Mục đích: Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp 148 luc
Cách thực hiện: Quá trình biến nạp được thực hiện theo quy trình như sau (quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi):
Hút 30 μl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã được chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 μl, thêm 3 μl DNA plasmid vào (65 ng/μl), đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Tiếp theo, chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 45 giây, chuyển nhanh eppendorf trên vào đá lạnh, giữ trong 2 phút. Thêm vào eppendorf 800 μl môi trường LB lỏng và ủ ở 370c trong 45 phút. Hút 150 µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh kanamycin với nồng độ 50 μg/ml dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trường. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt sau đó lật ngược đĩa, ủ qua đêm ở 370C. Lặp lại quy trình trên nhưng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm mẫu đối chứng.
Hì nh 3.4 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn.
3.3.2.4. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc và gen bar
trong chủng GV3580 sau khi biến nạp
Sau khi biến nạp, chúng tôi tiến hành kiểm tra plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc và gen bar trong chủng GV3850 để chuẩn bị cho quá trình chuyển gen tiếp theo.
Sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc trong tế bào vi khuẩn được tiến hành bằng cách sàng lọc vi khuẩn trên môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin. Sau đó, kỹ thuật PCR khuẩn lạc được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của gen bar, kết quả phản ứng PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
Thực hiện phản ứng PCR: Primer do Jacobsen (2007) thiết kế với trình tự sau đây đã được sử dụng để khuếch đại vùng mã hóa gen bar trong plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc:
F: 5’ - CCT GTA GAA ACC CCA ACC CG - 3’ R: 5’ - TGG CTG TGA CGC ACA GTT CA - 3’
Bảng 3.1 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR
Hoá chất Dung dịch stock Thể tích sử dụng Nồng độ cuối
PCR buffer 10 X 2,5 µl 1 X DNA 50 ng/µl 1 µl 50 ng dNTPs 10 mM 1 µl 0,4 mM Primer (F) Primer (R) 5 µM5 µM 1 µl1 µl 5 µM5 µM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 µl 1 U MgCl2 50 mM 0,75 µl 1,5 mM H2O cất 17,55 µl Tổng thể tích cho 1 phản ứng PCR là 25 µl
Bảng 3.2 Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR
Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) Chu kỳ
1 94 60 1 2 9462 72 45 45 45 34 3 72 300 1 Điện di:
- Chuẩn bị gel agarose nồng độ 1%: Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml dung dịch TBE 0,5 X. Đun sôi dung dịch agarose trong lò viba ở bước sóng 650 W cho đến khi tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch agarose đến nhiệt độ khoảng 550C và rót nhẹ nhàng vào khay điện di.
- Load mẫu: 5 µl sản phẩm DNA và 1 µl loading dye 6 X.
- Nhuộm mẫu: Sau khi chạy điện di xong thì ngâm gel trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút. Sau khi ngâm xong, vớt gel ra và rửa bằng nước trong 1 phút và đem chụp ảnh dưới tia UV. Dựa vào băng hình xuất hiện DNA và đánh giá sự xuất hiện của gen chuyển nạp.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của PPT đến sự sinh trưởng của cây Jatrophain vivo
Khả năng kháng thuốc diệt cỏ đã được De Greef và ctv (năm 1989) khảo sát trên một vài loại cây trồng. Ngô được chuyển gen kháng côn trùng (Armstrong và ctv, 1995; Koziel và ctv, 1993) đã sử dụng gen bar kháng PPT làm tác nhân chọn lọc sau khi chuyển gen.
Mục đích: Nhằm xác định ngưỡng gây chết của PPT đối với cây Jatrophain vivo
để phục vụ cho công tác chọn lọc về sau.
Cách thực hiện: Hạt Jatropha được trồng ra đất, chia thành 5 lô, mỗi lô 30 hạt, khi cây đạt 3 tuần tuồi tiến hành phun PPT ở các lô với các nồng độ 0; 100; 200, 300 và 400 mg/l.
Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận sự đổi màu của lá, tỷ lệ chết của cây sau khi phun PPT ở các nghiệm thức.
3.3.4. Lây nhiễm mẫu Jatropha với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc
3.3.4.1. Chuẩn bị dịch vi khuẩn
Chọn 1 khuẩn lạc đơn nuôi cấy trong ống falcon 15 ml chứa 5 ml môi trường LB có bổ sung 50 mg/l kanamycin sulphate. Đặt ống falcon chứa môi trường LB vào trong tủ lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 12 - 16 h ở nhiệt độ 280C. Đo trị số OD, OD600 nm = 0,5 - 0,6 thì tiến hành ly tâm để thu sinh khối (môi trường nuôi vi khuẩn được ly tâm với vận tốc 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, loại bỏ phần dịch nổi bên trên), pha loãng sinh khối bằng môi trường MS lỏng (pH 7,2). Dịch khuẩn sau đó được sử dụng cho hai thí nghiệm chuyển gen vào phôi và vào hạt nảy mầm.
3.3.4.2. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào phôi Jatropha curcas L. bằng A. tumefaciens
Theo Sunjung Park (2006) trong quá trình xâm nhiễm mẫu với vi khuẩn, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển nạp gen. Một số yếu tố ảnh hưởng nhiều đến
hiệu quả chuyển gen như là thời gian ngâm mẫu, thời gian đồng nuôi cấy, nồng độ acetosyringone, loại mẫu cấy, xử lý tiền nuôi cấy mẫu. Do đó, thí nghiệm này được tiến hành nhằm khảo sát một số yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến quá trình chuyển nạp, từ đó có thể tìm ra một quy trình chuyển nạp gen cho hiệu quả tối ưu, nâng cao hiệu suất chuyển gen, và số lượng mẫu chuyển gen được tái sinh.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens.
Mục đích: Khảo sát hiệu quả chuyển nạp gen và sức sống trên hai loại mẫu phôi tiền nuôi cấy (2 ngày) và phôi không tiền nuôi cấy khi được tiến hành xâm nhiễm với vi khuẩn A. tumefaciens.
Cách thực hiện: Hạt Jatropha được khử theo quy trình của Mã Yến Thanh (2011), tách vỏ và thu nhận phôi. Nguồn mẫu để đồng nuôi cấy gồm:
- Mẫu phôi không tiền nuôi cấy
- Mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày trên môi trường MS
Hai loại mẫu trên được nuôi cấy ở với dịch vi khuẩn có giá trị OD600 nm là 0,5 – 0,6, bổ sung acetosyringone đạt nồng độ cuối là 100 µM, thời gian ngâm mẫu là 30 phút. Mẫu được đồng nuôi cấy 2 ngày, sau đó tiến hành nhuộm GUS, chọn ra nghiệm thức tốt nhất khảo sát hai yếu tố là thời gian ngâm mẫu, nồng độ Acetosyringone. Mẫu đối chứng được thay dịch khuẩn bằng nước cất.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 đĩa, mỗi đĩa 30 mẫu. Chọn ngẫu nhiên 8 mẫu đem tiến hành nhuộm GUS, kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA.
Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn trên và xung quanh mẫu cấy, sức sống của mẫu, tính phần trăm mẫu thử GUS có tín hiệu dương tính.
Kiểm tra sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA: Theo Jacobsen và ctv (2007), việc nhuộm GUS trên mẫu cấy nên được thực hiện vào ngày thứ 2 và thứ 4 sau khi nuôi chung với vi khuẩn. Thành phần dịch đệm Phosphate Buffer được cải tiến gồm có 0,1M Na2HPO4, 0,1M NaH2PO4, 10mM EDTA, 0,5 mM K4[Fe(CN)6], 0,5 mM K3[Fe(CN)6], 2% formaldehyde, 0,1% Triton-X100, pH 7. X-gluc được pha trong DMSO, trữ trong tối ở 40C, được bổ sung vào dung dịch đệm Phosphate Buffer để đạt nồng độ 1 mg/ml X-gluc trước khi thí nghiệm. Sau khi đã bổ sung X-gluc, lúc này Phosphate Buffer sẽ được gọi là Equilibration buffer. Các bước của quy trình nhuộm GUS sẽ được trình bày trong sơ đồ như hình 3.5 dưới đây.
∑ mẫu biểu hiện GUS
∑ mẫu quan sát x 100
Hình 3.5 Sơ đồ các bước của quy trình nhuộm GUS.
Mẫu sau khi nhuộm GUS sẽ được quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 4X, mẫu có màu xanh chàm chính là mẫu được biểu hiện GUS
Chỉ tiêu theo dõi:
Phần trăm số mẫu biểu hiện GUS =
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và nồng độ acetosyringone đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens.
Mục đích: Xác định nồng độ acetosyringone và thời gian ngâm mẫu tối ưu để gia tăng hiệu quả chuyển gen.
Cách thực hiện: Sau khi chọn được nguồn mẫu cho hiệu quả biến nạp cao nhất từ thí nghiệm 1, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone và thời gian ngâm mẫu lên hiệu quả chuyển gen ở ba mức nồng độ acetosyringone là 0 µM, 100 µM, 200 µM, kết hợp với thời gian ngâm mẫu 15 phút, 30 phút và 45 phút.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện 3 lần, mỗi lần 3 đĩa, một đĩa 30 mẫu. Mỗi nghiệm thức được chọn ngẫu nhiên 8 mẫu đem tiến hành nhuộm GUS (sơ đồ 3.3) để kiểm tra sự biểu hiện của gen gusA.
Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận số lượng mẫu chết, và phần trăm mẫu biểu hiện GUS ở từng nghiệm thức sau khi đồng nuôi cấy 2 ngày.
3.3.4.3. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm
Phương pháp xâm nhiễm Agrobacterium vào hạt nảy mầm đã được thực hiện từ rất sớm trên một số đối tượng như ngô, đậu nành, Arabidopsis thaliana. Năm 1989, Chee và ctv đã tiến hành xâm nhiễm hạt đậu nành đang nảy mầm với vi khuẩn A. tumefaciens bằng cách tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào vùng chồi đỉnh, vùng đốt lá mầm và các vùng lân cận. Efedi và ctv (1999) xâm nhiễm vi khuẩn vào mẫu đậu nành và đậu đỏ bằng ba cách: tiêm vào hạt đang nảy mầm, tạo vết thương kết hợp với đánh siêu âm và phương pháp hút chân không. Vì vậy, thí nghiệm này đã được tiến hành bắng cách bóc vỏ cứng của hạt Jatropha, đem đi ngâm nước 2 giờ, sau đó ủ trên giấy thấm rồi đặt trong tối ở nhiệt độ phòng 48h. Hạt sau khi hạt nảy mầm được tiến hành xâm nhiễm với vi khuẩn theo ba cách như sau:
Tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào hạt: Tiêm khoảng 100 µl dịch khuẩn có bổ sung acetocyringone đạt nồng độ cuối 100 µM vào vùng chồi đỉnh của hạt. Hạt sau khi tiêm được ủ trên giấy thấm 24 giờ, sau đó đem ra đất trồng.
Lắc hạt với dịch khuẩn: Hạt sau khi được tạo vết thương bằng mũi dao đem ủ chung với dịch khuẩn trong bình tam giác có bổ sung acetocyringone đạt nồng độ cuối 100 µM, lắc ở 150 vòng/phút. Sau 6 giờ chuyển hạt lên đĩa petri có giấy thấm, tiếp tục ủ hạt 18 giờ, sau đó chuyển hạt ra đất trồng.
Chuyển gen kết hợp đánh sóng siêu âm: Hạt được ủ chung với dịch khuẩn có bổ sung acetosyringone đạt nồng độ cuối 100 µM, đem đánh siêu âm 2 phút, lắc 6 giờ ở 150 vòng/ phút. Sau đó chuyển hạt lên đĩa petri có giấy lọc. Khi ủ được 18 giờ, hạt được chuyển ra trồng trên đất.
Mỗi phương pháp được thực hiện 100 hạt. Chọn ngẫu nhiên 5 hạt trên một phương pháp đem tiến hành nhuộm GUS. Hạt được ủ trên đĩa petri có giấy thấm, sau 2 ngày, tách bỏ phần vỏ hạt lấy phần phôi và lá non bên trong tiến hành nhuộm GUS.
Cây con sau 3 tuần tuổi được sàng lọc bằng cách tiến hành phun PPT ở nồng độ nồng độ thấp nhất gây chết cây không chuyển gen đã được khảo sát.
Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận tỉ lệ sống của hạt sau khi trồng ra đất, tỉ lệ biểu hiện GUS ở phôi và số cây sống sót sau khi được chọn lọc bằng PPT mỗi nghiệm thức.
3.3.5. Xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được phân tích bằng Microsoft Office Excel và phần mềm MSTATC, Đại học Michigan, Hoa Kỳ.
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của ba loại kháng sinh cefotaxim,meropenem và cyprofloxacin meropenem và cyprofloxacin
Sau khi ủ mẫu với A. tumefaciens, vi khuẩn cần được loại bỏ khỏi mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng trong quá trình chuyển gen. Nếu diệt không hết khuẩn sẽ ảnh hưởng đến quá trình tái sinh cây. Do đó cần xác định chủng loại và liều lượng kháng sinh diệt khuẩn hiệu quả mà không ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh cây chuyển gen.
Các mẫu phôi Jatropha sau khi ủ với vi khuẩn và giữ trong môi trường đồng nuôi cấy ở 28oC trong điều kiện tối được lấy ra rửa 3 lần với nước cất tiệt trùng. Sau đó, mẫu được tiến hành rửa lại ba lần với các loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và cyprofloxacin ở các nồng độ khác nhau. Sau khi rửa kháng sinh, mẫu được rửa lại bằng nước cất 2 lần, tiếp tục đặt mẫu trên giấy thấm đến khi khô ráo và cấy vào môi trường chọn lọc MS + 1 mg/l PPT. Nồng độ các loại kháng sinh được bổ sung vào môi trường sẽ tương ứng với nồng độ kháng sinh sử dụng khi rửa mẫu.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại kháng sinh, nồng độ sử dụng và thời gian rửa mẫu ở bảng 4.1 cho thấy kháng sinh cefotaxim, meropenem và ciprofroxacin không có khả năng diệt một cách hiệu quả vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101pIB-GUS được sử dụng trong thí nghiệm. Cefotaxim là kháng sinh được sử dụng phổ biến để diệt khuẩn Agrobacterium sau khi chuyển gen. Ở một số báo cáo chuyển gen vào mẫu Jatropha, nồng độ kháng sinh được khuyến cáo sử dụng ở các nồng độ từ 300 - 500 mg/l để diệt vi khuẩn này (Li và ctv, 2007; 2006; He và ctv, 2008; Jingli Pan và ctv, 2010). Nồng độ 1000 mg/l rất ít khi được sử dụng (Trivedi và ctv, 2008). Tuy nhiên trong thí nghiệm của chúng tôi, cefotaxim lại không có khả năng diệt được vi khuẩn này một cách hiệu quả ngay cả khi nồng độ được nâng lên tới 1000 mg/l. Sau khi rửa mẫu ở nồng độ từ 100 - 300 mg/l, vi khuẩn đã xuất hiện trở lại trên bề mặt môi trường chỉ sau 1 - 2 ngày. Ở nồng độ cao hơn từ 500 - 1000 mg/l, thời gian tái xuất hiện của vi khuẩn có dài hơn là 3 - 5 ngày nhưng toàn bộ số mẫu vẫn bị nhiễm. Trong môi trường giàu dinh dưỡng, tốc độ phát triển của vi khuẩn diễn ra rất nhanh. Chỉ sau 7 ngày, dịch vi khuẩn đã lan ra khắp bề mặt mẫu và lan rộng ra môi trường thạch xung quanh. Tuy nhiên, điều cần lưu ý là khi bổ sung cefotaxim vào môi
trường ở nồng độ 700 mg/l trở lên, chỉ sau 5 ngày mẫu phôi bắt đầu hóa nâu và chết. Điều này cho thấy không thể sử dụng kháng sinh ở nồng độ cao để diệt khuẩn.
Meropenem là kháng sinh thế hệ mới, kết quả từ một số báo cáo cho thấy, trong khi các kháng sinh thế hệ cũ như cefotaxim, carbenilin, v.v, vẫn thường được sử dụng với nồng độ cao từ 300 – 500 mg/l thì meropenem có thể diệt khuẩn hiệu quả ở nồng độ từ 5 – 50 mg/l, đặc biệt là đối với các vi khuẩn Gram âm như Agrobacterium. Loại kháng sinh mới này còn có ưu điểm là ít ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mẫu (Ogawa và Mii, 2005; 2007). Tuy nhiên, kết quả từ thí nghiệm này lại cho thấy meropenem không thể diệt được vi khuẩn Agrobacterium EHA101pIB-GUS. Ở nồng độ 50 mg/l vi khuẩn đã xuất hiện sau khi rửa 1 ngày. Ở nồng độ 500 mg/l thì 5 ngày sau khi rửa vi khuẩn phát triển trở lại và ở nồng độ 1000 mg/l thời gian này là 7 ngày. Tuy nhiên so với môi trường có bổ sung kháng sinh cefotaxim thì tốc độ lan rộng của dịch vi khuẩn trong môi trường có meropenem chậm hơn. Thời gian từ lúc xuất hiện những vết màu trắng đục đầu tiên ở vị trí mẫu cấy đến khi vi khuẩn lan khắp mặt thạch là khoảng 10 ngày. Điều này chứng tỏ meropenem có hiệu quả hơn cefotaxim