Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa lily sorbone nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Sau một quá trình thực hiện ñề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ của Viện cùng với sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, ñến nay tôi ñã hoàn thành xong ñề tài tốt nghiệp của mình. - Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh - Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp, cũng như thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------      ---------- HOÀNG TÙNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số : 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñều ñã ñược cảm ơn. Các thông tin, tài liệu trong luận văn này ñã ñược ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Hoàng Tùng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… ii LỜI CẢM ƠN Sau một quá trình thực hiện ñề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ của Viện cùng với sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, ñến nay tôi ñã hoàn thành xong ñề tài tốt nghiệp của mình. - Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh - Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện ñề tài tốt nghiệp, cũng như thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này. - Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn CNSH Thực vật - SHPT và CN Vi sinh ñã ñóng góp nhiều ý kiến giúp tôi thực hiện ñề tài. - Tôi xin chân thành cảm ơn Ks. Nguyễn Thị Thanh Phương, Ks. Hồ Thị Thu Thanh và toàn thể các cán bộ của Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã luôn giúp ñỡ tôi khi tôi thực hiện ñề tài tại Viện. Nhân ñây tôi xin trân trọng cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Nông học, Viện ðào tạo Sau ñại học cùng tất cả các thầy cô giáo, gia ñình và bạn bè ñã giúp tôi hoàn thành ñề tài này. Hà Nội, tháng 10 năm 2009 Tác giả Hoàng Tùng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CT Công thức 2,4 D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BA 6-Benzyllamino purine AS Acetosyringone TNC Tiền nuôi cấy ðNC ðồng nuôi cấy MS Murashige & Skoog, 1962 PPT DL - Phosphinotricine Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… iv MỤC LỤC 1. MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề .1 1.2. Mục ñích- yêu cầu . 2 1.2.1. Mục ñích: .2 1.2.2. Yêu cầu .2 1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học .2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật .3 2.1.1. Khái niệm về Kỹ thuật chuyển gen 3 2.1.2. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4 2.1.2.1. Cơ sở khoa học về khả năngchuyển gen ở thực vật .4 Một số nguyên tắc sinh học .4 2.1.2.2. Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen .5 2.1.2.3. Các bước cơ bản của chuyển gen 6 2.1.2.4. Các phương pháp xác ñịnh cây chuyển gen 8 2.1.3 Khả năng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 10 2.1.3.1. Ti-plasmid .12 2.1.3.2. Chức năng của T-DNA .12 2.1.3.3. Chức năng của gen Vir .14 2.1.3.4. Cơ chế lây nhiễm 17 2.1.3. Tiềm năng ñóng góp của cây trồng biến ñổi gen .21 2.1.4. Giá trị cây trồng biến ñổi gen trên toàn cầu .22 2.1.5 Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ñổi gen tại Việt Nam .23 2.1.5.1. Những chính sách và kế hoạch phát triển cây trồng biến ñổi gen ở Việt Nam .23 2.1.5.2.Nghiên cứu tạo cây trồng biến ñổi gen ở Việt Nam .23 2.2. Chuyển gen trên cây hoa lily .25 2.2.1. Giới thiệu về cây hoa lily .25 2.2.1.1 Nguồn gốc và phân loại .25 2.2.1.2 ðặc tính sinh vật học cây hoa lily .25 2.2.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế 26 2.2.2. Nghiên cứu tái sinh và chuyển gen ở cây hoa lily 27 2.2.2.1 Các nghiên cứu về cây hoa lily trên thế giới 27 2.2.2.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 29 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 30 3.1.1. ðối tượng .30 3.1.2. Vật liệu .31 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… v 3.1.3. ðịa ñiểm, thời gian 32 3.2. Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu .32 3.2.1. Các phương pháp nghiên cứu sử dụng: 32 3.2.2. Các chỉ tiêu theo dõi 34 3.2.3. Thí nghiệm 1: Thí nghiệm về xác ñịnh ngưỡng PPT chọn lọc 36 3.2.4. Thí nghiệm 2: Thí nghiệm về xác ñịnh nồng ñộ cefotacime diệt khuẩn .36 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. Ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT 39 4.2. Ảnh hưởng của kháng sinh Cefotacime ñến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh callus .41 4.3. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 42 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 43 4.5. Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 46 4.6. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 47 4.7. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 49 4.8. Ảnh hưởng của những véc tơ mang gen chuyển nạp 51 4.9. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào bằng phương pháp PCR 54 Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 57 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 4.1. Ả Ả n n h h h h ư ư ở ở n n g g c c ủ ủ a a c c h h ấ ấ t t c c h h ọ ọ n n l l ọ ọ c c P P P P T T ñ ñ ế ế n n t t ỷ ỷ l l ệ ệ s s ố ố n n g g v v à à k k h h ả ả n n ă ă n n g g t t á á i i s s i i n n h h c c ủ ủ a a m m ô ô c c a a l l l l u u s s L L i i l l y y i i n n v v i i t t r r o o 38 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kháng sinh Cefotacime ñến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh năng tái sinh callus lily “Sorbone” 40 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 42 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 43 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 45 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 47 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của phương thức lây nhiễm ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 49 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của các véc tơ chuyển gen nhiễm ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một khối u rất lớn hình thành trên thân cây hoa Hồng, B: một dãy khối u nằm trên nhánh của cây Nho 10 Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra 11 Hình 2.3 Quá trình tạo phức hợp sợi ñơn T-DNA 17 Hình 2.4 Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây 19 Hình 2.5 Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây 20 Hình 3.1. Sơ ñồ cấu trúc plasmid ITB2c 40 31 Hình 4.1 Ảnh hưởng Lily chết ở nồng ñộ PPT ñạt 5 mg/l 39 Hình 4.2. Biểu ñồ biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng ñộ PPT ñến khả năng tái sinh m m ô ô c c a a l l l l u u s s L L i i l l y y Sorbone 39 Hình 4.3. Biểu ñồ biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm mẫu ñến tỷ lệ sống sau lây nhiễm, sau chọn lọc và tỷ lệ mẫu tái sinh 44 Hình 4.4. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefasciens 48 Hình 4.5 Mẫu chuyển gen tái sinh chồi trên môi trường chọn lọc 51 Hình 4.6 Sự biểu hiện của gen Gus 52 Hình 4.7. Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của các dòng Lily Sorbone chuyển gen 54 Hình 4.8. Sơ ñồ thể hiện quy trình chuyển gen cho hoa Lily Sorbone 55 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Trong nhiều năm qua, hoa lily luôn ñược ñánh giá là một loại hoa cao cấp, có giá trị kinh tế cũng như giá trị xuất khẩu cao. Nhu cầu về loại hoa này trên thị trường hoa trong nước và trên thế giới là rất lớn. Vì thế, loại hoa này hiện ñang rất ñược quan tâm và chú trọng phát triển. Tuy nhiên ñiều kiện khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều của nước ta tạo ñiều kiện cho rất nhiều các loại sâu bệnh hại phát triển và ñây là một trong những yếu tố hạn chế chủ yếu ñến sản xuất nông nghiệp, trong ñó có cây hoa. Cùng với việc mở rộng diện tích và tăng cường về thành phần các giống hoa mới là sự kéo theo của hàng loạt các loại sâu bệnh hại làm giảm năng suất, phẩm chất, giá trị thẩm mỹ và thương phẩm của cây hoa. ðặc biệt, môi trường của các vùng trồng hoa bị ô nhiễm nghiêm trọng do người sản xuất sử dụng thái quá các thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Chính vì thế, việc chọn tạo ra các giống cây hoa có khả năng kháng sâu bệnh là một nhu cầu cấp thiết của thực tiễn. Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc ñưa vào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau, từ ñó chuyển ñược các gen mong muốn tạo ra các ñặc tính mới lạ (mầu sắc, cấu trúc hoa, hơng thơm, tuổi thọ của hoa cắm, các ñặc tính kháng sâu và bệnh hại, chống chịu với ñiều kiện bất thuận…) Chính vì vậy chúng tôi thực hiện ñề tài:“Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens” nhằm góp phần ñẩy mạnh hướng nghiên cứu về tạo giống cây trồng bằng kỹ thuật gen ở nước ta. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp…………… 2 1.2. Mục ñích- yêu cầu 1.2.1. Mục ñích: - Xác ñịnh các thông số kĩ thuật cho các bước trong qui trình chuyển gen mục tiêu nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens, làm cơ sở cho việc tạo cây chuyển gen mang các ñặc tính mong muốn. 1.2.2. Yêu cầu. - Xác ñịnh ñược nồng ñộ Cefotacime chọn lọc - Xác ñịnh ñược nồng ñộ PPT sử dụng ñể chọn lọc. - Xác ñịnh ñược phương pháp lây nhiễm vi khuẩn và thời gian ñồng nuôi cấy thích hợp. - ðánh giá sự biểu hiện của các gen sau chuyển nạp. 1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của ñề tài cho thấy khả năng có thể chuyển ñược gen vào cây hoa lily Sorbonne, một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. ðồng thời, các thông số kĩ thuật ñã xác ñịnh ñược sẽ làm cơ sở cho việc tiếp tục chuyển các gen mong muốn khác vào cây hoa lily Sorbonne nói riêng và các cây hoa lily nói chung. 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của ñề tài làm tiền ñề và thúc ñẩy việc ứng dụng một phương pháp mới là tạo giống cây trồng chuyển gen mang ñặc tính mong muốn trong công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa lily Sorbonne riêng ở Việt Nam. . tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào cây hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens” nhằm góp phần ñẩy mạnh hướng nghiên cứu.   ---------- HOÀNG TÙNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY HOA LILY SORBONE BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ