XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO CÂY Jatropha curcas L.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỊ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO CÂY Jatropha curcas L Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: TRẦN NGUYỄN NHƯ THỦY Niên khóa: 2011 – 2013 Tháng 01/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO CÂY Jatropha curcas L Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS BÙI MINH TRÍ TRẦN NGUYỄN NHƯ THỦY ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ Tháng 01/2013 LỜI CẢM ƠN Để trưởng thành đạt kết ngày hôm nay, trước tiên xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ba - Mẹ, anh hai em trai bên cạnh, động viên, cảm ơn đại Gia đình ln quan tâm, lo lắng cho con, điểm tựa lớn Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM tạo điều kiện cho em bốn năm học tập Trường Các Thầy - Cô dạy dỗ Q Thầy - Cơ thuộc Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học truyền đạt cho em kiến thức chuyên mơn bổ ích Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí quan tâm, tận tình bảo cho em định hướng đề tài, tạo điều kiện tốt cho em trình làm đề tài, người đường tận tâm cho em giai đoạn quan trọng đời Em xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ trực tiếp hướng dẫn tận tình, ln có lời khun em cần giúp đỡ lời động viên nhẹ nhàng giúp em vững tâm lúc em thấy thật khó khăn Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến người chị, người bạn, người hướng dẫn giúp đỡ em nhiều thời gian thực khóa luận Là người ln có mặt em cần giúp đỡ, từ lúc em bắt đầu làm quen với phòng thí nghiệm đến em hồn thành đề tài Em xin cảm ơn thầy Phạm Thành Hổ, viện Sinh Học Nhiệt Đới – thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ em em gặp khó khăn giai đoạn quan trọng để hoàn thành đề tài Cảm ơn anh, chị, bạn em làm việc với thời gian qua Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM hỗ trợ trình làm đề tài Cảm ơn tập thể lớp LT11SH nói chung người bạn phòng nói riêng cho kỷ niệm đẹp thời sinh viên quan tâm, động viên lúc làm đề tài i Em trân trọng giúp đỡ ban lãnh đạo Viện Thầy – Cô, Anh Chị làm việc Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học Môi Trường tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận Tp Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 12 năm 2013 Trần Nguyễn Như Thủy ii TÓM TẮT Jatropha curcas L đối tượng quan tâm nhiều nước giới Việt Nam khả ứng dụng việc phát triển nhiên liệu sinh học nhiều mục đích khác Đề tài: “Xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào Jatropha cursas L.” thực với mục đích xác định kỹ thuật phù hợp để chuyển nạp gen vào Jatropha Hạt giống Jatropha trồng vườn thực vật, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen Mẫu phôi Jatropha thu nhận từ hạt tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn A tumefaciens chủng EHA101 mang plasmid pGII0229 Trgus cp 148 luc Giáo sư Jacobsen (Đại học Tổng hợp Hannover, Đức) thiết kế Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen kháng sinh diệt khuẩn, nguồn mẫu, thời gian ngâm mẫu, thời gian đồng ni cấy khảo sát với mục đích tìm quy trình chuyển gen hiệu Kết cho thấy sử dụng kết hợp hai loại kháng sinh meropenem 50 mg/l cefotaxime 700 mg/l cho hiệu diệt khuẩn đạt 48 %, sử dụng riêng lẻ loại kháng sinh khơng có khả loại bỏ vi khuẩn cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm Kết bước đầu nhuộm GUS cho tỷ lệ dương tính thuốc thử X-gluc cao, tất nghiệm thức biến thiên từ 33,33 – 100% Thời gian đồng nuôi cấy ngày ngâm mẫu 30 phút cho biểu GUS đạt 100% ảnh hưởng đến sức sống mẫu Mẫu phôi tiền nuôi cấy ngày môi trường cảm ứng mô sẹo cho tỷ lệ biểu GUS (66,67%) cao so với mẫu phôi tiền nuôi cấy ngày môi trường (33,33%) mẫu phôi tiền nuôi cấy 20 ngày môi trường cảm ứng tạo phơi vơ tính Đồng thời nghiệm thức ảnh hưởng đến sức sống mẫu Tuy nhiên tất thí nghiệm mức độ biểu GUS không cao, phát biểu GUS phần ngồi rìa mẫu iii SUMMARY Jatropha curcas, a multipurpose, drought tolerant, perennial plant belonging to Euphorbiaceae family is considered as an important candidate for the production of biodiesel The use genetic engineering to transfer genes into Jatropha in order to improve agronomic traits is a new and promising method Present study was aimed to standardize some transformation conditions for Jatropha curcas L using Agrobacterium tumefaciens strain EHA 101 harboring vector pGII0229 Trgus cp148 luc, including bacteria antibiotic, preculture coditions, infection and co – cultivation time Embryo explants of Jatropha seeds were infected with Agrobacterium tumefaciens It was found that combination of meropenem and cefotaxime at the concentation of 50mg/l and 700 mg/l, respectively, was more effetive in disinfection of Agrobacterium (48 %) compared to using these individally which could not remove bacteria effectively and lead to re – infection Infection for 30 and co – cultivation of embryo explants with Agrobacterium for two days was found optimum (100 %) Preculture of embryo explants in callus regeneration medium for two days showed better results (66.67 %) as compared with four-day explants in the same medium (33.33 %) and after 20 days in somatic embryo regeneration medium 42.86 %) However, the GUS expression level was not high in all treatments The expression was only found in the surface of the explants iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT iii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT viiiii DANH SÁCH BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH x Chương MỞ ĐẦU i 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Jatropha curcas L 2.1.1 Đặc điểm thực vật học sinh lý Jatropha curcas L 2.1.2 Sự phân bố Jatropha curcas L 2.1.3 Các ưu điểm sinh học đáp ứng tiêu chí nhiên liệu sinh học Việt nam Jatropha curcas L 2.2 Sơ lượt phương pháp chuyển gen thực vật 2.2.1 Khái niệm chuyển gen thực vật 2.2.2 Thành phần gen chuyển nạp 2.2.2.1 Trình tự khởi động kết thúc phiên mã (Promoter terminator) 2.2.2.2 Gen thông báo (reporter gene) 2.2.2.3 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 2.2.3 Một số phương pháp chuyển nạp gen vào thực vật 2.2.3.1 Chuyển nạp gen phương pháp PEG (polyethylene glycol) 2.2.3.2 Chuyển nạp gen phương pháp sử dụng xung điện (electroporation) 2.2.3.3 Chuyển nạp gen phương pháp bắn gen (biolistic) v 2.2.3.4 Chuyển nạp gen phương pháp vi tiêm 2.2.3.5 Phương pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium với hỗ trợ sóng siêu âm – SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation) 2.3 Phương pháp chuyển gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium 10 2.3.1 Vi khuẩn Agrobacterium 10 2.3.1.1 Phân loại vi khuẩn Agrobacterium Error! Bookmark not defined 2.3.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10 2.3.1.3 Các thành phần Ti-plamid 12 2.3.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh thực vật vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình gen gián tiếp vi khuẩn Agrobacterium 14 2.4.1 Ảnh hưởng vật liệu gây nhiễm 15 2.4.2 Ảnh hưởng thành phần điều kiện môi trường 16 2.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 16 2.4.4 Ảnh hưởng ồng độ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thời gian lây nhiễm 17 2.4.5 Ảnh hưởng dòng vi khuẩn Agrobacterium 18 2.5 Các phương pháp kiểm tra chuyển gen dựa plasmid pGII0229 Trgus cp 148 luc 18 2.5.1 Phương pháp thử GUS 19 2.5.2 Phương pháp thử khả kháng thuốc diệt cỏ (PPT) tái sinh 19 2.6 Một số nghiên cứu nước chuyển gen Jatropha 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 3.2 Vật liệu thí nghiệm 23 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 3.2.2 Chủng vi khuẩn tái tổ hợp 23 3.2.3 Hoá chất thiết bị 23 3.2.3.1 Hoá chất 23 3.2.3.2 Thiết bị 23 vi 3.3 Phương pháp thí nghiệm 24 3.3.1 Phương pháp chuẩn bị dịch vi khuẩn, khử trùng hạt thu nhận mẫu phôi 25 3.3.1.1 Chuẩn bị dịch vi khuẩn 25 3.3.1.2 Khử trùng hạt 25 3.3.1.3 Thu nhận mẫu phôi 25 3.3.2 Thí nghiệm khảo sát khả diệt khuẩn loại kháng sinh meropenem cefotaxime lên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101 24 3.3.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn mẫu cấy đến khả chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 26 3.3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu thời gian đồng nuôi cấy đến khả chuyển gen vi khuẩn A.tumerfaciens 27 3.4 Xử lý số liệu 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết khảo sát khả diệt khuẩn hai loại kháng sinh cefotaxime meropenem 29 4.2 Kết phân tích ảnh hưởng nguồn mẫu cấy đến khả chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens 33 4.3 Kết ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu thời gian đồng nuôi cấy đến khả chuyển gen vi khuẩn A.tumerfaciens 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 vii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone PAT phosphinothricin acetyl transferase PEG polyethylene glycol IBA Indolebutyric acid BA 6-benzyl adenin NT Nghiệm thức Ti-plasmid Tumor-inducing plasmid vir Virulence OD Mật độ quang (Optical density) PPT DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid gusA β–glucuronidase X-gluc 5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide DNA Deoxiribonucleic Acid viii Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết đánh giá khả diệt khuẩn hai loại kháng sinh cefotaxime meropenem Sau đồng nuôi cấy mẫu phôi với vi khuẩn Agrobacterium, cần loại bỏ vi khuẩn đi, tạo điều kiện vô trùng cho mẫu cấy phát triển, tránh vi khuẩn làm chết mẫu cản trở trình tái sinh chồi mẫu Những tế bào chuyển nạp thành cơng phát triển thành chồi mà không bị yếu tố cản trở Trên đoạn T – DNA plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc đoạn gen tổng hợp sản phẩm kháng lại loại kháng sinh cefotaxime meropenem Đây hai loại kháng sinh sử dụng phổ biến để diệt khuẩn quy trình chuyển gen Vì chọn hai loại kháng sinh để làm kháng sinh diệt khuẩn Tuy nhiên, kháng sinh nhiều ảnh hưởng đến sức sống khả tái sinh mẫu cần tìm nồng độ kháng sinh diệt khuẩn hiệu đồng thời nồng độ mẫu cấy phát triển bình thường Bảng 4.1 Kết diệt khuẩn với hai loại kháng sinh cefotaxime meropenem nồng độ khác Nghiệm Loại thức kháng sinh NT1 Thời điểm tái Nồng độ nhiễm sử dụng (ngày sau (mg/l) rửa khuẩn) 300 500 NT3 700 NT4 40 70 100 NT2 NT5 Cefotaxime Meropenem NT6 NT7 Meropenem 50 Cefotaxime 700 29 Tỷ lệ mẫu tái nhiễm (%) 100 100 52 Kết khảo sát hiệu chủng loại nồng độ kháng sinh sử dụng bảng 4.1 cho thấy kháng sinh cefotaxim meropenem sử dụng riêng lẻ khơng có khả loại bỏ cách hiệu vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101pIB-GUS sử dụng thí nghiệm Điều chủng vi khuẩn tái tổ hợp sử dụng bị tạp nhiễm có trao đổi gen với chủng vi khuẩn kháng kháng sinh thời gian bảo quản Kết không phù hợp với kết báo cáo số nghiên cứu chuyển nạp gen Trong nhiều nghiên cứu, nồng độ Cefotaxime diệt khuẩn hiệu khuyến cáo từ 300 - 500 mg/l (Li ctv, 2007; 2006; He ctv, 2008; Jingli Pan ctv, 2010) Tuy nhiên, phạm vi thí nghiệm này, cefotaxim lại khơng có khả diệt vi khuẩn cách hiệu nồng độ trên, vi khuẩn xuất trở lại bề mặt môi trường sau 1-2 ngày rửa khuẩn Khi tiếp tục tăng nồng độ kháng sinh lên đến 700 mg/l mẫu tái nhiễm khuẩn 100% sau - ngày rửa khuẩn Đáng ý nồng độ kháng sinh 700mg/l, lượng lớn mẫu phơi bị hóa nâu chết sau ngày Điều nồng độ kháng sinh cao ảnh hưởng bất lợi đến sức sống ức chế trình tái sinh mẫu Với meropenem, vi khuẩn xuất trở lại bề mặt môi trường sau 2-4 ngày Kết khác biệt so với kết Bùi Lan Anh (2008) tác giả báo cáo việc sử dụng meropenem nồng độ 50 mg/l có khả diệt chủng vi khuẩn (chủng EHA101pIB-GUS) protocorm like body (PLB) lan Hồ Điệp Sự khác biệt đối tượng mẫu khác dẫn đến khả bám dính vi khuẩn bề mặt khác nhau, gây cản trở đến trình tiếp xúc kháng sinh vi khuẩn điều ảnh hưởng nhiều đến hiệu diệt khuẩn Nghiệm thức kết hợp hai loại kháng sinh bảng 4.1cho kết khả quan hơn, có lượng mẫu phơi định khơng tái nhiễm khuẩn (48%) Tuy nhiên, tỉ lệ mẫu diệt khuẩn chưa cao Mỗi loại kháng sinh có chế tác động lên sinh trưởng vi khuẩn theo cách khác Meropenem có khả diệt khuẩn cách cản trở trình tổng hợp thành tế bào vi khuẩn, có phổ kháng khuẩn rộng với vi khuẩn kị khí hiếu khí Trong cefotaxim tác động mạnh lên loại vi khuẩn gram âm Có thể mà kết hợp hai loại kháng sinh khả diệt khuẩn tăng lên đáng kể Dựa vào tỉ lệ tái nhiễm mẫu cấy nghiệm thức thấy nghiệm thức kết hợp hai loại kháng sinh meropenem nồng độ 50 30 mg/l cefotaxime nồng độ 700 mg/l cho tỉ lệ tái nhiễm thấp Nghiệm thức chọn để diệt khuẩn thí nghiệm Hình 4.1 Mẫu phơi sau 20 ngày diệt khuẩn theo công thức kết hợp meropenem 50 mg/l cefotaxime 700 mg/l 4.2 Kết phân tích ảnh hưởng nguồn mẫu cấy đến khả chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Thí nghiệm thực nhằm làm tăng khả tái sinh mẫu biến nạp thành công Sau nuôi cấy thời gian, mẫu bắt đầu tăng sức sống trước ủ chung với vi khuẩn Điều giúp tăng tỉ lệ mẫu sống sót môi trường chọn lọc Các báo cáo Sangwan cs, 1992; Michughen cs 1989 (trích dẫn He cs, 2008) cho mẫu trình tiền ni cấy kết hợp với phytohormones có môi trường xúc tiến phân chia tế bào Hoạt động phân chia tế bào có ảnh hưởng đến trình nhận sáp nhập T-DNA Vì thời điểm tốt cho vi khuẩn xâm nhiễm vào mẫu Tỉ lệ mẫu sống sót mơi trường chọn lọc tỉ lệ dương tính mẫu đại diện với thử nghiệm GUS trình bày bảng 4.2: 31 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nguồn mẫu cấy đến tỉ lệ mẫu sống môi trường chọn lọc dương tính với GUS Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu sống(%) Tỉ lệ biểu GUS(%) NT1 45,19 66,67 NT2 28,15 33,33 NT3 37,04 42,86 Sau chọn lọc mẫu môi trường bổ sung glufosinate mg/l, số mẫu chọn ngẫu nhiên đem tiến hành nhuộm GUS theo phương pháp Jefferson cs (1987) cải tiến Jacobsen (2007) để đánh giá mức độ biểu gen thị gusA Mẫu cho kết dương tính có diện màu xanh chàm, mẫu âm tính có màu nâu trắng đục Ngồi ra, quan sát vị trí biểu GUS, độ đậm, độ lan màu xanh chàm mẫu để xác định vị trí mẫu dễ dàng cho vi khuẩn công Kết ghi nhận từ thí nghiệm cho thấy mẫu tiền ni cấy ngày mơi trường cảm ứng callus có tỷ lệ biểu GUS (66,67 %) cao so với tiền nuôi cấy ngày môi trường (33,33 %) mẫu nuôi cấy 20 ngày môi trường cảm ứng tạo phơi vơ tính (42,86 %) Mơi trường ngâm mẫu với vi khuẩn môi trường đồng nuôi cấy nghiên cứu không bổ sung hợp chất phenolic (hợp chất đáp ứng vết thương thực vật) nên điều giải thích sau khoảng thời gian nuôi cấy 12 ngày, mô cấy có khả tự bảo vệ khỏi xâm nhiễm vi khuẩn so với mẫu vừa bị thương xâm nhiễm vi khuẩn chủ yếu dựa vào lúc thực vật bị thương Đồng thời tỉ lệ mẫu sống sót môi trường chọn lọc nghiệm thức (45,19 %) cao nghiệm thức lại (28,15 % 37,04 %) Điều giải thích mẫu phôi tiền nuôi cấy ngày môi trường 20 ngày môi trường tạo phôi vô tính phân chia nhiều, khối mơ xốp đồng thời tế bào dễ bị tổn thương hơn, kháng sinh sử dụng để rửa mẫu bổ sung vào môi trường nuôi cấy dễ dàng xâm nhập vào sâu mô tác động bất lợi đến sức sống mẫu 32 Kết cho thấy mẫu nuôi cấy 20 ngày môi trường tạo phơi vơ tính cho tỉ lệ dương tính với thử nghiệm GUS tỉ lệ mẫu sống sót môi trường chọn lọc cao mẫu nuôi cấy ngày môi trường tạo mô sẹo Kết thời gian ni cấy đủ dài để tế bào phơi vơ tính hình thành Dạng tế bào giúp DNA dễ dàng gắn kết vào gen tế bào làm tăng biểu GUS khả sống sót mơi trường chọn lọc Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Thu Trang (2012), He cs (2008) cho thời gian tiền nuôi cấy tốt cho hiệu biểu GUS gây ảnh hưởng đến sức sống mẫu số loại mẫu Jatropha ngày Tuy nhiên mức độ biểu GUS thí nghiệm thí nghiệm 3.3.3 thấp, màu xanh chàm phát phần ngồi rìa mẫu Kết ngun nhân khơng sử dụng hợp chất phenolic quy trình chuyển gen dẫn đến việc vi khuẩn khó chuyển nạp gen vào sâu bên mẫu Dựa vào tỷ lệ biểu GUS số lượng mẫu sống sau chọn lọc mơi trường có thuốc diệt cỏ, chúng tơi cho mẫu tiền nuôi cấy ngày môi trường cảm ứng callus cho hiệu chuyển nạp gen cao nghiệm thức chọn để làm nguồn vật liệu để khảo sát hai thông số thời gian ngâm mẫu thời gian đồng nuôi cấy 33 a c b d e Hình 4.3 Mẫu sau nuôi cấy môi trường chọn lọc Mẫu phôi tiền nuôi cấy ngày môi trường cảm ứng mô sẹo (a) đối chứng (d); Mẫu phôi tiền nuôi cấy ngày môi trường cảm ứng mô sẹo (c) đối chứng (e) ; mẫu phôi nuôi cấy 20 ngày môi trường cảm ứng phôi vô tính (b) 4.3 Kết ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu thời gian đồng nuôi cấy đến khả chuyển gen vi khuẩn A.tumerfaciens Thí nghiệm tiến hành với mục tiêu tăng thời gian tiếp xúc mẫu với vi khuẩn giai đoạn ngâm mẫu đồng ni cấy khả chuyển nạp gen vào tế bào thực vật vi khuẩn A.tumerfaciens tăng lên Kết từ bảng 4.3 cho thấy: đồng nuôi cấy mẫu ngày cho tỉ lệ sống tỉ lệ mẫu dương tính với GUS cao nghiệm thức đồng ni cấy ngày mẫu lại sống sót khơng thể diệt khuẩn Với thời gian đồng ni cấy ngày nghiệm thức ngâm mẫu 30 phút cho kết tốt với tỉ lệ sống 55,56% tỉ lệ dương tính với GUS lên đến 100% Nghiệm thức 34 ngâm mẫu 15 phút cho số lượng mẫu sống sót thấp (50,37%) tỉ lệ dương tính với GUS thấp nhiều (66,67%) Trong nghiệm thức ngâm mẫu 45 phút vi khuẩn bị tiêu diệt hoàn toàn kháng sinh dẫn đến chết mẫu Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống sót mơi trường chọn lọc tỉ lệ dương tính với thử nghiệm GUS mẫu phôi Jatropha Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ biểu GUS (%) NT1(Ngâm mẫu 15 phút đồng nuôi cấy ngày) 50,37 66,7 NT2(Ngâm mẫu 30 phút đồng nuôi cấy ngày) 55,56 100 NT3(Ngâm mẫu 45 phút đồng nuôi cấy ngày) 0,00 - NT4(Ngâm mẫu 15 phút đồng nuôi cấy ngày) 0,00 - NT5(Ngâm mẫu 30 phút đồng nuôi cấy ngày) 0,00 - NT6(Ngâm mẫu 45 phút đồng nuôi cấy ngày) 0,00 - Điều lý giải tăng thời gian tiếp xúc mẫu với vi khuẩn khả chuyển nạp gen vi khuẩn tăng lên Nhưng thời gian vi khuẩn tiếp xúc với mẫu lâu khả bám dính vi khuẩn lên bề mặt mẫu, xâm nhập vào vị trí vết thương, len lỏi vào bên mô xốp lớn Chính lý nên khả tiếp xúc tác động kháng sinh đến vi khuẩn bị hạn chế Dựa vào bảng 4.1 thấy khả diệt khuẩn nghiệm thức kháng sinh sử dụng chưa cao (48 %) Tỉ lệ dương tính với GUS đạt 100 % nghiệm thức số đấng nghi ngờ Có thể mẫu đem nhuộm GUS ngẫu nhiên (chọn mẫu xanh nhất) số lượng hạn chế (3 mẫu) nên tỉ lệ biêu GUS tương đối, có độ tin cậy thấp Vì cần dựa vào tỉ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc để đánh giá Dựa vào hai bảng bảng 4.2 4.3 thấy nghiệm thức ngâm mẫu 15 phút đồng nuôi cấy ngày thí nghiệm cho tỉ lệ dương tính với GUS tương đương với nghiệm thức tiền nuôi cấy mẫu ngày thí nghiệm 3.3.2 (66,67 %) (bảng 35 4.2) Vì mẫu chọn nhuộm GUS ngẫu nhiên nên tỉ lệ mang tính tương đối Tỉ lệ mẫu sống sót mơi trường chọn lọc phản ảnh xác hiệu chuyển nạp gen Tỉ lệ hai bảng có chênh lệch (45,19 % 50,37 %), điều sai khác thao tác lần tiến hành khác Sự ngẫu nhiên thử nghiệm GUS giải thích cho việc tỉ lệ sống sót chênh lệch tỉ lệ dương tính với GUS lại khác biệt nhiều hai nghiệm thức ngâm mẫu 15 30 phút với thời gian đồng nuôi cấy ngày Kết cho thấy nghiệm thức ngâm mẫu 30 phút đồng nuôi cấy ngày với vi khuẩn Agrobacterium nghiệm thức tối ưu 36 Hình 4.9 Mẫu phôi xâm nhiễm theo nghiệm thức ngâm mẫu 30 phút (a) 15 phút (b) với thời gian đồng nuôi cấy ngày sau chọn lọc 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu nhận được, rút số kết luận sau: - Vi khuẩn Agrobacterium chủng EHA101 loại bỏ hồn tồn khỏi mẫu mơ Jatropha sử dụng kháng sinh meropenem nồng độ 50 mg/l kết hợp với cefotaxime nồng độ 700 mg/l để rửa khuẩn bổ sung vào môi trường nuôi cấy Tỉ lệ mẫu diệt khuẩn 48 % - Mẫu phôi hạt Jatropha tiền nuôi cấy ngày cho kết tốt với tỷ lệ sống (45,19%) biểu GUS 66,67% , tốt mẫu phôi Jatropha tiền nuôi cấy ngày môi trường mẫu nuôi cấy môi trường cảm ứng tạo phơi vơ tính - Mẫu phơi Jatropha ngâm với dịch vi khuẩn 30 phút đồng nuôi cấy ngày có tỉ lệ sống 55,6% tỉ lệ biểu GUS 100%, cao mẫu ngâm với dịch khuẩn 15 phút thời gian đồng nuôi cấy - Trong phạm vi nghiên cứu này, mẫu phôi Jatropha ngâm với dịch khuẩn 45 phút thời gian đồng nuôi cấy ngày tất nghiệm thức gặp khó khăn vấn đề diệt khuẩn 5.2 Đề nghị - Cần tiếp tục xác định tìm loại kháng sinh nồng độ kháng sinh diệt vi khuẩn Agrobacterium sau đồng nuôi cấy hiệu cao - Tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen vào hạt nồng độ acetosyringone, chủng vi khuẩn tái tổ hợp, thời gian đồng nuôi cấy, v.v để tăng hiệu biến nạp gen - Tái sinh mẫu chọn lọc thành hoàn chỉnh, kiểm tra chuyển gen phương pháp PCR, theo dõi biểu ổn định gen chuyển hệ đầu hệ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang 2004 Di truyền phân tử Nhà xuất Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh, trang 473 – 526 Bùi Lan Anh 2008 Thử nghiệm chuyển gen lan hồ điệp (Phalaenopsis amabilis L.) phương pháp bắn gen Agrobacterium tumefaciens Luận văn thạc sĩ Sinh học Đại học Khoa học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Lê Trần Bình 2008 Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tp Hà Nội Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Hữu Hổ, Hà Trần Minh Dũng, Dương Thị Ngọc Thi 2012 Nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIAb vào cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.) phươnag pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tạp chí sinh học 34: 205-211 Lê Quốc Huy, Ngô Thị Thanh Huệ Nguyễn Thu Hương 2007 Nghiên cứu gây trồng phát triển Cọc rào (Jatropha curcas) Đề tài nghiên cứu Trung tâm Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Viện KHLN Việt Nam Lê Xuân Thao 2012 Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius) Luận văn Thạc sĩ ngành Vi sinh vật học Đại học Khoa học Tự nhiên, TP Hồ Chí Minh Mã Yến Thanh 2011 Thiết lập quy trình tái sinh in vitro đánh giá kết bước đầu chuyển nạp gen vào dầu mè (Jatropha curcas.L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Khóa luân tốt nghiệp kỹ sư Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh: Cao J., Zhang W., Klein T.M., Stanford J.S., R Wu 1990 Transformation of rice and maize using particle gun method Plant Gene Transfer Lamb C.J and Beachy R.N., 1990 Wiley Liss, New York pp: 21 – 23 Carvalho C H S., Zehr U B., Gunaratna N., Anderson J., Kononowicz H H., Hodges T K and Axtell J D 2004 Agrobacterium-mediated transformation of sorghum: factors that affect transformation efficiency Genetics and Molecular Biology 27: 259-269 10 Christou P., Ford T.L., and M Kofron 1991 Production of transgenic rice from agronomically important indica and japonica varieties via elwctric discharge 39 particle acceleration of exogenous genes into immatured zygotic embryos Bio Technology 16: 957 – 962 11 Li D D., W Shi and X X Deng 2003 Factors influencing Agrobacteriummediated embryogenic callus transformation of Valencia sweet orange (Citrus sinensis) containing the pTA29-barnase gene Tree Physiology 23: 1209–1215 12 de la Riva G.A., González-Cabrera J., Vázquez-Padrón R and Ayra-Pardo C., 1998 Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 13 Efendi, Kisawa H., Kanno A and Kam T 2000 Transformation of Soybean by Infecting Embryonic Calli With Agrobacterium tumeaciens and That of Soybean and Kidney Bean by Injecting the Bacteria into Germinating Ptant Biotech 17: 187 – 194 14 Jacobsen J H 2007 Modern technologies in plant biotechnology Genetic Engineering Manual for plant genetic engineering course Hannover University, 26 pages 15 Finer J J 2009 Plant nuclear transformation In: Genetic Modification of Plants Frank Kempken and Christian Jung Springer, Germany, pp: – 17 16 Lai E.M and Kado C I 1998 Processed VirB2 is the major subunit of the promiscuous pilus of Agrobacterium tumefaciens J Bacteriol 180: 2711–2717 17 Li M R., Li H Q., Jiang H W., Pan X P and G J Wu 2008: Establishement of an Agrobacterium-mediated cotyledon disc transformation method for Jatropha curcas Plant Cell Tiss Org Cult 92: 173–181 18 Valentine L 2003 Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics In Plant Physiology 133: 948-955 19 Liu Y., Yang H , and Sakanishi A 2005 Ultrasound: Mechanical gene transfer into plant cells by sonoporation Biotechnologu advantage 24: – 16 20 Liu Z., Jin B., Kanno A., and Kameya T 2005 The novel use of a combination of sonication and vacuum infiltration in Agrobacterium-mediated transformation of kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) with lea gene Molecular Breeding 16:189 – 197 21 Klevin T.M., Wolf E.D., Wu R., and Stanford J G 1987 High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells Nature 327: 70 40 22 Pan J., Fu Q and Xu Z F 2010 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of biofuel plant Jatropha curcas using kanamycin selection African Journal of Biotechnology 9: 6477-6481 23 Park S , 2006 Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation to tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaf disks; evaluation of the co cutivation conditions to increase β-glucuronudase gene activity Master thesis Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College 24 Kamal S., Manmohan S., Birendra S 2011 A reveiew on chemical and medicobiological applications of Jatropha curcas ISSN 2: 61 – 66 25 Gelvin S B 2003 Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the “Gene-Jockeying” Tool Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37 26 Trick H.N and Finer J J 1997 SAAT: Sonication Assisted Agrobacteriummediated Transformation Transgenic Research 6: 329 – 336 27 Trivedi S., Gaudani H., Gupta M., Gupta N., Patil P., Gupta G., Krishna V K., and Reddy M P 2009 Establishment of Agrobacterium-mediated genetic transformation in Jatropha curcas International Journal of Agriculture Sciences L 1: 11 – 20 28 Tsaftaris A S., Polidoros A N., Karavangeli M., Nianiou-Obeidat I 2000 Transgenic crops: recent developments and prospects In Biological Resource Management-Connecting Science and Policy Department of Genetics and Plant Breeding, Aristotle University of Thessaloniki, Greece, pp 187-203 29 Wahl N., Jamnadass R., Baur H., Munster C and Iiyama M 2009 Economic viability of Jatropha curcas L plantations in Northern Tanzania – Assessing farmers’ prospects via cost-benefit analysis World Agroforestry Centre ICRAF Working Paper no 97 30 Zong H., Wang S., Ouyang C., Deng X., Li L., Li J and F Chen 2010 Agrobacterium-mediated transformation of Jatropha curcas young leaf explants with lateral shoot-inducing factor (LIF) Int J Agric Biol 12: 891–896 41 PHỤ LỤC Mơi trường khống MS (Murashige Skoog, 1962) Đa lượng Hàm lượng(mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 Vi lượng H3BO3 6,2 MnSO4 4H2O 22,3 CoCl2 6H2 O 0,025 CuSO4 5H2O 0,025 ZnSO4 7H2 O 6,8 NaMoO4 H2O 0,25 KI 0.83 Sắt EDTA FeSO4 7H4O 27,8 Na2-EDTA 37,3 Vitamin Myo-Inositol 100 Thiamin-HCl 0,1 Nicotinic Acid 0,5 Glycine Pyridoxin-HCl 0,5 Môi trường LB (Luria-Bertani) Hàm lượng(g/l) Tryptone 10 Yeast extract NaCl 10 pH – 7,2 Agar 18 Bảng Số liệu dành cho xử lý thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng loại kháng sinh meropenem cefotaxime Mẫu NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 100 100 100 100 100 100 35 Tỷ lệ mẫu tái nhiễm (%) Lần lặp lại 100 100 100 100 100 100 57 100 100 100 100 100 100 52 Bảng Số liệu dành cho xử lý thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn mẫu lên hiệu chuyển gen Mẫu Mẫu phôi tiền nuôi cấy ngày Mẫu phôi tiền nuôi cấy ngày Mẫu phôi nuôi cấy 20 ngày Tỷ lệ mẫu biểu GUS (%) Lần lặp lại 69,18 68,81 66,3 29,57 34,17 37,92 50,00 36.62 43,77 Bảng Số liệu dành cho xử lý thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng mẫu thời gian ngâm mẫu thời gian đồng nuôi cấy lên hiệu chuyển gen Mẫu Mẫu phôi 15 phút ngày Mẫu phôi 30 phút ngày Tỷ lệ mẫu biểu GUS (%) Lần lặp lại 57,34 62,5 80,2 100 100 100 ... hạt, hướng cần thiết Đề tài Xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào Jatropha curcas L. thực với mục đích xác định điều kiện quy trình chuyển gen vào Jatropha cho hiệu biến nạp cao,... PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO CÂY Jatropha curcas L Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS BÙI MINH TRÍ TRẦN... Jatropha curcas L đối tượng quan tâm nhiều nước giới Việt Nam khả ứng dụng việc phát triển nhiên liệu sinh học nhiều mục đích khác Đề tài: Xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào