Để đánh giá hiệu quả biến nạp vào hạt Jatropha nảy mầm. Hạt sau khi được xâm nhiễm với dịch khuẩn bằng ba cách tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào hạt, đánh siêu âm và lắc hạt với dịch khuẩn được chọn ngẫu nhiên mỗi nghiệm thức 5 hạt đem nhuộm GUS kiểm tra sự hiện diện của gen gusA theo phương pháp của Jefferson và ctv (1987) được cải tiến bởi Jacobsen (2007), số hạt còn lại được trồng ra đất. Sau 3 tuần, cây con đã được phun PPT ở nồng độ 400 mg/l để chọn lọc cây chuyển gen. Để đảm
bảo chọn lọc hiệu quả, sau 7 ngày những cây Jatropha được phun PPT 400 mg/l thêm một lần nữa. Kết quả được ghi nhận như bảng 4.5.
Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha đang nảy mầm Phương
pháp Hạt xâmnhiễm Tỷ lệ biểuhiện GUS (%)
Tỷ lệ cây
sống (%) được chuyển gen (%)Tỷ lệ cây giả định
I 100 60 48 6
SAAT 100 40 26 4
I+S 100 40 22 5
I: phương pháp tiêm vào hạt; SAAT: chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm; I + S: gây vết thương và lắc hạt trong dịch khuẩn.
Kết quả từ bảng 4.5 và hình 4.9 cho thấy, với nghiệm thức tiêm trực tiếp vào hạt, biểu hiện GUS cao (60%), màu xanh chàm đậm và chỉ tập trung chủ yếu thành từng cụm nhỏ tại các vùng lân cận vị trí tiêm. Đối với hai nghiệm thức gây vết thương, lắc với dịch khuẩn và nghiệm thức đánh siêu âm, tỷ lệ biểu hiện GUS khoảng 40%. So với nghiệm thức tiêm vào hạt, ở hai nghiệm thức này màu xanh chàm chạy dọc theo bó mạch, lan ra các vùng xung quanh, ở phần lá cũng có một vài điểm biểu hiện GUS. Sóng siêu âm tạo vô số vết thương nhỏ trên bề mặt hạt, nhưng do vỏ hạt quá dày nên vi khuẩn xâm nhiễm vào phần lá mầm bên trong rất khó, vì vậy ở phần lá chỉ có một vài điểm bên ngoài biểu hiện GUS. Phần thân và trụ mầm do nằm lộ diện bên ngoài nên vi khuẩn dễ dàng xâm nhiễm và đưa T-DNA vào. Màu xanh chàm quan sát được không đậm hơn nhưng chạy kéo dài dọc theo bó mạch, lan ra các vùng mô xung quanh.
Tuy nhiên ở hai nghiệm thức gây vết thương, lắc với dịch khuẩn và đánh siêu âm, tỷ lệ sống sót sau khi đem ra trồng ngoài đất rất thấp, số hạt phát triển thành cây tương ứng là 26% và 22%. Sức sống của hạt ở hai nghiệm thức lắc với dịch khuẩn và đánh siêu âm kém có thể là do thời gian ngâm hạt trong dịch khuẩn lâu, tạo điều kiện cho vi khuẩn bám, xâm nhập và chuyển T-DNA vào tế bào thực vật nhưng bên cạnh đó hạt lại bị tổn thương, giảm sức sống. Mặc dù phần rễ vẫn phát triển tốt nhưng lá mầm bị tổn thương, không thoát ra được lớp vỏ hạt dày, cây bị thối từ trên xuống. Mặt khác, trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn và nấm bệnh phát triển rất mạnh khi đem ra đất trồng, hạt bị nấm và vi khuẩn tấn công làm hạt bị thối. Để tăng sức sống của hạt, trước khi đem ra trồng ngoài đất hạt nên được rửa lại bằng kháng sinh nhằm hạn
B A
C D
chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn và nấm bám trên bề mặt và nên trồng trong điều kiện ẩm độ thấp và nhiều ánh sáng.
Hình 4.9 Biểu hiện GUS khi tiến hành xâm nhiễm vào hạt; A. Đối chứng lá; B. mẫu lá mầm ở NT I + S; C. mẫu phôi ở NT I; D. mẫu phôi ở NT SAAT.
Mặc dù các mẫu khi nhuộm GUS cho tỷ lệ dương tính khá cao nhưng màu GUS rất nhạt, chỉ tập trung thành từng điểm nhỏ cho nên việc chọn lọc được cây với PPT ở nồng độ 300 mg/l thu được kết quả rất hạn chế. Số cây kháng lại PPT thu được sau khi chọn lọc ở cả 3 nghiệm thức là 5%. Nguyên nhân có thể do lượng enzyme phosphinothricin acetyl transferase được tạo ra chưa đủ để làm bất hoạt hoàn toàn PPT. Hoặc có thể xảy ra hiện tượng gen im lặng (gene silencing) nên mặc dù đã chèn được gen kháng vào bộ gen của cây nhưng cây vẫn không biểu hiện được tính kháng. Theo Zhang (2004), gen im lặng là một hiện tượng phổ biến ở cây trồng chuyển gen, nó bao gồm sự im lặng trong quá trình phiên mã (transcriptional gene silencing) và sau phiên mã (post transcriptional gene silencing). Sự im lặng gen trong quá trình phiên mã là do quá trình này bị bất hoạt vì promoter đã bị methyl hóa (promoter methylation). Sự im lặng gen sau phiên mã là do quá trình phân hủy đặc hiệu của RNA (specific degradation of RNA) (Smith và ctv, 2000), do số lượng và vị trí chèn vào của gen chuyển không thuận lợi cho quá trình biểu hiện tính trạng (Baulcome, 1996; Buch và ctv, 2001; Wang và Waterhouse, 2000) (trích dẫn bởi Zhang, 2004).
Theo Efedi và ctv (1999) kết quả khi xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu đậu nành và đậu đỏ nảy mầm, sau khi tiến hành sàng lọc, tỷ lệ cây chuyển gen từ 16 – 24%, so với
kết quả chuyển gen vào callus chỉ 3,5% mẫu được tái sinh thành cây chuyển gen, tỷ lệ này cao hơn rất nhiều.
Theo Wang và ctv (2007), tỷ lệ sống của ngô chuyển gen bằng cách tạo vết thương ở vùng phôi của hạt đang nảy mầm và đem lắc với dịch khuẩn, sau khi được sàng lọc bằng hygromycin, chỉ khoảng 2,1% hạt phát triển thành cây con.
Hình 4.10 Cây Jatropha sau khi được sàng lọc bằng PPT ở nồng độ 400 mg/l. Như vậy, so với phương pháp chuyển gen vào phôi Jatropha, tỷ lệ biểu hiện GUS ở mẫu hạt được tiêm dịch khuẩn thấp hơn, tuy nhiên chuyển gen trực tiếp vào hạt nảy mầm đơn giản hơn. Phương pháp này không phải trải qua bước nuôi cấy mô để tái sinh cây, chỉ cần tiêm dịch khuẩn vào vùng đốt lá mầm và vùng mô lân cận. Điều quan trọng là vi khuẩn xâm nhiễm và cài nhập được T-DNA vô vùng mô chưa phân hóa, chính là vùng chồi đỉnh, đỉnh sinh trưởng của cây, khi tế bào chuyển nạp phân chia sẽ tạo ra được thể chuyển gen.
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ