- Môi trường LB (Luria Bertani) (Sambrook và ctv, 1989) - CaCl2
- Phosphinothricin (PPT) - X-gluc (Sigma)
- Các loại kháng sinh: meropenem (Việt Nam), cefotaxim (Ấn Độ), cyprofloxacin (Ba Lan), kanamycin (Việt Nam)
- Acetosyringone (Sigma)
- Bộ kít ly trích plasmid vi khuẩn: Kit QIAprep spin
3.2.3.3. Hoá chất dùng trong phản ứng PCR (hóa chất Sinh học phân tử của
Fermentas)
- PCR buffer 10X - MgCl2
- dNTPs
- Taq polymerase
- Primer đặc hiệu cho gen bar: trình tự gen bar được khuếch đại với cặp mồi F và R:
F: 5' -GTC TGC ACC ATC GTC AAC C- 3' R: 5' -GAA GTC CAG CTG CC AGA AAC- 3'
3.2.4. Thiết bị dùng trong thí nghiệm
- Tủ cấy vô trùng (Microflow Advanced Bio Safety Cabinet-Class II) - Cân điện tử (Ohaus)
- Máy li tâm lạnh (Hettich) - Máy khuếch đại DNA (Biorad) - Máy điện di (Biorad)
- Pipette các loại (Biorad) - Đầu típ các loại (Biorad) - Erlen 250 ml
- Đĩa petri - Kính hiển vi - Máy chụp ảnh
3.3. Phương pháp thí nghiệm
3.3.1. Khảo sát khả năng diệt khuẩn của ba loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và ciprofloxacin lên chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101
Mục đích thí nghiệm: Xác định chủng loại và nồng độ kháng sinh phù hợp diệt khuẩn hiệu quả nhưng không ảnh hưởng đến sức sống của mẫu phôi Jatropha.
Cách thực hiện: Hạt Jatropha trước khi tách phôi được khử trùng theo quy trình khử trùng hạt của Mã Yến Thanh (2011)
Hình 3.3 Quy trình khử trùng hạt Jatropha (Mã Yến Thanh, 2011).
Hạt sau khi khử trùng, được tách bỏ lớp vỏ lụa bên ngoài và lớp thịt hạt, bỏ hai lá mầm. Mẫu phôi Jatropha được tiền nuôi cấy 2 ngày trên môi trường MS, đem xâm nhiễm với dịch khuẩn đạt giá trị OD600 nm khoảng 0,5 – 0,6, ngâm mẫu trong 30 phút. Sau đó đồng nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Sau 2 ngày, mẫu được lấy ra rửa 3 lần với nước cất tiệt trùng, và tiếp tục tiến hành rửa mẫu 3 lần với các loại kháng sinh như cefotaxim, meropenem và ciprofloxacin ở các nồng độ khác nhau. Sau khi rửa kháng sinh, mẫu sẽ được rửa lại bằng nước cất 2 lần và đặt mẫu trên giấy thấm đến khi khô ráo để cấy vào môi trường chọn lọc.
Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian tái nhiễm khuẩn và tình trạng mẫu cấy được theo dõi định kỳ từng ngày một.
3.3.2. Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc có chứa gen bar
Vì mỗi chủng Agrobacterium có khả năng chuyển gen vào thực vật ở tần suất khác nhau nên chúng tôi sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có ký hiệu là GV3580 (cung cấp bởi viện Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM) làm vector chuyển gen. Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc nằm trong chủng vi khuẩn do Jacobsen thiết kế (2007). Do đó, trước khi chuyển gen, plasmid được ly trích và tiến hành biến nạp vào chủng Agrobacterium GV3580.
Các bước tiến hành trong việc tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc:
- Kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong vi khuẩn bằng cách ly trích plasmid, điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose.
- Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp hóa biến nạp.
- Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc và gen bar trong chủng GV3580 sau khi biến nạp bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc.
3.3.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc trong tếbào vi khuẩn bào vi khuẩn
Mục đích thí nghiệm: Nguồn vi khuẩn có chứa plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc qua quá trình vận chuyển và tồn trữ lâu dài có thể sẽ phát sinh những đột biến hoặc sẽ loại thải plasmid ra khỏi tế bào vi khuẩn. Vì vậy, cần tiến hành ly trích plasmid và kiểm tra để làm vật liệu cho bước biến nạp.
Cách thực hiện: Vi khuẩn giữ ở -700C, được cấy lên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/ml) (chỉ bổ sung kháng sinh khi bề mặt thạch đã nguội). Đĩa vi khuẩn được ủ trong tối ở 280C. Sau 48 giờ, trên bề mặt đĩa xuất hiện khuẩn lạc đặc trưng của vi khuẩn. Bắt khuẩn lạc đơn tăng sinh trên môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin (50 mg/ml), ở 280C, trong vòng 16 giờ, ở tốc độ lắc 150 vòng/phút. Đồng thời cấy vi khuẩn sang đĩa mới để giữ giống vi khuẩn. Sau đó, dịch tăng sinh được ly tâm, thu sinh khối và tiến hành ly trích plasmid bằng bộ kit QIAprep Spin Miniprep, plasmid được tiến hành kiểm tra kích thước bằng cách điện di trên gel agarose, và bảo quản plasmid ở - 200C.
3.3.2.2. Chuẩn bị tế bào khả nạp
Mục đích: Chuẩn bị chủng Agrobacterium tumefaciens cho quá trình biến nạp được thực hiện tiếp theo sau.
Cách thực hiện: Hút 20 µl dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3 ml môi truờng LB lỏng, đem ống nghiệm đi nuôi cấy lắc trong vòng 3 – 4 giờ. Sau khi tăng sinh, ống nghiệm chứa vi khuẩn được chuyển vào thùng nước đá giữ lạnh trong 10 phút. Sau đó hút 1,5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1,5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Ðổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dưới (lặp lại buớc này đến khi hết dịch nuôi cấy). Tiếp theo, cho 1 ml CaCl2 100 mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu được, vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa. Đem eppendorf đi ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, sau khi ly tâm tiến hành đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngược eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Sau đó thêm
150 µl CaCl2 100 mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên. Thêm 20 µl glycerol vào và trữ ở -700C.
Tế bào khả nạp được được bảo quản ở -700C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản tế bào khả nạp được lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích tế bào khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng.
3.3.2.3. Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
Mục đích: Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp 148 luc
Cách thực hiện: Quá trình biến nạp được thực hiện theo quy trình như sau (quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi):
Hút 30 μl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 μl, thêm 3 μl DNA plasmid vào (65 ng/μl), đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Tiếp theo, chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 45 giây, chuyển nhanh eppendorf trên vào đá lạnh, giữ trong 2 phút. Thêm vào eppendorf 800 μl môi trường LB lỏng và ủ ở 370c trong 45 phút. Hút 150 µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh kanamycin với nồng độ 50 μg/ml dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt sau đó lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370C. Lặp lại quy trình trên nhưng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm mẫu đối chứng.
Hì nh 3.4 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn.
3.3.2.4. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc và gen bar
trong chủng GV3580 sau khi biến nạp
Sau khi biến nạp, chúng tôi tiến hành kiểm tra plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc và gen bar trong chủng GV3850 để chuẩn bị cho quá trình chuyển gen tiếp theo.
Sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc trong tế bào vi khuẩn được tiến hành bằng cách sàng lọc vi khuẩn trên môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin. Sau đó, kỹ thuật PCR khuẩn lạc được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của gen bar, kết quả phản ứng PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
Thực hiện phản ứng PCR: Primer do Jacobsen (2007) thiết kế với trình tự sau đây đã được sử dụng để khuếch đại vùng mã hóa gen bar trong plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc:
F: 5’ - CCT GTA GAA ACC CCA ACC CG - 3’ R: 5’ - TGG CTG TGA CGC ACA GTT CA - 3’
Bảng 3.1 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR
Hoá chất Dung dịch stock Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X DNA 50 ng/µl 1 µl 50 ng dNTPs 10 mM 1 µl 0,4 mM Primer (F) Primer (R) 5 µM5 µM 1 µl1 µl 5 µM5 µM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 µl 1 U MgCl2 50 mM 0,75 µl 1,5 mM H2O cất 17,55 µl Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 25 µl
Bảng 3.2 Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR
Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) Chu kỳ
1 94 60 1 2 9462 72 45 45 45 34 3 72 300 1 Điện di:
- Chuẩn bị gel agarose nồng độ 1%: Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml dung dịch TBE 0,5 X. Đun sôi dung dịch agarose trong lò viba ở bước sóng 650 W cho đến khi tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch agarose đến nhiệt độ khoảng 550C và rót nhẹ nhàng vào khay điện di.
- Load mẫu: 5 µl sản phẩm DNA và 1 µl loading dye 6 X.
- Nhuộm mẫu: Sau khi chạy điện di xong thì ngâm gel trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút. Sau khi ngâm xong, vớt gel ra và rửa bằng nước trong 1 phút và đem chụp ảnh dưới tia UV. Dựa vào băng hình xuất hiện DNA và đánh giá sự xuất hiện của gen chuyển nạp.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến sự sinh trưởng của cây Jatrophain vivo
Khả năng kháng thuốc diệt cỏ đã được De Greef và ctv (năm 1989) khảo sát trên một vài loại cây trồng. Ngô được chuyển gen kháng côn trùng (Armstrong và ctv, 1995; Koziel và ctv, 1993) đã sử dụng gen bar kháng PPT làm tác nhân chọn lọc sau khi chuyển gen.
Mục đích: Nhằm xác định ngưỡng gây chết của PPT đối với cây Jatrophain vivo
để phục vụ cho công tác chọn lọc về sau.
Cách thực hiện: Hạt Jatropha được trồng ra đất, chia thành 5 lô, mỗi lô 30 hạt, khi cây đạt 3 tuần tuồi tiến hành phun PPT ở các lô với các nồng độ 0; 100; 200, 300 và 400 mg/l.
Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận sự đổi màu của lá, tỷ lệ chết của cây sau khi phun PPT ở các nghiệm thức.
3.3.4. Lây nhiễm mẫu Jatropha với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc
3.3.4.1. Chuẩn bị dịch vi khuẩn
Chọn 1 khuẩn lạc đơn nuôi cấy trong ống falcon 15 ml chứa 5 ml môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin sulphate. Đặt ống falcon chứa môi trường LB vào trong tủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 12 - 16 h ở nhiệt độ 280C. Đo trị số OD, OD600 nm = 0,5 - 0,6 thì tiến hành ly tâm để thu sinh khối (môi trường nuôi vi khuẩn được ly tâm với vận tốc 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, loại bỏ phần dịch nổi bên trên), pha loãng sinh khối bằng môi trường MS lỏng (pH 7,2). Dịch khuẩn sau đó được sử dụng cho hai thí nghiệm chuyển gen vào phôi và vào hạt nảy mầm.
3.3.4.2. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào phôi Jatropha curcas L. bằng A. tumefaciens
Theo Sunjung Park (2006) trong quá trình xâm nhiễm mẫu với vi khuẩn, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển nạp gen. Một số yếu tố ảnh hưởng nhiều đến
hiệu quả chuyển gen như là thời gian ngâm mẫu, thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ acetosyringone, loại mẫu cấy, xử lý tiền nuôi cấy mẫu. Do đó, thí nghiệm này được tiến hành nhằm khảo sát một số yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến quá trình chuyển nạp, từ đó có thể tìm ra một quy trình chuyển nạp gen cho hiệu quả tối ưu, nâng cao hiệu suất chuyển gen, và số lượng mẫu chuyển gen được tái sinh.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens.
Mục đích: Khảo sát hiệu quả chuyển nạp gen và sức sống trên hai loại mẫu phôi tiền nuôi cấy (2 ngày) và phôi không tiền nuôi cấy khi được tiến hành xâm nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens.
Cách thực hiện: Hạt Jatropha được khử theo quy trình của Mã Yến Thanh (2011), tách vỏ và thu nhận phôi. Nguồn mẫu để đồng nuôi cấy gồm:
- Mẫu phôi không tiền nuôi cấy
- Mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày trên môi trường MS
Hai loại mẫu trên được nuôi cấy ở với dịch vi khuẩn có giá trị OD600 nm là 0,5 – 0,6, bổ sung acetosyringone đạt nồng độ cuối là 100 µM, thời gian ngâm mẫu là 30 phút. Mẫu được đồng nuôi cấy 2 ngày, sau đó tiến hành nhuộm GUS, chọn ra nghiệm thức tốt nhất khảo sát hai yếu tố là thời gian ngâm mẫu, nồng độ Acetosyringone. Mẫu đối chứng được thay dịch khuẩn bằng nước cất.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 đĩa, mỗi đĩa 30 mẫu. Chọn ngẫu nhiên 8 mẫu đem tiến hành nhuộm GUS, kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn trên và xung quanh mẫu cấy, sức sống của mẫu, tính phần trăm mẫu thử GUS có tín hiệu dương tính.
Kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA: Theo Jacobsen và ctv (2007), việc nhuộm GUS trên mẫu cấy nên được thực hiện vào ngày thứ 2 và thứ 4 sau khi nuôi chung với vi khuẩn. Thành phần dịch đệm Phosphate Buffer được cải tiến gồm có 0,1M Na2HPO4, 0,1M NaH2PO4, 10mM EDTA, 0,5 mM K4[Fe(CN)6], 0,5 mM K3[Fe(CN)6], 2% formaldehyde, 0,1% Triton-X100, pH 7. X-gluc được pha trong DMSO, trữ trong tối ở 40C, được bổ sung vào dung dịch đệm Phosphate Buffer để đạt nồng độ 1 mg/ml X-gluc trước khi thí nghiệm. Sau khi đã bổ sung X-gluc, lúc này Phosphate Buffer sẽ được gọi là Equilibration buffer. Các bước của quy trình nhuộm GUS sẽ được trình bày trong sơ đồ như hình 3.5 dưới đây.
∑ mẫu biểu hiện GUS
∑ mẫu quan sát x 100
Hình 3.5 Sơ đồ các bước của quy trình nhuộm GUS.
Mẫu sau khi nhuộm GUS sẽ được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 4X, mẫu có màu xanh chàm chính là mẫu được biểu hiện GUS
Chỉ tiêu theo dõi:
Phần trăm số mẫu biểu hiện GUS =
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và nồng độ acetosyringone đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens.
Mục đích: Xác định nồng độ acetosyringone và thời gian ngâm mẫu tối ưu để gia tăng hiệu quả chuyển gen.
Cách thực hiện: Sau khi chọn được nguồn mẫu cho hiệu quả biến nạp cao nhất từ thí nghiệm 1, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone và thời gian ngâm mẫu lên hiệu quả chuyển gen ở ba mức nồng độ acetosyringone là 0 µM, 100 µM, 200 µM, kết hợp với thời gian ngâm mẫu 15 phút, 30 phút và 45 phút.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 đĩa, một đĩa 30 mẫu. Mỗi nghiệm thức được chọn ngẫu nhiên 8 mẫu đem tiến hành nhuộm GUS (sơ đồ 3.3) để kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA.
Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận số lượng mẫu chết, và phần trăm mẫu biểu hiện GUS ở từng nghiệm thức sau khi đồng nuôi cấy 2 ngày.
3.3.4.3. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm
Phương pháp xâm nhiễm Agrobacterium vào hạt nảy mầm đã được thực hiện từ rất sớm trên một số đối tượng như ngô, đậu nành, Arabidopsis thaliana. Năm 1989, Chee và ctv đã tiến hành xâm nhiễm hạt đậu nành đang nảy mầm với vi khuẩn A. tumefaciens bằng cách tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào vùng chồi đỉnh, vùng đốt lá mầm và các vùng lân cận. Efedi và ctv (1999) xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu đậu nành và đậu đỏ bằng ba cách: tiêm vào hạt đang nảy mầm, tạo vết thương kết hợp với đánh siêu âm và phương pháp hút chân không. Vì vậy, thí nghiệm này đã được tiến hành