Acetosyringone là một phức chất phenol được sản sinh cùng với đường khi các tế bào cây bị tổn thương. Acetosyringone giữ vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm vào ở nồng độ cao (10-5 đến 10-4 phân tử gam), nó làm hoạt hóa gen vir trên Ti plasmid .
Trong tự nhiên, những tế bào A. tumefaciens di động bị hút đến các vết thương nhờ sự sản sinh acetosyringone. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Ti plasmid đáp ứng mạnh hơn các chủng vi khuẩn thông thường vì chúng có thể nhận diện acetosyringone ở nồng độ rất thấp (10-7 phân tử gam).
Các chất tiết ra từ vết thương được thu nhận bởi một thụ quan đặc biệt gắn tren màng tế bào vi khuẩn, giúp vi khuẩn nhận diện vết thương đồng thời kích hoạt một kinase là gen vir biểu hiện (Dion và ctv, 1995).
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng lên sự vận chuyển và sát nhập T-DNA vào bộ gen thực vật, một số yếu tố cần quan tâm như: kiểu gen của cây, loại mô, dòng vi khuẩn, hóa chất cảm ứng gen vir, thành phần môi trường nuôi cấy, trình trạng hư hại của mô, sự loại bỏ A. tumefaciens sau khi đồng nuôi cấy, v.v.. Để thiết kế các quy trình tối ưu và gia tăng hiệu quả biến nạp, cần đi sâu tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến biến nạp.
2.4.6.1. Vật liệu chuyển gen
Việc chọn kiểu mô để làm vật liệu chuyển gen rất quan trọng. Phải chọn loại mô có khả năng tái sinh mạnh để khi thu được một tế bào chuyển gen thì tế bào này có khả năng phân chia nhanh chóng và tạo ra một khối tế bào chuyển gen.
Để tăng hiệu quả chuyển nạp gen và thuận tiện trong bước tái sinh sau này, mẫu trước khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium có thể được xử lý bằng nhiều cách:
Xử lý thẩm thấu: Việc bổ sung vào môi trường đồng nuôi cấy 200 mM sucrose và 200 mM glucose đã được sử dụng rộng rãi trong quy trình chuyển gen vào cây lúa và bắp (Hiei và ctv, 1994; Zhao và ctv, 2001; Frame và ctv, 2002) (trích dẫn bởi Sunjung Park, 2006).
Xử lý tiền nuôi cấy: Trước khi ủ chung với vi khuẩn A. tumefaciens người ta nuôi cấy mô mục tiêu trên môi trường cảm ứng mô sẹo, chồi một thời gian. Phương pháp này được chứng minh có hiệu quả rất cao trên cây Arabidopsis thaliana (Sanwan và ctv, 1991) và Saintpaulia ionantha (Satoshi và ctv, 2001).
Làm khô mẫu: Trình trạng khô của mẫu trước hoặc ngay khi xâm nhiễm vi khuẩn là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng biến nạp. Không rõ nhân tố nào bị tác động bởi việc làm khô mẫu, có thể đó là sự co nguyên sinh chất và tình trạng tổn thương mẫu giống như xử lý thẩm thấu. Mặc dù cơ chế của sự phơi mẫu đến nay chưa rõ, nhưng người ta chứng minh rằng nó có khả năng loại bỏ vi khuẩn tương đương với xử lý AgNO3.
Mức độ gây tổn thương của tế bào chủ: Agrobacterium xâm nhiễm vào tế bào thực vật thông qua một cơ chế chuyển gen gây ra khối u ở thực vật. Gen vir (gen gây độc) được hoạt hóa trong vi khuẩn nhờ chất chuyển hóa của thực vật phóng thích từ các điểm bị thương. Khi mô bị tổn thương, vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập và chuyển
DNA vào tế bào thực vật hơn. Nhưng nếu mô bị tổn thương quá nặng thì sau khi chuyển gen khả năng tái sinh của mô rất thấp.
2.4.6.2. Dòng vi khuẩn Agrobacterium
Có nhiều dòng Agrobacterium được ứng dụng trong chuyển gen, các dòng A. tumefaciens khác nhau sẽ chứa những Ti plasmid tạo ra các loại opine khác nhau. Mỗi chủng sẽ có hiệu quả cao và thường được dùng cho một số đối tượng thực vật khác nhau. Trong đó chỉ có một vài dòng là có thể chuyển gen thành công vào thực vật một lá mầm, ví dụ như chủng AGL1. Chủng GV2260 thích hợp cho cây đậu nành, đậu lăng, ngoài ra còn có một số chủng phổ biến như chủng EHA105, chủng LBA4404, MP90 và AGL1(Kevan và ctv, 1995).
Gen virG và virA đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện vùng gen
vir nên các nhà khoa học đã nghiên cứu cải biên một số dòng Agrobacterium có khả năng chuyển gen mạnh hơn bằng cách gây đột biến điểm định hướng trên vùng gen
vir để thu được dòng vi khuẩn có vùng vir được biểu hiện mạnh nhất. Khi dùng dòng
Agrobacterium đột biến này để chuyển gen, không cần phải bổ sung các tác nhân cảm ứng vùng gen vir.
2.4.6.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hệ thống điều hòa hai thành phần virA và virG – phức hợp điều khiển sự vận chuyển T-DNA. Gen vir được cảm ứng tối đa ở nhiệt độ từ 25oC đến 27oC (Turk và ctv., 1991) (trích dẫn bởi Sunjung Park, 2006). Ở nhiệt độ lớn hơn 32oC, gen vir sẽ không biểu hiện vì gen virA bị đột biến thành dạng mất hoạt tính. Dòng Agrobacterium ổn định nhất ở nhiệt độ thấp hơn (18oC – 20oC) (Lai và ctv, 2000). Ủ chung vi khuẩn với tế bào thực vật ở nhiệt độ thấp hơn trong vài ngày đầu tiên của tiến trình chuyển nạp sẽ cho hiệu quả chuyển nạp cao hơn.
2.4.6.4. Chất hoạt động bề mặt
Chất hoạt động bề mặt có tác dụng thúc đẩy sự vận chuyển T-DNA bằng cách trợ giúp A. tumefaciens bám vào mô thực vật và giúp loại bỏ các cơ chất cản trở quá trình bám đó. Một số chất hoạt động bề mặt như Silwet 77 và acid pluronic F68 được bổ sung vào môi trường ủ làm gia tăng sự chuyển DNA vào tế bào thực vật (Whalen và ctv, 1991) (trích dẫn bởi Sunjung Park, 2006).
Sau khi ủ mẫu với A. tumefaciens, vi khuẩn cần được loại bỏ khỏi mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng trong quá trình chuyển gen. Nếu tiêu diệt không hết vi khuẩn sẽ ảnh hưởng đến môi trường, ngoài ra sự hiện diện của vi khuẩn còn sót lại thường ảnh hưởng đến quá trình tái sinh cây chuyển gen. Trong các nghiên cứu chuyển nạp gen, có nhiều loại kháng sinh được sử dụng để diệt khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên kháng sinh thường gây độc tế bào thực vật làm ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh cây chuyển gen. Do đó cần chọn lọc các loại kháng sinh đủ mạnh để giết chết vi khuẩn và ít gây độc với tế bào thực vật nhất.
Hiện nay một số loại kháng sinh hiệu quả được dùng để loại bỏ vi khuẩn sau khi ủ mẫu với A. tumefaciens là cefotaxim, carbernicilin và timentin có tác động ức chế sinh tổng hợp lớp peptidoglycan vách tế bào prokaryote và giết chết vi khuẩn. Tuy nhiên, để diệt khuẩn hiệu quả, các loại kháng sinh trên phải được sử dụng ở nồng độ cao (200 – 500 mg/l) vì vậy chúng thường gây độc với tế bào thực vật làm ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây sau chuyển gen (Hammerschlag và Zimmerman, 1995). Việc phát hiện các loại kháng sinh mới diệt khuẩn hiệu quả, tăng cường hiệu quả biến nạp đang được quan tâm nghiên cứu (Mayzolo và ctv, 2003; Ogawa và mii, 2007). Moxalactam, một loại kháng sinh thuộc họ β–lactam cho thấy hiệu quả cao trong quá trình diệt khuẩn và tăng cường tạo phôi trong nghiên cứu chuyển gen trên cây cacao khi so sánh với cefotaxim (Mayzolo và ctv, 2003). Nghiên cứu sàng lọc 12 kháng sinh thuộc họ β-lactam diệt vi khuẩn A. tumefacines chủng LBA4404 và EHA101 cho thấy rằng chỉ có cefotaxim, ceibuperazon và meropenem có tác động tốt trong sự loại bỏ vi khuẩn. Trong đó, meropenem có hoạt tính cao nhất đối với vi khuẩn. Nghiên cứu tính độc của 12 loại kháng sinh trên đối với tế bào được tiến hành trên cây thuốc lá cho thấy 2 loại kháng sinh β-lactam là meropenem và moxalactam diệt khuẩn hiệu quả và không ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh cây chuyển gen (Ogawa và mii, 2005).
2.4.6.6. Thời gian đồng nuôi cấy và mật độ vi khuẩn
Mỗi loại mẫu, loại cây sẽ thích hợp với một thời gian đồng nuôi cấy khác nhau. Một số mẫu yếu, khó tái sinh nếu thời gian đồng nuôi cấy quá dài sẽ gây khó khăn trong bước diệt khuẩn và tái sinh.
Mật độ vi khuẩn thích hợp thường dùng chuyển gen là từ 1 x 106 - 1 x 1010 cfu/l. Mật số vi khuẩn cao có thể làm gia tăng hiệu quả biến nạp tạm thời, cho hiệu quả biểu hiện GUS cao (Hiei và ctv, 1997) tuy nhiên không tương quan đến hiệu suất biến nạp.
Nồng độ vi khuẩn cao hơn nồng độ tối ưu thường gây hư hại tế bào thực vật, do đó làm giảm khả năng tái sinh của mô. Nhưng đối với các loại cây khó chuyển gen, nồng độ vi khuẩn cao là cần thiết, sau khi ủ xong, người ta rửa nhẹ lại với môi trường vô trùng hoặc có bổ sung vào môi trường các tác nhân sát khuẩn.
2.3.6.7. Các yếu tố ảnh hưởng khác
Ngoài các yếu tố kể trên thì còn nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến hiệu chuyển nạp gen như các loại môi trường nuôi cấy, genotype, thời gian và điều kiện chiếu sáng trong giai đoạn ủ, các chất gây cảm ứng gen vir khác như: acid galacturonic, acid glucuronic, acid arabonic, các chất dẫn dụ (đường, amino acid), các chất kết dính của thực vật (pectin, vitronectin, germin). Thêm các chất như AgNO3 hay CaCl2 vào môi trường ủ và đồng nuôi cấy cũng làm tăng hiệu quả biến nạp. Tất cả các yếu tố nầy cần được tối ưu hóa nhằm thu được hiệu quả chuyển gen cao nhất.
2.5. Các phương pháp kiểm tra cây chuyển gen2.5.1. Phương pháp thử GUS 2.5.1. Phương pháp thử GUS
Đây là phương pháp dùng để kiểm tra gen chỉ thị gusA. Năm 1987, thử nghiệm GUS đã được đưa ra bởi Jefferson. Thử nghiệm rất nhạy, vừa có khả năng định lượng vừa có khả năng định tính. Trong tự nhiên, β-glucuronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật. Mặt khác, sản phẩm màu của gusA rất bền và phản ứng rất ít bị ảnh hưởng của pH nên rất thuận lợi cho việc theo dõi. Có thể thử GUS ngay trên mô thực vật hay tế bào bằng các thao tác hiển vi: cắt mô, nhuộm với X-Gluc và theo dõi màu. Cũng có thể thu các số liệu định lượng bằng cách so màu trên quang phổ huỳnh quang.
Chất thường dùng để định tính β-glucuronidase trong mô và tế bào là 5-brom-4- chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc). Chất này hoạt động tốt, cho màu xanh chàm tại nơi có eyzyme hoạt động (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Hình 2.6 Phản ứng tạo màu của X-gluc dưới tác dụng của enzyme β – glucuronidase. 2.5.2. Phương pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ (PPT) của cây tái sinh
Phân tích tính kháng thuốc là chọn dòng tế bào, mô và cây mang tính kháng thuốc thông qua hoạt động của gen chuyển, có thể là thuốc kháng sinh như kanamycin khi dùng gen nptII hoặc hygromycin khi dùng gen hpt hoặc thuốc diệt cỏ basta khi dùng gen bar. Bước phân tích này có thể áp dụng cho mọi giai đoạn sau khi biến nạp từ trạng thái tế bào đến mô sẹo, chồi tái sinh, cây hoàn chỉnh hay cây non gieo từ hạt (Lê Trần Bình, 2008) .
Các cây nhận được từ thí nghiệm chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường có kháng sinh hay PPT với nồng độ tùy thuộc vào loại thực vật khác nhau để theo dõi khả năng sinh trưởng của cây. Trong điều kiện nuôi cấy như trên, cây được chuyển gen sẽ sinh trưởng bình thường trong khi cây không chuyển gen sẽ chết.
2.5.3. Sử dụng PCR để đánh giá kết quả chuyển gen ở thực vật
PCR là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để kiểm tra đánh giá kết quả chuyển gen ở mức độ phân tử. Trước tiên, phải tách chiết DNA thực vật với phương pháp thích hợp. Do PCR rất nhạy nên lượng mẫu dùng để tách chiết DNA cũng rất nhỏ (5 – 10 mg) lượng DNA được tách chiết tương ứng từ 1 ng đến 1 µg.
PCR khuếch đại số lượng lớn đặt trưng cho gen chuyển vào tế bào. Vì vậy, luôn cần có hai đoạn mồi 5’ và 3’ đặt trưng cho mỗi DNA hay gen ngoại lai. Các đoạn mồi này có tên chung là mồi đặc trưng (specific primers) thường có kích thước từ 20 – 30 bp và là các nucleotide tổng hợp.
Phản ứng PCR ở thực vật thường tiến hành qua 40 – 45 chu kỳ, sau koảng 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ đạt 106 so với mẫu ban đầu (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003).
Nếu trong thực vật xuất hiện gen mới do kỹ thuật chuyển gen, sau khi chạy PCR với mồi đặc trưng, có thể phát hiện gen đó trên bản điện di.
2.5.4. Phương pháp Southern blot xác định gen ngoại lai trong bộ gen của cây
Southern (1975) là người đầu tiên đã mô tả quá trình chuyển DNA từ màng agarose gel đến màng nitrocellulose, cho nên được gọi là “Southern blot”. Theo phương pháp này, được gọi là “lai có hỗn hợp pha với nhau”. Một nucleic acid gắn vào màng, nucleic acid khác là thể probe được đánh dấu. Phương pháp Sourther blot trở thành phương pháp rất quan trọng, có nhiều ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu như là nghiên cứu cấu trúc gen, tổ chức genome, kiểm soát sự biểu hiện gen, Chuẩn đoán bệnh di truyền, phát hiện các pathogen thuộc về virus, vi khuẩn, nấm, v.v..
Phương pháp Southern blot chứng minh được sự hợp nhất của gen ngoại lai vào bộ genome cây đang nghiên cứu, bằng cách lai với phân tử DNA, phân tử cao không bị phân cắt, sử dụng các plasmid đóng vai trò như thể thăm dò (probe). Sau khi phân cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn tại các vị trí mục tiêu của plasmid DNA. Các sản phẩm lai được quan sát từ việc phân cắt DNA của genome, không có gen lạ chuyển nạp, tạo ra thể đa hình (polymorphism) như một chức năng của những vị trí hợp nhất vào genome. Sự có mặt của những bản sao nguyên vẹn các gen có thể được chứng minh nhờ kỹ thuật phân cắt DNA bằng enzyme tương ứng, làm cho cấu trúc gen chuyển nạp thể hiện rõ, tiếp theo đó là kỹ thuật probing với một phần của chuỗi mà này (gen chuyển nạp). Nếu một copy nguyên vẹn của gen ngoại lai có mặt, nó sẽ tạo ra sản phẩm lai (với probe) có cùng kích thước như plasmid DNA bị cắt bởi enzyme (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Sự phát hiện chuỗi DNA có tính chất tương đồng với probe, nhờ phương pháp Southern blot là một đóng góp to lớn trong sinh học phân tử, đặc biệt là trong kỹ thuật “recombinant DNA”, và phân tích sự thể hiện gen được chuyển nạp.
2.6. Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam
Nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen là công nghệ mới ở Việt Nam do kỹ thuật phức tạp. Năm 2008, chính phủ ban hành Nghị định về sử dụng sinh vật biến đổi gen đã thúc đẩy công tác nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen ở nước ta. Nhiều đề tài, dự án nghiên cứu sinh vật biến đổi gen, trong đó có cây trồng chuyển gen được đầu tư về kinh phí, thiết bị, kỹ thuật hiện đại. Chính vì thế những công trình nghiên cứu về chuyển gen ngày càng được phát triển và đã đem lại một số thành tựu nhất định.
Các nghiên cứu tạo các sinh vật biến đổi gen, bước quan trọng đầu tiên được thực hiện nhiều ở Việt Nam là phân lập, tuyển chọn các gen quý có giá trị ứng dụng cao tiến tới sử dụng để chuyển vào sinh vật nhận nhằm tạo nên những giống lý tưởng. Một số gen có giá trị nông nghiệp đã được tuyển chọn bao gồm gen chịu hạn, lạnh, kháng bệnh ở lúa; gen cry và vip mã hóa các protein độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gen mã hóa protein bất hoạt hóa ribosome ở cây mướp đắng và gen mã hóa α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn trùng, gen mã hóa protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ, gen mã hóa kháng nguyên vỏ của các chủng virus dại, v.v.. Song song với những nghiên cứu trên, hướng nghiên cứu thiết kế các vector mang gen có giá trị chủ yếu để biểu hiện trong vi khuẩn và trong thực vật được thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm trên cả nước.
Theo Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (2004), bộ môn Công nghệ Sinh học đã chuyển nạp thành công nhiều dòng lúa biến đổi gen giàu vitamin A, sắt và protein. Các tác giả đã sử dụng một vector mang bảy gen khác nhau gồm hai gen crtI và psy
điều khiển tính trạng tổng hợp beta carotene, ba gen irtI, nas và pfe mang tính trạng