung điện(electroporation), phương pháp bắn gen (biolistic) và một vài kỹ thuật mới

2.3.3.1 Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)

Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật.Phương pháp này chuyển nạp gen vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA dựa trênnguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhậpgen lạ vào tế bào Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi

4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG,

kết quả là đã thu được những tế bào trần mang các gen chuyển nạp (trích dẫn bởi BùiChí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.3.2 Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắntrong một điện trường cực mạnh để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cầnchuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn ThịLang, 2004) Phương pháp sử dụng xung điện đã được sử dụng trong chuyển nạp gentrên cả động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy còn nhiều khó khăn chưa giải quyếtđược về mặt kỹ thuật nhưng người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển genthành công trên cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988; Shimamoto và

ctv, 1989), trên cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu (Guerche và ctv,

1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.3.3.3 Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)

Phương pháp bắn gen được John Stanford ở Đại học Cornell phát minh (Klein vàctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Đây là phươngpháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng Ưu điểm của phương pháp này là có thể

áp dụng trên tất cả các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm, không cần vector hainguồn (binary vector) và quy trình vận hành tương đối đơn giản

Hiện nay có 3 loại dụng cụ bắn gen khác nhau:

- Loại 1: là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ nhờ mộtkim hỏa (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

- Loại 2: hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phủ lên các phân tử bằngvàng cực mịn (DNA–coated gold particles) (Christou và ctv, 1988) (trích dẫn bởi BùiChí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

- Loại 3: hoạt động bằng áp suất của khí từ một xi lanh chứa khí trơ như helium hoặcnitrogen Vận tốc của vi đạn khi bắn bằng dụng cụ này chậm hơn rất nhiều so với loại

1 nhưng nó tỏ ra rất có hiệu quả trong trường hợp chuyển plasmid DNA vào tế bàocây trồng (Cao và ctv, 1991) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004) trong quy trình bắn gen trước tiênbột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn lênviên đạn plastic Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng cáchạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên vào tếbào Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có bổ sung các chấtchọn lọc thích hợp Mô nhận gen sẽ xuất hiện mô sẹo sau 5 – 7 ngày nuôi cấy còn các

mô không nhận gen sẽ chết trong môi trường chọn lọc

1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Phương pháp này đòihỏi trang thiết bị kỹ thuật đắt tiền cho việc vi thao tác dưới kính hiển vi và sự khéoléo, chính xác tiêm một lượng rất nhỏ dung dịch DNA

2.3.3.5 Phương pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation) – chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium với sự

hỗ trợ sóng siêu âm

Phương pháp SAAT là phương pháp biến đổi gen dựa trên phương pháp chuyển

gen gián tiếp nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium Mô đích sẽ được xử lý trong một thời

gian ngắn cùng với sự hiện diện của vi khuẩn Sóng siêu âm sẽ tạo rất nhiều vết

thương nhỏ và đồng đều trên mô cây, cho phép Agrobacterium xâm nhiễm dễ dàng và

do đó sẽ làm gia tăng hiệu quả biến nạp Đây là phương pháp khá hữu hiệu, đơn giản,

rẻ tiền làm gia tăng hiệu quả biến nạp vào mẫu mô cây có hiệu quả chuyển gen thấp

(Liu và ctv, 2005)

Theo Trick và Finer (1997), các mô xử lý SAAT cho thấy sự tăng mạnh của biểuhiện GUS so với các mô chỉ ủ khuẩn thông thường Tùy theo loại mô, thời gian đápứng cũng khác nhau, có thể từ vài giây đến vài trăm giây Các mô đáp ứng ở diệnrộng với thời gian xử lý SAAT Vì thế, thời gian xử lý tối ưu là khi xử lý thời gianngắn nhất và cho hiệu quả cao nhất

Hình 2.2 Chuyển gen bằng phương pháp SAAT; A xử lý mẫu; B kết quả nhuộm GUS

hạt đầu nành được xử lý bằng SAAT (www.oardc.ohio-state.edu/plantranslab/sonicate.htm)

Từ năm 1974, Miller và ctv ứng dụng phương pháp chuyển gen SAAT trên mô rễcây Vicia faba; đến năm 1990 Joersbo và Brunstedt chuyển vào protoplast của

Nicotiana tabacum và Beta vulgaris, Trick và Finer thực hiện trên cây đậu nành, bắp,

lúa mì vào năm 1997, v.v Gần đây, một số nghiên cứu của Zaochang Liu và ctv

(2005) trên hạt Phaseolus vulgaris L., Byong-Jin Park và ctv (2005) trên Raphanus sativus L đã kết hợp SAAT với phương pháp thấm hút chân không, tạo điều kiện cho

A tumefaciens xâm nhiễm, làm tăng khả năng biến nạp Sự kết hợp các phương pháp

tỏ ra rất hữu hiệu, nhất là trên các loại cây khó chuyển nạp gen (trích dẫn bởi Liu vàctv, 2005)

2.3.3.6 Một số phương pháp chuyển gen in vivo

Phương pháp Floral-dip: Ở phương pháp này, cây chuyển gen được tạo ra bằng

cách ngâm hoa trực tiếp vào dịch khuẩn A tumefaciens Ưu điểm của phương pháp này là không cần phải nuôi cấy in vitro, do đó có thể loại trừ nguy cơ biến dị sôma (Clough và ctv, 1998) Phương pháp này còn thành công trên cây Arabidopsis thaliana với mô mục tiêu là hạt và hạt phấn của hoa chưa trưởng thành (Ye và ctv,

1999; Desfeux và ctv, 2000) (trích dẫn bởi Sarma và ctv, 2004)

Phương pháp chuyển gen qua ống phấn: Phương pháp này được xem là một

phương pháp không trải qua nuôi cấy mô Chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn

đã được nhóm Ray Wu, Đại học Cornell (Mỹ) báo cáo thành công trên cây lúa, tiếptheo các công trình sơ bộ với ADN tổng hợp của hai tác giả Trung Quốc Duan vàChen (1985) Đây là phương pháp sử dụng ống phấn trong việc chuyển vector manggen đi cùng tế bào sinh dục đực (tinh tử) kết hợp với tế bào trứng tạo hợp tử mang genngoại lai vào tế bào noãn Sau đó, hợp tử nhận được gen đích sẽ phát triển thành hạtchuyển gen Hạt nảy mầm và phát triển thành cây chuyển gen và được di truyền chocác thế hệ sau Chuyển gen qua ống phấn tốt nhất thực hiện ngay sau khi quá trình thụtinh xảy ra ở noãn, nhưng tế bào sinh dục cái chưa kịp phân chia Sự chuyển gen sẽđược thực hiện đối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và sau khi tái sinh cây

sẽ tránh xuất hiện thể khảm Gen sau khi được chuyển được kiểm tra hoạt động củagen đã chuyển, chọn lọc thể chuyển gen Sau đó thực hiện giao phấn chéo một vài thế

hệ, kết hợp với chọn lọc tạo các giống chuyển gen có tính ổn định di truyền cao.

Phương pháp chuyển gen vào hạt nảy mầm: Phương pháp xâm nhiễm A.

tumefaciens vào hạt nảy mầm được thực hiện từ rất sớm trên một số đối tượng như Arabidopsis thaliana (Feldmann và Mark, 1987), đậu nành (Chee và ctv, 1989), ngô

(Wang và ctv, 2007) Cây chuyển gen thu được bằng cách này chính là nhờ vi khuẩnxâm nhiễm vào vùng tế bào chưa phân hóa như vùng chồi đỉnh, vùng đốt lá mầm củahạt đang nảy mầm Chỉ cần một số tế bào được chuyển gen, sau đó sẽ phân chia, biệthóa thành cây chuyển gen Hiệu quả chuyển gen sẽ cao hơn khi trên vùng chưa phânhóa xuất hiện những vết thương tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm dễ dàng hơn(Chee và ctv, 1989)

2.4 Vi khuẩn A tumefaciens và phương pháp chuyển gen thông qua

Chi (Genus) : Agrobacterium

Loài (Species) : A tumefaciens

2.4.2 Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh

Agrotumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que (rộng 0,6 - 1,0 µm, dài

1,5 - 3,0 µm) di động, không sinh bào tử, sống tự do trong đất, tăng trưởng tối ưu từ

25 - 28 oC Khi tăng trưởng trên môi trường có carbohydrate thường tạo ra lớp nhầypolysaccharide ngoại bào dồi dào

A tumefaciens có cấu trúc bộ gen đặc biệt gồm 2 nhiễm sắc thể (1 nhiễm sắc thể

vòng và 1 nhiễm sắc thể dạng sợi thẳng) và 2 plasmid dạng vòng, tổng cộng cókhoảng 5400 gen Trong đó Ti plamid (Ti: tumor inducing) dài hơn 200 kb đóng vai

trò then chốt trong sự cảm ứng hình thành khối u bệnh ở thân và rễ thực vật 2 lá mầm,đặc biệt là họ hoa hồng như đào, lê, táo, hạnh nhân, mâm xôi, v.v

Khi xâm nhiễm vào cây, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sẽ di chuyển khắp

hệ thống rễ làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng của rễ, làm giảm sức sống của câynhưng đối với cây trưởng thành tác động của bệnh không nhiều (Bùi Chí Bửu và

T-region (vùng DNA được chuyển vào tế bào thực vật) trên Ti-plasmid nguyên

thủy có kích thước khoảng 10 – 30 kbp (Barker và ctv, 1983; Byrne và ctv, 1983;

Suzuki và ctv, 2000), nó nhỏ hơn 10% Ti-plasmid Ti-plasmid có thể chứa một vùng

T-region hoặc nhiều vùng T-region (Barker và ctv, 1983; Suzuki và ctv, 2000).

T-region được xác định bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border) Các

“border” này dài 25 bp và có độ tương đồng cao (Van Haute và ctv, 1988; Dransart và ctv, 1995) Bất cứ DNA nào định vị giữa hai chuỗi “border” này đều đượcchuyển vào cây và vùng DNA này được gọi là T-DNA (transferred DNA) (Grierson

Vaudequin-và Covey, 1988) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu Vaudequin-và Nguyễn Thị Lang, 2004)

T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 25 kb chứa các gen mã hóa cho quá trình

sinh tổng hợp opine như gen octv (mã hóa cho enzyme octopine synthase) hay gen

nos (mã hóa cho nopaline synthase), gen tạo auxin, gen tạo cytokinin, và các gen gây

khối u Nhờ khả năng tổng hợp auxin và cytokinin mà các tế bào khối u của thực vật

bị nhiễm có thể tăng trưởng in vitro mà không cần bổ sung thêm các chất điều hòa

tăng trưởng

Opine là các amino acid bất thường (không có trong mô bình thường) được vikhuẩn sử dụng như nguồn dinh dưỡng (nguồn carbon và nitơ) để sinh sản nhanhchóng Bản chất của opine thùy thuộc vào kiểu plasmid vi khuẩn và được quy định

bởi Ti plasmid Những chủng A tumefaciens khác nhau sẽ mang các dạng Ti plasmid

khác nhau mã hóa cho việc sản xuất các opine khác nhau Những opine phổ biến nhất

là nopalin và octopin, ngoài ra còn có agrocinopine và agropine

Trong Ti plasmid, vị trí T-DNA được giới hạn bởi lề phải (Ringt Border - RB) và

lề trái (Left Border – LB) Đây là trình tự lặp lại bao gồm 25 cặp nucleotide, đóng vai

trò như tín hiệu nhân tố cis cho bộ máy vận chuyển T-DNA từ Ti plasmid của vi

khuẩn vào DNA tế bào thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

2.4.3.2 Vùng gen vir

Quá trình vận chuyển T-DNA là sự phối hợp nhịp nhàng bởi hoạt động của các

protein được mã hóa trong vùng gen vir (vùng gen gây bệnh) của Ti plasmid và một

số gen trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn

Vùng gen vir dài 30 – 40 kb bao gồm ít nhất 6 operon quan trọng (virA, virB, virC, virD, virE, virG) và 2 operon không quan trọng (virF, virH) (Gartland, 1995).

2.4.4 Cơ chế phân tử của quá trình xâm nhiễm và chuyển gen vào thực vật

Khi thực vật bị tổn thương sẽ tiết ra một số hợp chất phenol và đường, các chất

này có vai trò lôi kéo sự tiếp cận của Agrobacterium đến vị trí vết thương Tế bào A tumefaciens sẽ bám vào vách tế bào chủ ngay tại vị trí mô bị thương nhờ sự giúp đỡ

của các proteinn gắn (binding protein) và protein đính (atachement protein) được mã

hóa bởi các gen chA, chB, pscA và att trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn Sau đó, A tumefaciens bắt đầu việc tổng hợp cellulose tạo ra mối quan hệ chặt chẽ giữa hai tế

bào Các polysaccharide trên bề mặt vi khuẩn được chứng minh có vai trò quan trọngtrong quá trình xâm nhiễm và tương tác ký chủ

Hệ thống tín hiệu gồm virA – virG trên màng tế bào A tumefaciens nhận diện các hợp chất tiết ra từ mô bị thương, chủ yếu là các monosaccharide và phenol VirA trực

tiếp tương tác với các hợp chất đó và trải qua quá trình phosphoryl hóa kéo theo quá

trình transphosphoryl hóa của virG – một nhân tố điều hòa phiên mã có chức năng hoạt hóa các promoter của các gen vir khác trên Ti plasmid Mạch đơn T-DNA được tạo ra nhờ sự phối hợp hoạt động của virD1 và virD2 (có vai trò như các

endonuclease cắt chuyên biệt tại vùng lề phải và lề trái trên Ti plasmid) Ngay sau khi

cắt và hình thành bản sao T-DNA mạch đơn, virD2 được gắn vào mạch T-DNA bằng

liên kết cộng hóa trị tại đầu 5’, hình thành phức hợp T chưa đầy đủ (gồm mạch đơn

T-DNA và virD2) Chổ hổng tại vùng T-T-DNA trên Ti plasmid sẽ được sửa chửa nhờ quá

trình tổng hợp DNA và cơ chế phục hồi của vi khuẩn

Phức hợp T chưa đầy đủ sẽ được đóng gói bởi các protein virE2, hình thành cấu

trúc cuộn, để bảo vệ khỏi các nuclease nội bào và thuận tiện cho quá trình vận

chuyển, đây là phức hợp T đầy đủ VirE2 sau đó sẽ bị tách ra khỏi phức hợp bởi virE1, ngăn không cho virE2 gắn vào T-DNA cho đến khi vào đến tế bào chất của tế bào thực vật Bên cạnh đó, virD4 kết hợp với 11 protein virB tạo thành phức hệ vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ VirD4 có tác dụng như cầu nối thúc đẩy sự vận chuyển phức hợp T-DNA/virE2 do virB thực hiện.

Bên trong tế bào chất của tế bào chủ, virD2 và virE2 có mang tín hiệu định vị

nhân (nuclear locational signal – NLS) làm vô hiệu hóa các protein nhận biết trênmàng nhân Ngoài ra, sự chuyển phức hợp T vào nhân qua lỗ màng nhân và sát nhập

vào bộ gen tế bào chủ được hỗ trợ bởi các tương tác giữa virD2 và virE2 với các

protein của tế bào chủ như: AtKAPα, CypA, RocA, Roc1, PP2C, VIP1, VIP2 và ran(Tzfia và Citovsky, 2005, 2006)

Hình 2.5 Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A tumefaciens.

(www.sciencedirect.com)

2.4.5 Acetosyringone và vai trò trong quá trình xâm nhiễm

Acetosyringone là một phức chất phenol được sản sinh cùng với đường khi các tếbào cây bị tổn thương Acetosyringone giữ vai trò quan trọng trong quá trình xâmnhiễm vào ở nồng độ cao (10-5 đến 10-4 phân tử gam), nó làm hoạt hóa gen vir trên Ti

plasmid

Trong tự nhiên, những tế bào A tumefaciens di động bị hút đến các vết thương

nhờ sự sản sinh acetosyringone Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Ti plasmid đápứng mạnh hơn các chủng vi khuẩn thông thường vì chúng có thể nhận diệnacetosyringone ở nồng độ rất thấp (10-7 phân tử gam)

Các chất tiết ra từ vết thương được thu nhận bởi một thụ quan đặc biệt gắn trenmàng tế bào vi khuẩn, giúp vi khuẩn nhận diện vết thương đồng thời kích hoạt một

kinase là gen vir biểu hiện (Dion và ctv, 1995)

2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng lên sự vận chuyển và sát nhập T-DNA vào bộ genthực vật, một số yếu tố cần quan tâm như: kiểu gen của cây, loại mô, dòng vi khuẩn,

hóa chất cảm ứng gen vir, thành phần môi trường nuôi cấy, trình trạng hư hại của mô,

sự loại bỏ A tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy, v.v Để thiết kế các quy trình tối ưu

và gia tăng hiệu quả biến nạp, cần đi sâu tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến biến nạp

2.4.6.1 Vật liệu chuyển gen

Việc chọn kiểu mô để làm vật liệu chuyển gen rất quan trọng Phải chọn loại mô

có khả năng tái sinh mạnh để khi thu được một tế bào chuyển gen thì tế bào này cókhả năng phân chia nhanh chóng và tạo ra một khối tế bào chuyển gen

Để tăng hiệu quả chuyển nạp gen và thuận tiện trong bước tái sinh sau này, mẫu

trước khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium có thể được xử lý bằng nhiều cách:

Xử lý thẩm thấu: Việc bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy 200 mM sucrose và

200 mM glucose đã được sử dụng rộng rãi trong quy trình chuyển gen vào cây lúa vàbắp (Hiei và ctv, 1994; Zhao và ctv, 2001; Frame và ctv, 2002) (trích dẫn bởi SunjungPark, 2006)

Xử lý tiền nuôi cấy: Trước khi ủ chung với vi khuẩn A tumefaciens người ta nuôi

cấy mô mục tiêu trên môi trường cảm ứng mô sẹo, chồi một thời gian Phương pháp

này được chứng minh có hiệu quả rất cao trên cây Arabidopsis thaliana (Sanwan và ctv, 1991) và Saintpaulia ionantha (Satoshi và ctv, 2001)

Làm khô mẫu: Trình trạng khô của mẫu trước hoặc ngay khi xâm nhiễm vi khuẩn

là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng biến nạp Không rõnhân tố nào bị tác động bởi việc làm khô mẫu, có thể đó là sự co nguyên sinh chất vàtình trạng tổn thương mẫu giống như xử lý thẩm thấu Mặc dù cơ chế của sự phơi mẫuđến nay chưa rõ, nhưng người ta chứng minh rằng nó có khả năng loại bỏ vi khuẩntương đương với xử lý AgNO3

Mức độ gây tổn thương của tế bào chủ: Agrobacterium xâm nhiễm vào tế bào

thực vật thông qua một cơ chế chuyển gen gây ra khối u ở thực vật Gen vir (gen gây

độc) được hoạt hóa trong vi khuẩn nhờ chất chuyển hóa của thực vật phóng thích từcác điểm bị thương Khi mô bị tổn thương, vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập và chuyển

DNA vào tế bào thực vật hơn Nhưng nếu mô bị tổn thương quá nặng thì sau khichuyển gen khả năng tái sinh của mô rất thấp.

Gen virG và virA đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện vùng gen vir nên các nhà khoa học đã nghiên cứu cải biên một số dòng Agrobacterium có khả

năng chuyển gen mạnh hơn bằng cách gây đột biến điểm định hướng trên vùng gen

vir để thu được dòng vi khuẩn có vùng vir được biểu hiện mạnh nhất Khi dùng dòng Agrobacterium đột biến này để chuyển gen, không cần phải bổ sung các tác nhân cảm ứng vùng gen vir

2.4.6.4 Chất hoạt động bề mặt

Chất hoạt động bề mặt có tác dụng thúc đẩy sự vận chuyển T-DNA bằng cách trợ

giúp A tumefaciens bám vào mô thực vật và giúp loại bỏ các cơ chất cản trở quá trình

bám đó Một số chất hoạt động bề mặt như Silwet 77 và acid pluronic F68 được bổsung vào môi trường ủ làm gia tăng sự chuyển DNA vào tế bào thực vật (Whalen vàctv, 1991) (trích dẫn bởi Sunjung Park, 2006)

2.4.6.5 Kháng sinh

Sau khi ủ mẫu với A tumefaciens, vi khuẩn cần được loại bỏ khỏi mẫu Đây là

giai đoạn quan trọng trong quá trình chuyển gen Nếu tiêu diệt không hết vi khuẩn sẽảnh hưởng đến môi trường, ngoài ra sự hiện diện của vi khuẩn còn sót lại thường ảnhhưởng đến quá trình tái sinh cây chuyển gen Trong các nghiên cứu chuyển nạp gen,

có nhiều loại kháng sinh được sử dụng để diệt khuẩn A tumefaciens Tuy nhiên kháng

sinh thường gây độc tế bào thực vật làm ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh cây chuyểngen Do đó cần chọn lọc các loại kháng sinh đủ mạnh để giết chết vi khuẩn và ít gâyđộc với tế bào thực vật nhất

Hiện nay một số loại kháng sinh hiệu quả được dùng để loại bỏ vi khuẩn sau khi ủ

mẫu với A tumefaciens là cefotaxim, carbernicilin và timentin có tác động ức chế

sinh tổng hợp lớp peptidoglycan vách tế bào prokaryote và giết chết vi khuẩn Tuynhiên, để diệt khuẩn hiệu quả, các loại kháng sinh trên phải được sử dụng ở nồng độcao (200 – 500 mg/l) vì vậy chúng thường gây độc với tế bào thực vật làm ảnh hưởngđến khả năng tái sinh cây sau chuyển gen (Hammerschlag và Zimmerman, 1995).Việc phát hiện các loại kháng sinh mới diệt khuẩn hiệu quả, tăng cường hiệu quả biếnnạp đang được quan tâm nghiên cứu (Mayzolo và ctv, 2003; Ogawa và mii, 2007).Moxalactam, một loại kháng sinh thuộc họ β–lactam cho thấy hiệu quả cao trong quátrình diệt khuẩn và tăng cường tạo phôi trong nghiên cứu chuyển gen trên cây cacaokhi so sánh với cefotaxim (Mayzolo và ctv, 2003) Nghiên cứu sàng lọc 12 kháng sinh

thuộc họ β-lactam diệt vi khuẩn A tumefacines chủng LBA4404 và EHA101 cho thấy

rằng chỉ có cefotaxim, ceibuperazon và meropenem có tác động tốt trong sự loại bỏ vikhuẩn Trong đó, meropenem có hoạt tính cao nhất đối với vi khuẩn Nghiên cứu tínhđộc của 12 loại kháng sinh trên đối với tế bào được tiến hành trên cây thuốc lá chothấy 2 loại kháng sinh β-lactam là meropenem và moxalactam diệt khuẩn hiệu quả vàkhông ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh cây chuyển gen (Ogawa và mii, 2005)

2.4.6.6 Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ vi khuẩn

Mỗi loại mẫu, loại cây sẽ thích hợp với một thời gian đồng nuôi cấy khác nhau.Một số mẫu yếu, khó tái sinh nếu thời gian đồng nuôi cấy quá dài sẽ gây khó khăntrong bước diệt khuẩn và tái sinh

Mật độ vi khuẩn thích hợp thường dùng chuyển gen là từ 1 x 106 - 1 x 1010 cfu/l.Mật số vi khuẩn cao có thể làm gia tăng hiệu quả biến nạp tạm thời, cho hiệu quả biểuhiện GUS cao (Hiei và ctv, 1997) tuy nhiên không tương quan đến hiệu suất biến nạp

Nồng độ vi khuẩn cao hơn nồng độ tối ưu thường gây hư hại tế bào thực vật, do đólàm giảm khả năng tái sinh của mô Nhưng đối với các loại cây khó chuyển gen, nồng

độ vi khuẩn cao là cần thiết, sau khi ủ xong, người ta rửa nhẹ lại với môi trường vôtrùng hoặc có bổ sung vào môi trường các tác nhân sát khuẩn

2.3.6.7 Các yếu tố ảnh hưởng khác

Ngoài các yếu tố kể trên thì còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu chuyểnnạp gen như các loại môi trường nuôi cấy, genotype, thời gian và điều kiện chiếu sáng

trong giai đoạn ủ, các chất gây cảm ứng gen vir khác như: acid galacturonic, acid

glucuronic, acid arabonic, các chất dẫn dụ (đường, amino acid), các chất kết dính củathực vật (pectin, vitronectin, germin) Thêm các chất như AgNO3 hay CaCl2 vào môitrường ủ và đồng nuôi cấy cũng làm tăng hiệu quả biến nạp Tất cả các yếu tố nầy cầnđược tối ưu hóa nhằm thu được hiệu quả chuyển gen cao nhất

2.5 Các phương pháp kiểm tra cây chuyển gen

2.5.1 Phương pháp thử GUS

Đây là phương pháp dùng để kiểm tra gen chỉ thị gusA Năm 1987, thử nghiệm

GUS đã được đưa ra bởi Jefferson Thử nghiệm rất nhạy, vừa có khả năng định lượngvừa có khả năng định tính Trong tự nhiên, β-glucuronidase không tồn tại trong thực

vật, vì vậy gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật Mặt khác, sản phẩm màu của gusA rất bền và phản ứng rất ít bị ảnh hưởng của pH nên rất thuận lợi

cho việc theo dõi Có thể thử GUS ngay trên mô thực vật hay tế bào bằng các thao táchiển vi: cắt mô, nhuộm với X-Gluc và theo dõi màu Cũng có thể thu các số liệu địnhlượng bằng cách so màu trên quang phổ huỳnh quang

Chất thường dùng để định tính β-glucuronidase trong mô và tế bào là chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) Chất này hoạt động tốt, cho màu xanhchàm tại nơi có eyzyme hoạt động (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

5-brom-4-Hình 2.6 Phản ứng tạo màu của X-gluc dưới tác dụng của enzyme β – glucuronidase 2.5.2 Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ (PPT) của cây tái sinh

Phân tích tính kháng thuốc là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng thuốcthông qua hoạt động của gen chuyển, có thể là thuốc kháng sinh như kanamycin khi

dùng gen nptII hoặc hygromycin khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ

trạng thái tế bào đến mô sẹo, chồi tái sinh, cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt (LêTrần Bình, 2008)

Các cây nhận được từ thí nghiệm chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường cókháng sinh hay PPT với nồng độ tùy thuộc vào loại thực vật khác nhau để theo dõikhả năng sinh trưởng của cây Trong điều kiện nuôi cấy như trên, cây được chuyểngen sẽ sinh trưởng bình thường trong khi cây không chuyển gen sẽ chết

2.5.3 Sử dụng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen ở thực vật

PCR là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để kiểm tra đánh giá kết quả chuyển gen

ở mức độ phân tử Trước tiên, phải tách chiết DNA thực vật với phương pháp thíchhợp Do PCR rất nhạy nên lượng mẫu dùng để tách chiết DNA cũng rất nhỏ (5 – 10mg) lượng DNA được tách chiết tương ứng từ 1 ng đến 1 µg

PCR khuếch đại số lượng lớn đặt trưng cho gen chuyển vào tế bào Vì vậy, luôncần có hai đoạn mồi 5’ và 3’ đặt trưng cho mỗi DNA hay gen ngoại lai Các đoạn mồinày có tên chung là mồi đặc trưng (specific primers) thường có kích thước từ 20 – 30

bp và là các nucleotide tổng hợp

Phản ứng PCR ở thực vật thường tiến hành qua 40 – 45 chu kỳ, sau koảng 30 chu

kỳ, sự khuếch đại sẽ đạt 106 so với mẫu ban đầu (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).Nếu trong thực vật xuất hiện gen mới do kỹ thuật chuyển gen, sau khi chạy PCRvới mồi đặc trưng, có thể phát hiện gen đó trên bản điện di

2.5.4 Phương pháp Southern blot xác định gen ngoại lai trong bộ gen của cây

Southern (1975) là người đầu tiên đã mô tả quá trình chuyển DNA từ màngagarose gel đến màng nitrocellulose, cho nên được gọi là “Southern blot” Theophương pháp này, được gọi là “lai có hỗn hợp pha với nhau” Một nucleic acid gắnvào màng, nucleic acid khác là thể probe được đánh dấu Phương pháp Sourther blottrở thành phương pháp rất quan trọng, có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứunhư là nghiên cứu cấu trúc gen, tổ chức genome, kiểm soát sự biểu hiện gen, Chuẩnđoán bệnh di truyền, phát hiện các pathogen thuộc về virus, vi khuẩn, nấm, v.v Phương pháp Southern blot chứng minh được sự hợp nhất của gen ngoại lai vào

bộ genome cây đang nghiên cứu, bằng cách lai với phân tử DNA, phân tử cao không

bị phân cắt, sử dụng các plasmid đóng vai trò như thể thăm dò (probe) Sau khi phâncắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn tại các vị trí mục tiêu của plasmid DNA Các sảnphẩm lai được quan sát từ việc phân cắt DNA của genome, không có gen lạ chuyểnnạp, tạo ra thể đa hình (polymorphism) như một chức năng của những vị trí hợp nhấtvào genome Sự có mặt của những bản sao nguyên vẹn các gen có thể được chứngminh nhờ kỹ thuật phân cắt DNA bằng enzyme tương ứng, làm cho cấu trúc genchuyển nạp thể hiện rõ, tiếp theo đó là kỹ thuật probing với một phần của chuỗi mànày (gen chuyển nạp) Nếu một copy nguyên vẹn của gen ngoại lai có mặt, nó sẽ tạo

ra sản phẩm lai (với probe) có cùng kích thước như plasmid DNA bị cắt bởi enzyme(Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004)

Sự phát hiện chuỗi DNA có tính chất tương đồng với probe, nhờ phương phápSouthern blot là một đóng góp to lớn trong sinh học phân tử, đặc biệt là trong kỹ thuật

“recombinant DNA”, và phân tích sự thể hiện gen được chuyển nạp

2.6 Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam

Nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen là công nghệ mới ở Việt Nam do kỹthuật phức tạp Năm 2008, chính phủ ban hành Nghị định về sử dụng sinh vật biến đổigen đã thúc đẩy công tác nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen ở nước ta.Nhiều đề tài, dự án nghiên cứu sinh vật biến đổi gen, trong đó có cây trồng chuyểngen được đầu tư về kinh phí, thiết bị, kỹ thuật hiện đại Chính vì thế những công trìnhnghiên cứu về chuyển gen ngày càng được phát triển và đã đem lại một số thành tựunhất định

Các nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan trọng đầu tiên được thựchiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý có giá trị ứng dụng caotiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên những giống lý tưởng.Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao gồm gen chịu hạn, lạnh,

kháng bệnh ở lúa; gen cry và vip mã hóa các protein độc tố có hoạt tính diệt côn trùng

của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gen mã hóa protein bất hoạt hóa ribosome ởcây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côntrùng, gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ, gen mã hóakháng nguyên vỏ của các chủng virus dại, v.v Song song với những nghiên cứu trên,hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị chủ yếu để biểu hiện trong

vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm trên cả nước Theo Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (2004), bộ môn Công nghệ Sinh học

đã chuyển nạp thành công nhiều dòng lúa biến đổi gen giàu vitamin A, sắt và protein

Các tác giả đã sử dụng một vector mang bảy gen khác nhau gồm hai gen crtI và psy điều khiển tính trạng tổng hợp beta carotene, ba gen irtI, nas và pfe mang tính trạng hấp thu sắt, cố định sắt và gia tăng hàm lượng sắt trong hạt lúa, gen asp cải thiện phẩm chất protein và gen pmi để chọn lọc trong môi trường đường mannose Các

dòng lúa này đang tiếp tục trồng ở thế hệ T2 và T3 để theo dõi Bộ môn Công nghệSinh học cũng đã bước đầu xây dựng quy trình chuyển nạp gen trên các giống bông

vải SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pManCa (Hòa

và Bổng, 2003) có gen chọn lọc trong môi trường mannose Các tác giả đã sử dụngphương pháp của Satyapathi và ctv (2002) với nhiều cải tiến và lấy đỉnh chồi làm vậtliệu chuyển gen Kết quả đã tạo được 15 dòng chuyển nạp gen, các dòng này được litrích DNA và phân tích Southern bot

Năm 2005, phòng Công nghệ Sinh học tiếp tục thử nghiệm quy trình chuyển gen

bằng A tumefaciens trên giống đậu nành Bert với các vector khác nhau mang các gen

Bt, gen chỉ thị gus và các gen chọn lọc pmi hoặc hpt Kết quả đã tạo được 10 dòng đậu

nành biến đổi gen với các vector pManca (Hòa và Bổng, 2003) và pTOK233 (Hiei,1994) (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2005)

Năm 2008, Trần Thị Cúc Hòa và ctv đã thành công trong việc chuyển gen bar và gen gusA vào cây đậu nành giống PC19 bằng A ttumefaciens thông qua nốt lá mầm.

Tại Viện Sinh học nhiệt đới, các nhà khoa học đã tạo được cây thuốc lá, lúa, đậuxanh, cải bông, cải xanh và cây cà tím GM mang gen cry kháng côn trùng, gen khángthuốc diệt cỏ Trần Thị Dung và ctv (2006) đã thực hiện thành công quy trình chuyển

gen trên giống thuốc lá K326 bằng vi khuẩn A tumefaciens dòng EHA105 Plasmid được sử dụng mang tên pITB2 mang gen cryIA(c) (gen Bt) kháng sâu thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera, gen bar kháng hoạt chất trừ cỏ phosphinothricin (PPT) và gen gus

được dùng làm gen chỉ thị Hiện nay, viện đang thực hiện chuyển gen vào cây thân gỗ

sử dụng vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA105 chứa Ti-plasmid ITB mang gen cry kháng côn trùng, gen bar và gen chỉ thị gusA Một trong những hướng nghiên cứu

mới là chuyển gen vào lục lạp Nguyễn Thị Thanh và nhóm nghiên cứu phòng côngnghệ gen Thực vật, viện Sinh học Nhiệt đới đã thực hiện đề tài “nghiên cứu ứng dụngcông nghệ chuyển gen vào lục lạp tạo ra thực vật sản xuất protein tái tổ hợp để ứngdụng trong y học” Đề tài đã tạo được dòng thuốc lá và cà chua chuyển gen có thể sảnxuất protein vỏ virut HIV bằng phương pháp bắn gen vào lục lạp Đây là một trongnhững thành tựu nổi bật thuộc lĩnh vực công nghệ gen thực vật

2.7 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chuyển gen trên cây Jatropha

Mã Yến Thanh, Đại học Nông Lâm Tp.HCM, đã thực hiện đề tài “Thiết lập quy

trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu

mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens” Đề tài đã đưa ra

nồng độ kháng sinh kanamycin dùng chọn lọc mẫu phôi và lá mầm chưa chuyển gen

là 30 mg/l Nồng độ PPT 1,5 mg/l dùng cho chọn lọc lá mầm và 1 mg/l dùng chọn lọc

phôi chưa chuyển gen Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens GUS do Jabcobsen cung cấp mang plasmid pGII0229 (gồm các gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA) đã được sử dụng để chuyển vào cây J curcas Bước đầu ghi nhận kết quả biểu hiện của gen gusA được chuyển

EHA101pIB-vào genome của cây cho thấy rằng hiệu quả chuyển gen đạt 40% ở phôi và 66,67% ở

lá mầm khi ủ trong dịch khuẩn thời gian là 30 phút, đồng nuôi cấy trong 4 ngày

Trên thế giới, có không nhiều các nghiên cứu chuyển gen vào cây Jatroha cuscas

L Các công trình nghiên cứu đã thu được một số kết quả đáng chú ý Meiru Li và ctv(2007) đã thiết lập phương pháp chuyển gen vào lá mầm (cotyledon disc) cây

Jatropha curcas L bằng Agrobacterium Đây là lần đầu tiên cây Jatropha chuyển gen được tạo ra thành công Tác giả cho rằng sử dụng vi khuẩn Agrobacterium chủng

LBA4404 để chuyển gen và chọn lọc bằng PPT thì hiệu quả hơn chủng EHA105 vàchọn lọc bằng hygromycin Kết quả của nghiên cứu là khoảng 55% mẫu lá mầm tạođược callus kháng PPT trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l benzyladenine (BA),0,05 mg/l 3–indolebutyric acid (IBA), 1 mg/l PPT và 500 mg/l cefotaxim sau 4 tuần.Tiếp theo là chuyển callus lên môi trường tạo chồi chứa 1,5 mg/l BA, 0,05 mg/l IBA,0,5 mg/l gibberellic acid (GA3), 1 mg/l PPT và 250 mg/l cefotaxim, khoảng 33%callus kháng biệt hóa thành chồi Cuối cùng chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổsung 0,3 mg/l IBA đạt tỉ lệ 78% Kết quả khoảng 13% mẫu nuôi cấy tạo được câychuyển gen sau 4 tháng.

Năm 2008, Li và ctv tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào lá mầm cây Jatropha bằng Agrobacterium, cũng trong thời gian đó Lie và ctv đã tiến hành nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây Jatropha bằng phương pháp Agrobacterium và đánh giá kiểu hình mô sẹo đã được chuyển gen Nghiên cứu đã đưa

ra được các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp như loại mẫu, thời gian đồngnuôi cấy, thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất cho biểu hiện GUS là 2 ngày, mật độ vikhuẩn, nồng độ acetosyringone giúp tăng hiệu quả chuyển gen

Tiếp theo những công trình nghiên cứu của các năm trước, năm 2009 nghiên cứu

thiết lập quy trình chuyển gen vào cây Jatropha curcas L do Trivedi và ctv thực hiện

đã tìm ra được nồng độ acetosyringone và thời gian ngâm mẫu cho hiệu quả chuyểngen cao

Gần đây Jingli Pan và ctv (2010) đã trình bày hệ thống chuyển gen hiệu quả vào

lá mầm của hạt trưởng thành, sử dụng kanamycin để chọn lọc Sử dụng môi trườngtái sinh là MS-Jc1 (môi trường MS với 3 mg/l BA và 0,01 mg/l IBA) Môi trường tạocallus (CIM, MS-Jc1 với 300 mg/l cefotaxim) trong 4 tuần đầu sau khi đồng nuôi cấy

với Agrobacterium Sau đó chuyển lên môi trường tạo chồi (SIM, MS-Jc1 với 20 mg/l

kanamycin và 100 mg/l cefotaxim) để chọn lọc thể chuyển gen, chồi khángkanamycin thu được sau 6 - 8 tuần nuôi cấy Tuy nhiên việc tạo rễ rất khó khăn, chỉ 1trên 120 chồi tái sinh có thể tạo rễ thành công trên môi trường (RM, 1/2 MS với 0,3mg/l IBA, 20 mg/l kanamycin và 100 mg/l cefotaxim) sau 4 - 5 tuần Việc cài nhập và

biểu hiện của gen chuyển nạp trên cây J curcas được kiểm tra bằng phản ứng PCR,

nhuộm GUS Điểm hạn chế của nghiên cứu là nồng độ kanamycin để chọn lọc câychuyển gen là 20 mg/l ảnh hưởng đến hiệu quả cảm ứng tạo callus 4 tuần sau khi