2.5.1. Phương pháp thử GUS
Đây là phương pháp dùng để kiểm tra gen chỉ thị gusA. Năm 1987, thử nghiệm GUS đã được đưa ra bởi Jefferson. Thử nghiệm rất nhạy, vừa có khả năng định lượng vừa có khả năng định tính. Trong tự nhiên, β-glucuronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật. Mặt khác, sản phẩm màu của gusA rất bền và phản ứng rất ít bị ảnh hưởng của pH nên rất thuận lợi cho việc theo dõi. Có thể thử GUS ngay trên mô thực vật hay tế bào bằng các thao tác hiển vi: cắt mô, nhuộm với X-Gluc và theo dõi màu. Cũng có thể thu các số liệu định lượng bằng cách so màu trên quang phổ huỳnh quang.
Chất thường dùng để định tính β-glucuronidase trong mô và tế bào là 5-brom-4- chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc). Chất này hoạt động tốt, cho màu xanh chàm tại nơi có eyzyme hoạt động (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Hình 2.6 Phản ứng tạo màu của X-gluc dưới tác dụng của enzyme β – glucuronidase. 2.5.2. Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ (PPT) của cây tái sinh
Phân tích tính kháng thuốc là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng thuốc thông qua hoạt động của gen chuyển, có thể là thuốc kháng sinh như kanamycin khi dùng gen nptII hoặc hygromycin khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar. Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ trạng thái tế bào đến mô sẹo, chồi tái sinh, cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt (Lê Trần Bình, 2008) .
Các cây nhận được từ thí nghiệm chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường có kháng sinh hay PPT với nồng độ tùy thuộc vào loại thực vật khác nhau để theo dõi khả năng sinh trưởng của cây. Trong điều kiện nuôi cấy như trên, cây được chuyển gen sẽ sinh trưởng bình thường trong khi cây không chuyển gen sẽ chết.
2.5.3. Sử dụng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen ở thực vật
PCR là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để kiểm tra đánh giá kết quả chuyển gen ở mức độ phân tử. Trước tiên, phải tách chiết DNA thực vật với phương pháp thích hợp. Do PCR rất nhạy nên lượng mẫu dùng để tách chiết DNA cũng rất nhỏ (5 – 10 mg) lượng DNA được tách chiết tương ứng từ 1 ng đến 1 µg.
PCR khuếch đại số lượng lớn đặt trưng cho gen chuyển vào tế bào. Vì vậy, luôn cần có hai đoạn mồi 5’ và 3’ đặt trưng cho mỗi DNA hay gen ngoại lai. Các đoạn mồi này có tên chung là mồi đặc trưng (specific primers) thường có kích thước từ 20 – 30 bp và là các nucleotide tổng hợp.
Phản ứng PCR ở thực vật thường tiến hành qua 40 – 45 chu kỳ, sau koảng 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ đạt 106 so với mẫu ban đầu (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
Nếu trong thực vật xuất hiện gen mới do kỹ thuật chuyển gen, sau khi chạy PCR với mồi đặc trưng, có thể phát hiện gen đó trên bản điện di.
2.5.4. Phương pháp Southern blot xác định gen ngoại lai trong bộ gen của cây
Southern (1975) là người đầu tiên đã mô tả quá trình chuyển DNA từ màng agarose gel đến màng nitrocellulose, cho nên được gọi là “Southern blot”. Theo phương pháp này, được gọi là “lai có hỗn hợp pha với nhau”. Một nucleic acid gắn vào màng, nucleic acid khác là thể probe được đánh dấu. Phương pháp Sourther blot trở thành phương pháp rất quan trọng, có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu như là nghiên cứu cấu trúc gen, tổ chức genome, kiểm soát sự biểu hiện gen, Chuẩn đoán bệnh di truyền, phát hiện các pathogen thuộc về virus, vi khuẩn, nấm, v.v..
Phương pháp Southern blot chứng minh được sự hợp nhất của gen ngoại lai vào bộ genome cây đang nghiên cứu, bằng cách lai với phân tử DNA, phân tử cao không bị phân cắt, sử dụng các plasmid đóng vai trò như thể thăm dò (probe). Sau khi phân cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn tại các vị trí mục tiêu của plasmid DNA. Các sản phẩm lai được quan sát từ việc phân cắt DNA của genome, không có gen lạ chuyển nạp, tạo ra thể đa hình (polymorphism) như một chức năng của những vị trí hợp nhất vào genome. Sự có mặt của những bản sao nguyên vẹn các gen có thể được chứng minh nhờ kỹ thuật phân cắt DNA bằng enzyme tương ứng, làm cho cấu trúc gen chuyển nạp thể hiện rõ, tiếp theo đó là kỹ thuật probing với một phần của chuỗi mà này (gen chuyển nạp). Nếu một copy nguyên vẹn của gen ngoại lai có mặt, nó sẽ tạo ra sản phẩm lai (với probe) có cùng kích thước như plasmid DNA bị cắt bởi enzyme (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Sự phát hiện chuỗi DNA có tính chất tương đồng với probe, nhờ phương pháp Southern blot là một đóng góp to lớn trong sinh học phân tử, đặc biệt là trong kỹ thuật “recombinant DNA”, và phân tích sự thể hiện gen được chuyển nạp.
2.6. Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam
Nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen là công nghệ mới ở Việt Nam do kỹ thuật phức tạp. Năm 2008, chính phủ ban hành Nghị định về sử dụng sinh vật biến đổi gen đã thúc đẩy công tác nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen ở nước ta. Nhiều đề tài, dự án nghiên cứu sinh vật biến đổi gen, trong đó có cây trồng chuyển gen được đầu tư về kinh phí, thiết bị, kỹ thuật hiện đại. Chính vì thế những công trình nghiên cứu về chuyển gen ngày càng được phát triển và đã đem lại một số thành tựu nhất định.
Các nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan trọng đầu tiên được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý có giá trị ứng dụng cao tiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên những giống lý tưởng. Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao gồm gen chịu hạn, lạnh, kháng bệnh ở lúa; gen cry và vip mã hóa các protein độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gen mã hóa protein bất hoạt hóa ribosome ở cây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng, gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ, gen mã hóa kháng nguyên vỏ của các chủng virus dại, v.v.. Song song với những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm trên cả nước.
Theo Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (2004), bộ môn Công nghệ Sinh học đã chuyển nạp thành công nhiều dòng lúa biến đổi gen giàu vitamin A, sắt và protein. Các tác giả đã sử dụng một vector mang bảy gen khác nhau gồm hai gen crtI và psy
điều khiển tính trạng tổng hợp beta carotene, ba gen irtI, nas và pfe mang tính trạng hấp thu sắt, cố định sắt và gia tăng hàm lượng sắt trong hạt lúa, gen asp cải thiện phẩm chất protein và gen pmi để chọn lọc trong môi trường đường mannose. Các dòng lúa này đang tiếp tục trồng ở thế hệ T2 và T3 để theo dõi. Bộ môn Công nghệ Sinh học cũng đã bước đầu xây dựng quy trình chuyển nạp gen trên các giống bông vải SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pManCa (Hòa và Bổng, 2003) có gen chọn lọc trong môi trường mannose. Các tác giả đã sử dụng phương pháp của Satyapathi và ctv (2002) với nhiều cải tiến và lấy đỉnh chồi làm vật liệu chuyển gen. Kết quả đã tạo được 15 dòng chuyển nạp gen, các dòng này được li trích DNA và phân tích Southern bot.
Năm 2005, phòng Công nghệ Sinh học tiếp tục thử nghiệm quy trình chuyển gen bằng A. tumefaciens trên giống đậu nành Bert với các vector khác nhau mang các gen
Bt, gen chỉ thị gus và các gen chọn lọc pmi hoặc hpt. Kết quả đã tạo được 10 dòng đậu nành biến đổi gen với các vector pManca (Hòa và Bổng, 2003) và pTOK233 (Hiei, 1994) (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2005).
Năm 2008, Trần Thị Cúc Hòa và ctv đã thành công trong việc chuyển gen bar và gen gusA vào cây đậu nành giống PC19 bằng A. ttumefaciens thông qua nốt lá mầm.
Tại Viện Sinh học nhiệt đới, các nhà khoa học đã tạo được cây thuốc lá, lúa, đậu xanh, cải bông, cải xanh và cây cà tím GM mang gen cry kháng côn trùng, gen kháng thuốc diệt cỏ. Trần Thị Dung và ctv (2006) đã thực hiện thành công quy trình chuyển gen trên giống thuốc lá K326 bằng vi khuẩn A. tumefaciens dòng EHA105. Plasmid được sử dụng mang tên pITB2 mang gen cryIA(c) (gen Bt) kháng sâu thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera, gen bar kháng hoạt chất trừ cỏ phosphinothricin (PPT) và gen gus
được dùng làm gen chỉ thị. Hiện nay, viện đang thực hiện chuyển gen vào cây thân gỗ sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 chứa Ti-plasmid ITB mang gen cry
kháng côn trùng, gen bar và gen chỉ thị gusA. Một trong những hướng nghiên cứu mới là chuyển gen vào lục lạp. Nguyễn Thị Thanh và nhóm nghiên cứu phòng công nghệ gen Thực vật, viện Sinh học Nhiệt đới đã thực hiện đề tài “nghiên cứu ứng dụng công nghệ chuyển gen vào lục lạp tạo ra thực vật sản xuất protein tái tổ hợp để ứng dụng trong y học”. Đề tài đã tạo được dòng thuốc lá và cà chua chuyển gen có thể sản xuất protein vỏ virut HIV bằng phương pháp bắn gen vào lục lạp. Đây là một trong những thành tựu nổi bật thuộc lĩnh vực công nghệ gen thực vật.
2.7. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chuyển gen trên cây Jatropha
Mã Yến Thanh, Đại học Nông Lâm Tp.HCM, đã thực hiện đề tài “Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”. Đề tài đã đưa ra nồng độ kháng sinh kanamycin dùng chọn lọc mẫu phôi và lá mầm chưa chuyển gen là 30 mg/l. Nồng độ PPT 1,5 mg/l dùng cho chọn lọc lá mầm và 1 mg/l dùng chọn lọc phôi chưa chuyển gen. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101pIB- GUS do Jabcobsen cung cấp mang plasmid pGII0229 (gồm các gen bar kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA) đã được sử dụng để chuyển vào cây J. curcas. Bước đầu ghi nhận kết quả biểu hiện của gen gusA được chuyển vào genome của cây cho thấy rằng hiệu quả chuyển gen đạt 40% ở phôi và 66,67% ở lá mầm khi ủ trong dịch khuẩn thời gian là 30 phút, đồng nuôi cấy trong 4 ngày.
Trên thế giới, có không nhiều các nghiên cứu chuyển gen vào cây Jatroha cuscas
L. Các công trình nghiên cứu đã thu được một số kết quả đáng chú ý. Meiru Li và ctv (2007) đã thiết lập phương pháp chuyển gen vào lá mầm (cotyledon disc) cây
Jatropha curcas L. bằng Agrobacterium. Đây là lần đầu tiên cây Jatropha chuyển gen được tạo ra thành công. Tác giả cho rằng sử dụng vi khuẩn Agrobacterium chủng
LBA4404 để chuyển gen và chọn lọc bằng PPT thì hiệu quả hơn chủng EHA105 và chọn lọc bằng hygromycin. Kết quả của nghiên cứu là khoảng 55% mẫu lá mầm tạo được callus kháng PPT trên môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l benzyladenine (BA), 0,05 mg/l 3–indolebutyric acid (IBA), 1 mg/l PPT và 500 mg/l cefotaxim sau 4 tuần. Tiếp theo là chuyển callus lên môi trường tạo chồi chứa 1,5 mg/l BA, 0,05 mg/l IBA, 0,5 mg/l gibberellic acid (GA3), 1 mg/l PPT và 250 mg/l cefotaxim, khoảng 33% callus kháng biệt hóa thành chồi. Cuối cùng chồi được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l IBA đạt tỉ lệ 78%. Kết quả khoảng 13% mẫu nuôi cấy tạo được cây chuyển gen sau 4 tháng.
Năm 2008, Li và ctv tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào lá mầm cây Jatropha
bằng Agrobacterium, cũng trong thời gian đó Lie và ctv đã tiến hành nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào cây Jatropha bằng phương pháp
Agrobacterium và đánh giá kiểu hình mô sẹo đã được chuyển gen. Nghiên cứu đã đưa ra được các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp như loại mẫu, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất cho biểu hiện GUS là 2 ngày, mật độ vi khuẩn, nồng độ acetosyringone giúp tăng hiệu quả chuyển gen.
Tiếp theo những công trình nghiên cứu của các năm trước, năm 2009 nghiên cứu thiết lập quy trình chuyển gen vào cây Jatropha curcas L. do Trivedi và ctv thực hiện đã tìm ra được nồng độ acetosyringone và thời gian ngâm mẫu cho hiệu quả chuyển gen cao.
Gần đây Jingli Pan và ctv (2010) đã trình bày hệ thống chuyển gen hiệu quả vào lá mầm của hạt trưởng thành, sử dụng kanamycin để chọn lọc. Sử dụng môi trường tái sinh là MS-Jc1 (môi trường MS với 3 mg/l BA và 0,01 mg/l IBA). Môi trường tạo callus (CIM, MS-Jc1 với 300 mg/l cefotaxim) trong 4 tuần đầu sau khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium. Sau đó chuyển lên môi trường tạo chồi (SIM, MS-Jc1 với 20 mg/l kanamycin và 100 mg/l cefotaxim) để chọn lọc thể chuyển gen, chồi kháng kanamycin thu được sau 6 - 8 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên việc tạo rễ rất khó khăn, chỉ 1 trên 120 chồi tái sinh có thể tạo rễ thành công trên môi trường (RM, 1/2 MS với 0,3 mg/l IBA, 20 mg/l kanamycin và 100 mg/l cefotaxim) sau 4 - 5 tuần. Việc cài nhập và biểu hiện của gen chuyển nạp trên cây J. curcas được kiểm tra bằng phản ứng PCR, nhuộm GUS. Điểm hạn chế của nghiên cứu là nồng độ kanamycin để chọn lọc cây chuyển gen là 20 mg/l ảnh hưởng đến hiệu quả cảm ứng tạo callus 4 tuần sau khi
đồng nuôi cấy với Agrobacterium. Các cây tái sinh kháng kanamycin đã được tạo ra thành công với hiệu suất là 30,8%.
Hua Zong và ctv (2010) đã thực hiện đề tài chuyển gen LIF thông qua vi khuẩn
Agrobacterium. Hạn chế phân nhánh được coi là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến năng suất hạt cây Jatropha curcas L. Để cây phân nhánh nhiều hơn, gen LIF sẽ được chuyển vào hệ gen cây J. curcas. Nhóm tác giả đã phát triển một cách thức chuyển gen an toàn và hiệu quả bằng cách sử dụng A. tumefaciens chủng LBA4404 xâm nhiễm vào lá non cây J. curcas. Các thông số tối ưu của quá trình được xác định như chủng vi khuẩn, nồng độ vi khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy, thời gian ngâm mẫu và nồng độ cefotaxim, kanamycin. Kết quả được ghi nhận nồng độ vi khuẩn tối ưu là OD600 = 0,1, thời gian nhúng mẫu vào vi khuẩn là 10 phút, thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày cho hiệu quả chuyển gen cao nhất, nồng độ cefotaxim cao nhất là 300 mg/l, ở nồng độ này mẫu lá có thể tạo callus tái sinh được mà không quan sát thấy sự tái nhiễm của vi khuẩn. Gen LIF đã được chuyển vào mẫu và được kiểm tra bằng phương pháp PCR với hiệu quả chuyển gen đạt được 23,91 ± 5,78%. Đây là quy trình chuyển gen vào lá non hiệu quả của Jatropha curcas L. và áp dụng qui trình này để chuyển gen LIF vào trong bộ gen của J. curcas.
Hai nghiên cứu khác cũng đã được báo cáo vào năm 2010 về chuyển gen vào cây
Jatropha. Purkayastha và ctv đã phát triển quy trình tái sinh cây nhanh chóng và hiệu quả từ đỉnh chồi thu nhận từ hạt trưởng thành và đưa DNA trực tiếp vào chồi đỉnh của hạt trưởng thành bằng phương pháp bắn gen. Plasmid pBI426, có chứa gen nptII
kháng kanamycin và gen GUS đặt dưới sự kiểm soát của promoter CaMV53S được sử dụng. Các tham số bắn phá như: kích thước màng lọc, khoảng cách điểm bắn tới tế bào, áp suất khí helium đã được khảo sát. Mẫu J. curcas chuyển gen được kiểm tra bằng nhuộm GUS, phân tích PCR sử dụng mồi gen GUS, Southern blot để kiểm tra biểu hiện gen NPT-II. Mazumdar và ctv (2010) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi và vị trí của mẫu lên quá trình cảm ứng tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mảnh cắt lá mầm
J. curcas. Báo cáo cho thấy hiệu quả tái sinh từ mẫu lá mầm của hạt đang nảy mầm