meropenem và cyprofloxacin
Sau khi ủ mẫu với A. tumefaciens, vi khuẩn cần được loại bỏ khỏi mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng trong quá trình chuyển gen. Nếu diệt không hết khuẩn sẽ ảnh hưởng đến quá trình tái sinh cây. Do đó cần xác định chủng loại và liều lượng kháng sinh diệt khuẩn hiệu quả mà không ảnh hưởng đến hiệu suất tái sinh cây chuyển gen.
Các mẫu phôi Jatropha sau khi ủ với vi khuẩn và giữ trong môi trường đồng nuôi cấy ở 28oC trong điều kiện tối được lấy ra rửa 3 lần với nước cất tiệt trùng. Sau đó, mẫu được tiến hành rửa lại ba lần với các loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và cyprofloxacin ở các nồng độ khác nhau. Sau khi rửa kháng sinh, mẫu được rửa lại bằng nước cất 2 lần, tiếp tục đặt mẫu trên giấy thấm đến khi khô ráo và cấy vào môi trường chọn lọc MS + 1 mg/l PPT. Nồng độ các loại kháng sinh được bổ sung vào môi trường sẽ tương ứng với nồng độ kháng sinh sử dụng khi rửa mẫu.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của loại kháng sinh, nồng độ sử dụng và thời gian rửa mẫu ở bảng 4.1 cho thấy kháng sinh cefotaxim, meropenem và ciprofroxacin không có khả năng diệt một cách hiệu quả vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101pIB-GUS được sử dụng trong thí nghiệm. Cefotaxim là kháng sinh được sử dụng phổ biến để diệt khuẩn Agrobacterium sau khi chuyển gen. Ở một số báo cáo chuyển gen vào mẫu Jatropha, nồng độ kháng sinh được khuyến cáo sử dụng ở các nồng độ từ 300 - 500 mg/l để diệt vi khuẩn này (Li và ctv, 2007; 2006; He và ctv, 2008; Jingli Pan và ctv, 2010). Nồng độ 1000 mg/l rất ít khi được sử dụng (Trivedi và ctv, 2008). Tuy nhiên trong thí nghiệm của chúng tôi, cefotaxim lại không có khả năng diệt được vi khuẩn này một cách hiệu quả ngay cả khi nồng độ được nâng lên tới 1000 mg/l. Sau khi rửa mẫu ở nồng độ từ 100 - 300 mg/l, vi khuẩn đã xuất hiện trở lại trên bề mặt môi trường chỉ sau 1 - 2 ngày. Ở nồng độ cao hơn từ 500 - 1000 mg/l, thời gian tái xuất hiện của vi khuẩn có dài hơn là 3 - 5 ngày nhưng toàn bộ số mẫu vẫn bị nhiễm. Trong môi trường giàu dinh dưỡng, tốc độ phát triển của vi khuẩn diễn ra rất nhanh. Chỉ sau 7 ngày, dịch vi khuẩn đã lan ra khắp bề mặt mẫu và lan rộng ra môi trường thạch xung quanh. Tuy nhiên, điều cần lưu ý là khi bổ sung cefotaxim vào môi
trường ở nồng độ 700 mg/l trở lên, chỉ sau 5 ngày mẫu phôi bắt đầu hóa nâu và chết. Điều này cho thấy không thể sử dụng kháng sinh ở nồng độ cao để diệt khuẩn.
Meropenem là kháng sinh thế hệ mới, kết quả từ một số báo cáo cho thấy, trong khi các kháng sinh thế hệ cũ như cefotaxim, carbenilin, v.v, vẫn thường được sử dụng với nồng độ cao từ 300 – 500 mg/l thì meropenem có thể diệt khuẩn hiệu quả ở nồng độ từ 5 – 50 mg/l, đặc biệt là đối với các vi khuẩn Gram âm như Agrobacterium. Loại kháng sinh mới này còn có ưu điểm là ít ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mẫu (Ogawa và Mii, 2005; 2007). Tuy nhiên, kết quả từ thí nghiệm này lại cho thấy meropenem không thể diệt được vi khuẩn Agrobacterium EHA101pIB-GUS. Ở nồng độ 50 mg/l vi khuẩn đã xuất hiện sau khi rửa 1 ngày. Ở nồng độ 500 mg/l thì 5 ngày sau khi rửa vi khuẩn phát triển trở lại và ở nồng độ 1000 mg/l thời gian này là 7 ngày. Tuy nhiên so với môi trường có bổ sung kháng sinh cefotaxim thì tốc độ lan rộng của dịch vi khuẩn trong môi trường có meropenem chậm hơn. Thời gian từ lúc xuất hiện những vết màu trắng đục đầu tiên ở vị trí mẫu cấy đến khi vi khuẩn lan khắp mặt thạch là khoảng 10 ngày. Điều này chứng tỏ meropenem có hiệu quả hơn cefotaxim trong việc ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn. Kết quả này cũng rất khác biệt so với kết quả của Bùi Lan Anh (2008) khi tác giả cho rằng việc sử dụng meropenem ở nồng độ 50 mg/l có khả năng diệt được chủng vi khuẩn này (chủng EHA101pIB- GUS) trên protocorm like body (PLB) của lan Hồ Điệp. Sự khác biệt này có thể là do đối tượng mẫu khác nhau dẫn đến sự bám dính của vi khuẩn trên bề mặt khác nhau và điều này ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả diệt khuẩn.
Tương tự, khi sử dụng kháng sinh ciprofloxacin ở nồng độ từ 50 – 500 mg/l cũng không ngăn chặn được hiện tượng tái nhiễm sau khi đồng nuôi cấy. Hà Trần Minh Dũng (2008) thực hiện đề tài chuyển gen vào cây đậu xanh sử dụng chủng khuẩn EHA101, sau khi sử dụng hai loại kháng sinh cefotaxim và meropenem diệt khuẩn sau đồng nuôi cấy không thành công đã chuyển sang sử dụng kháng sinh ciprofloxacin ở nồng độ 50 mg/l, rửa mẫu 3 lần, mỗi lần 20 phút đã giải quyết được hoàn toàn vấn đề tái nhiễm.
Bởi vì mỗi loại kháng sinh có cơ chế tác động lên sự sinh trưởng của vi khuẩn theo những cách khác nhau. Ở meropenem có khả năng diệt khuẩn bằng cách cản trở quá trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn, có phổ kháng khuẩn rộng với cả vi khuẩn kị khí và hiếu khí. Đối với cefotaxim tác động rất mạnh lên các loại vi khuẩn gram âm.
Ciprofloxacin có phổ kháng khuẩn rất rộng, ức chế enzym gryrase gây cản trở thông tin nhiễm sắc thể làm cho vi khuẩn giảm khả năng sinh sản.
Sau khi sử dụng các loại kháng sinh riêng lẻ không hiệu quả, chúng tôi đã kết hợp các loại kháng sinh với nhau theo các nghiệm thức như bảng 4.1 nhưng kết quả cũng không khả quan hơn, hầu hết khuẩn vẫn tái nhiễm sau từ 5 - 7 ngày nuôi cấy.
Bảng 4.1 Kết quả rửa mẫu với ba loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và
cyprofloxacin ở các nồng độ và thời gian khác nhau
Kháng sinh Nồng độ
(mg/l) Thời điểm tái nhiễm (sau khi rửa khuẩn) (ngày) Tỷ lệ mẫu tái nhiễm (%) Cefotaxim 100 1 100 200 1 300 2 500 3 700 5 1000 5 Meropenem 50 1 100 100 2 300 3 500 5 700 7 1000 7 Ciprofloxacin 50 1 100 100 1 300 3 500 5 Cefotaxim + Meropenem 500 500 7 100 Cefotaxim + Ciprofloxacin 500 200 5 100 Meropenem + Ciprofloxacin 200500 5 100 Cefotaxim + Meropenem + Ciprofloxacin 300 300 100 8 100
Trong thí nghiệm này, ba loại kháng sinh đã được sử dụng là meropenem của công ty Pymerpharco (Việt Nam), ciprofloxacin của Ba Lan, cefotaxim dạng muối sunfat của Ấn Độ. Có thể chất lượng các loại kháng sinh này không đảm bảo, lượng tá
dược quá cao, hàm lượng kháng sinh nguyên chất thấp hơn so với nồng độ định sẵn cũng là một nguyên nhân làm khả năng diệt khuẩn kém hiệu quả. Một nguyên nhân khác cũng có thể xảy ra là trong quá trình bảo quản, chủng khuẩn gốc bị tạp nhiễm với những loại vi khuẩn kháng kháng sinh có trong tự nhiên, mặc dù khuẩn lạc xuất hiện sau đồng nuôi cấy vẫn có hình dạng đặc trưng của khuẩn lạc Agrobacterium
nhưng rất có thể đã xảy ra hiện tượng liên kết giữa loại khuẩn này với Agrobacterium, và xảy ra hiện tượng trao đổi chéo hệ gen với nhau.
4.2. Tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen bar
4.2.1. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc trong vi khuẩn
Các khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường LB chọn lọc được tách chiết plasmid theo phương pháp ly trích bằng bộ Kit QIAprep spin. Sau đó kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc bằng cách tiến hành điện di trên gel agarose 1%. Kích thước của plasmid này là 8807bp.
Hình 4.1 Kết quả điện di plasmid pGII0229 từ vi khuẩn
A/ Kết quả điện di ; B/ Ladder, L: thang 1kb (O’GenerulerTM 1kb DNA ladder); Giếng 2, 3: plasmid; Giếng 1: đối chứng âm.
Kết quả giếng 2 và giếng 3 có 1 băng có kích thước 8807 bp so với kích thước thang chuẩn. Kết quả điện di cho thấy có sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc.
Mặt khác, để kiểm tra độ tinh sạch của plasmid sau ly trích. Chúng tôi tiến hành đo OD sản phẩm sau ly trích ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Kết quả thu được như bảng 4.2
A B
Bảng 4.2 Nồng độ plasmid ly trích từ vi khuẩn Agrobacterium chủng EHA101 Chủng vi khuẩn Nồng độ plasmid (ng/µl) Tỉ số A-260/A-280
EHA101 74,98 1,95
Một dung dịch acid nucleic được xem là tinh sạch (không bị tạp nhiễm với protein) khi tỷ số OD260 nm/OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. Kết quả trên cho thấy rằng lượng plasmid thu được từ quá trình ly trích nhiều và tinh sạch.
Từ những kết quả trên có thể kết luận khuẩn lạc dùng ly trích có chứa plasmid và có thể dùng plasmid này cho quá trình biến nạp.
4.2.2. Kết quả biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens GV3580
Biến nạp được gen mong muốn vào vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens là một bước quan trọng để tiến tới việc tạo dựng một hệ thống chuyển gen hoàn chỉnh. Chính vì thế, plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc đã được chúng tôi tiến hành biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủngGV3580 theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 (có sửa đổi). Vi khuẩn sau biến nạp được chọn lọc trên môi trường LB chọn lọc.
Qua hình 4.2 cho thấy vi khuẩn GV3580 đã phát triển tốt trên môi trường có chứa kháng sinh kanamycin (50 mg/l), khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của khuẩn lạc A. tumefaciens là tròn lồi, trắng đục, xuất hiện nhiều và đồng nhất, không có biểu hiện nhiễm tạp các loại vi khuẩn khác. Điều này cho thấy plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc đã được biến nạp vào dòng vi khuẩn GV3580.
Hình 4.2 Kết quả biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào
tế bào vi khuẩn GV3580 (B) và (A) không có plasmid.
Kiểm tra dòng Agrobacterium GV3580 mang plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen bar có trên plasmid pGII0229
Trgus cp148 luc. Sản phẩm của phản ứng khuếch đại gen bar là đoạn DNA có kích thước 748 bp.
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sự hiện diện của gen bar được kiểm tra bằng cách điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Dòng vi khuẩn kiểm tra có band điện di khoảng 750 bp so với thang chuẩn. Như vậy, có thể khẳng định dòng vi khuẩn đã được kiểm tra và cho kết quả dương tính trong thí nghiệm này này chắc chắn có mang vector pGII0229 Trgus cp148 luc chứa đoạn gen bar.
Hình 4.3 Kết quả của phản ứng PCR khuẩn lạc khuếch đại gen bar;
A/ Kết quả điện di ; B/ Ladder L: thang 1kb (O’GenerulerTM 1kb DNA ladder);Giếng 1: đối chứng âm; Giếng 2: sản phẩm khuếch đại
4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của cây
Jatropha in vivo
Xác định ảnh hưởng của hoạt chất chọn lọc đến đối tượng chuyển gen là rất cần thiết và cần phải được thực hiện trước khi quá trình chuyển gen được tiến hành. Xác định chính xác ngưỡng gây chết của chất chọn lọc giúp chúng ta chọn lọc được triệt để cây chuyển gen và tránh được hiện tượng dương tính giả.
Theo Lee và ctv (1997) nồng độ 2 mg/ml thuốc diệt cỏ PPT tác động lên sự nảy mầm và sinh trưởng của cây Agrostis stoloniferal L. và được chọn là nồng độ để chọn lọc cây chuyển gen ở thế hệ đầu và các thế hệ tiếp theo. Neskorodov và ctv (2009), khi nghiên cứu phát triển cây hướng dương chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ đã sử
C B
A
dụng thuốc diệt cỏ Basta ở nồng độ 2% để chọn lọc cây hướng dương chuyển gen in vivo. Kết quả của Lohar và ctv (2001) cho thấy PPT ở nồng độ 120 mg/l được sử dụng để chọn lọc cây Lotus japonicus chuyển gen.
Trong nghiên cứu này, bốn nồng độ PPT: 100; 200; 300; 400 mg/l đã được tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng lên quá trình sinh trưởng của cây Jatropha 3 tuần tuổi. Kết quả ghi nhận được sau 1 tuần phun PPT cho thấy so với nghiệm thức đối chứng, ở nồng độ 100 mg/l và 200 mg/l, cây Jatropha có phát triển chậm hơn, lá chỉ hơi vàng. Khi tăng nồng độ PPT lên 300 mg/l đã có sự ảnh hưởng khá rõ đến sự sinh trưởng của cây Jatropha 3 tuần tuổi. Một số biểu hiện như lá cây bắt đầu úa, vàng cây sinh trưởng chậm lại. Tuy nhiên cây vẫn sống được sau 1 tuần phun PPT (hình 4.4). Nồng độ PPT 400 mg/l hoàn toàn làm chết cây, sau 5 ngày phun thuốc, lá bắt đầu úa vàng, không có khả năng quang hợp. Đến 7 ngày sau, cây chết hoàn toàn. Điều này chứng tỏ ngưỡng nồng độ này có khả năng ức chế hoàn toàn và làm chết các cây. Vì vậy nồng độ PPT 400 mg/l đã được chúng tôi chọn làm nồng độ tối thiểu gây chết hoàn toàn cây
Jatropha 3 tuần tuổi không chuyển gen. Nồng độ này được lựa chọn để chọn lọc cây
Jatropha giả định chuyển gen sau này.
Hình 4.4 Kết quả thử PPT trên cây Jatropha 3 tuần tuổi; A. Cây xử lý ở nồng độ PPT 100 mg/l; B. Cây xử lý nồng ở độ PPT 300 mg/l; C. Cây xử lý ở nồng độ PPT 400 mg/l.
4.4. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vàomẫu phôi Jatropha mẫu phôi Jatropha
Sau 2 ngày đồng nuôi cấy mẫu với vi khuẩn, một số mẫu được chọn ngẫu nhiên đem tiến hành nhuộm GUS theo phương pháp của Jefferson và ctv (1987) được cải tiến bởi Jacobsen (2007) để đánh giá mức độ biểu hiện của gen chỉ thị gusA. Mẫu cho kết quả dương tính có hiện diện màu xanh chàm, mẫu âm tính có màu nâu hoặc trắng đục. Ngoài ra, quan sát vị trí biểu hiện GUS, độ đậm, độ lan của màu xanh chàm trên
A B C
mẫu để xác định được vị trí nào của mẫu dễ dàng cho vi khuẩn tấn công nhất. Các kết quả ghi nhận được trong thí nghiệm này như sau:
4.4.1. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôicấy lên hiệu quả chuyển gen cấy lên hiệu quả chuyển gen
Trong thí nghiệm này, yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen được xem xét là mẫu tiền nuôi cấy và mẫu không tiền nuôi cấy, hai loại mẫu này được xâm nhiễm với dịch khuẩn có bổ sung 100 µM acetosyringone, thời gian ngâm 30 phút. Kết quả ghi nhận từ thí nghiệm cho thấy tỷ lệ biểu hiện GUS sau 2 ngày đồng nuôi cấy ở mẫu tiền nuôi cấy đạt 66,67 %, trong khi mẫu không tiền nuôi cấy chỉ đạt 54,17 %.
Bảng 4.3 Kết quả biểu hiện GUS ở mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy
Mẫu Tỷ lệ mẫu biểu hiện GUS (%)
Mẫu đối chứng 0
Mẫu phôi không tiền nuôi cấy 54,17
Mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày 66,67
Khảo sát ảnh hưởng của mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy nhằm làm tăng khả năng tái sinh của những mẫu có mang tế bào đã được biến nạp thành công. Kết quả từ bảng 4.3 cho thấy mẫu tiền nuôi cấy 2 ngày có tỷ lệ biểu hiện GUS cao hơn so với không tiền nuôi cấy, mặc dù sự khác biệt này không quá lớn. Điều quan trọng là sức sống của mẫu sau khi xâm nhiễm khuẩn ở mẫu tiền nuôi cấy cao hơn nhiều so với mẫu không tiền nuôi cấy.
Hình 4.5 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi có tiền nuôi cấy và mẫu phôi không tiền nuôi
cấy; A. mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày, B. Mẫu phôi không tiền nuôi cấy; C. Đối chứng. Mũi tên đỏ chỉ vị trí biểu hiện GUS.
Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của He và ctv (2008) khi cho rằng thời gian tiền nuôi cấy tốt nhất cho hiệu quả biểu hiện GUS trên một số loại mẫu
Jatropha là 2 ngày. Điều này có thể được giải thích mẫu không được tiền nuôi cấy đang bị tổn thương, chưa có thời gian thích ứng kịp. Khi tiến hành xâm nhiễm mẫu, vi khuẩn phát triển nhanh hơn bao phủ bề mặt mẫu sẽ làm giảm sức sống. Các báo cáo