acetosyringone đến hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens
Theo Shahla và Donald (1987) acetosyringone là chất hỗ trợ đắc lực giúp tăng hiệu quả biến nạp khi chuyển nạp gen bằng Agrobacterium. Tuy nhiên, mỗi đối tượng thực vật khác nhau sẽ thích ứng với chất này ở một nồng độ khác nhau. Hiệu quả của acetosyringone được thể hiện qua số mẫu dương tính với thuốc thử GUS và số mẫu còn sống sót sau 2 ngày đồng nuôi cấy.
Kết quả phân tích thống kê (bảng 4.4) cho thấy khi không bổ sung acetosyringone, tỷ lệ biểu hiện GUS tăng theo thời gian ngâm mẫu, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa giữa các nghiệm thức. Ở nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS cao nhất, nhưng khi bổ sung 200 µM acetosyringone thì biểu hiện GUS cao nhất lại ở 45 phút. Tuy nhiên ở cả 2 trường hợp
trên sự khác giữa các nghiệm thức đều không có ý nghĩa về mặt thống kê, và chỉ có khác biệt lớn so với nghiệm thức ngâm mẫu 15 phút. Số lượng mẫu có biểu hiện màu xanh chàm đặc trưng cao nhất trong tổng số mẫu quan sát là ở NT9, 75%, tiếp theo là các NT5 (70,83 %), NT6, NT8 (66,67%) và thấp nhất là NT1 (41,67%) và NT4 (45,83%). Dựa vào kết quả xử lý có thể thấy có sự khác biệt giữa NT9 và các nhóm nghiệm thức còn lại, và cũng cho thấy cả hai yếu tố là thời gian ngâm mẫu và nồng độ acetosyringone đều ảnh hưởng đến sự biểu hiện GUS (P < 0,05).
Bảng 4.4 Kết quả nhuộm GUS ở các nghiệm thức chuyển gen
Nghiệm
thức acetosyringone (µM)Nồng độ Thời gian ngâmmẫu Tỷ lệ mẫu biểu hiệngen gusA (%) NT1 0 15 41,67 c NT2 30 58,33abc NT3 45 54,17bc NT4 100 15 45,83 c NT5 30 70,87ab NT6 45 66,67ab NT7 200 15 54,17 bc NT8 30 66,67ab NT9 45 7500a
Trong cùng một cột các số trung bình có cùng ký tự không có sự khác biệt về mặt thống kê ở mức P<0,01.
Kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy, khi không bổ sung acetosyringone, mẫu vẫn có biểu hiện GUS nhưng hiệu quả không cao, màu xanh chàm chỉ xuất hiện thành từng chấm nhỏ tại vùng đỉnh chóp của phôi và tại một số vị trí tạo vết thương. Kết quả này chứng tỏ khi không có acetosyringone, vi khuẩn vẫn có khả năng xâm nhiễm vào mẫu. Điều này có thể do mẫu bị thương tiết ra các hợp chất phenol dẫn dụ vi khuẩn giống như acetosyringone.
Ở nồng độ acetosyringone bổ sung vào dịch khuẩn là 100 µM, màu xanh chàm đậm, lan rộng ra các vùng xung quanh và dọc theo mạch dẫn của mẫu (hình 4.7), tỷ lệ dương tính cao, mẫu sau 4 ngày đồng nuôi cấy vẫn phát triển tốt. Điều này chứng tỏ, acetosyringone ở nồng độ 100 µM cho biểu hiện GUS cao và không ảnh hưởng đến mẫu nuôi cấy.
Khi tăng nồng độ acetosyringone lên 200 µM, so với kết quả các NT ở nồng độ 0, 100 µM có cùng thời gian ngâm mẫu, tỷ lệ biểu hiện GUS ở nồng độ acetosyringone
C D
A B
200 µM có cao hơn nhưng không đáng kể. Số liệu giữa các nhóm nghiệm thức này không có sự khác biệt về mặt thống kê (bảng 4.4).
Hình 4.7 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày; A. Đối chứng; B. Mẫu phôi ở NT9; C. Mẫu phôi ở NT 3; D. Mẫu phôi ở NT 6.
Mũi tên đỏ chỉ vị trí biểu hiện GUS.
Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 4X cho thấy màu xanh chàm xuất hiện nhiều tại vùng chóp đỉnh, vùng biểu bì, vùng vết cắt và bị thương, dọc theo mạch dẫn của các mẫu dương tính.
Theo kết quả của He và ctv (2008) tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu trụ mầm, khi không có acetosyringone hiệu quả biểu hiện GUS là 42,4%, bổ sung 100 µM acetosyringone vào dịch khuẩn trước khi xâm nhiễm mẫu, biểu hiện GUS tăng lên 67,7%. Với các loại mẫu khác như rễ, cuống lá, v.v. biểu hiện GUS đều cao hơn khi có mặt acetosyringone.
Tuy nhiên, khi tăng nồng độ acetosyringone lên 200 µM, kết quả quan sát mẫu sau 2 ngày đồng nuôi cấy cho thấy, mẫu bắt đầu giảm sức sống, không phát triển thêm được nữa (hình 4.8). Từ đó có thể đưa ra kết luận, khi tăng nồng độ acetosyringone có thể làm tăng biểu hiện GUS tạm thời nhưng sức sống của mẫu bị ảnh hưởng.
Thời gian ngâm mẫu cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp gen, thử nghiệm thời gian ngâm mẫu với dịch khuẩn cho thấy: khi tăng thời gian ngâm mẫu lên, số mẫu biểu hiện GUS cũng tăng lên, nhưng không có sự khác biệt đáng kể giữa hai nghiệm thức liền kề nhau (bảng 4.4). Khi tăng thời gian ngâm mẫu với dịch khuẩn sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn bám và xâm nhập vào mẫu dễ dàng hơn. Tuy nhiên, mẫu ngâm trong dịch khuẩn lâu sẽ giảm sức sống, vi
A B C
khuẩn bám nhiều lên mẫu, phát triển nhiều, bao phủ bề mặt mẫu, sẽ khó diệt khuẩn và tái sinh hơn .
Hình 4.8 Mẫu phôi Jatropha (tiền nuôi cấy 2 ngày) đồng nuôi cấy 2 ngày với vi khuẩn A. tumefaciens ở nồng độ acetosyringone và thời gian khác nhau;
A. NT1; B. NT5; C. NT9.
Mỗi chủng vi khuẩn khác nhau hiệu quả chuyển nạp gen cũng khác nhau. Trong thí nghiệm này, chủng vi khuẩn được sử dụng để xâm nhiễm là chủng GV 3580. Tại thời gian ngâm mẫu là 30 phút, 100 µM acetosyringone, biểu hiện GUS đạt 66,67%. Kết quả của Mã Yến Thanh (2011), sử dụng chủng EHA101, ở nồng độ 100 µM acetosyringone, 30 phút ngâm mẫu, tỉ lệ biểu hiện GUS trên mẫu phôi là 20% sau 2 ngày đồng nuôi cấy. So sánh hai kết quả trên có thể đưa ra nhận định ban đầu rằng vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580 cho hiệu quả biến nạp cao hơn chủng EHA101.
Bởi vì gen vir được cảm ứng tốt ở nhiệt độ thấp (khoảng từ 22 – 28oC) nên trong thời gian ngâm mẫu với dịch khuẩn, thí nghiệm có kết hợp với lắc chung mẫu và dịch khuẩn ở tốc độ 150 vòng/ phút và đồng nuôi cấy ở nhiệt 28oC. Có thể đó cũng là một nguyên nhân giúp vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào mẫu tốt hơn.
Từ những kết quả trên, nồng độ acetosyringone 100 µM và thời gian ngâm mẫu 30 phút được chúng tôi chọn là nghiệm thức thích hợp nhất cho biểu hiện gen.