4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.9.Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển vào bằng phương pháp PCR
* Kết quả PCR cho các dòng loa Sorbonne chuyển gen
Các chồi Sorbonne sống ñược trên môi trường chọn lọc PPT ñược nhân nhanh và cắt lá ñể chiết tách DNA, tiến hành PCR. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi cho 35S promoter ñể phân tích DNA của một số chồi tái sinh thu ñược sau chọn lọc PPT chúng tôi có ñược kết quả 5/5 mẫu DNA chiết tách từ những chồi này cho tín hiệu khuếch ñại ñoạn khoảng 200bp (so với thang chuẩn M),
ñó là các dòng S1, S2, S3, S4, S5. Với mẫu ñối chứng âm (là mẫu DNA chiết tách từ lá cây Sorbonne không chuyển gen) không ghi nhận ñược sự khuyếch
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 55
vi khuẩn - TU) có kết quả dương tính. ðiều ñó chứng tỏ phản ứng PCR không bị ngoại nhiễm và cặp mồi sử dụng ñặc hiệu cho việc kiểm tra cây chuyển gen.
Hình 4.7. Kết quảñiện di sản phẩm PCR của các dòng lily Sorbonne chuyển gen
Như vậy, kết quả kiểm tra ñã chứng minh các dòng lily Sorbonne S1, S2, S3, S4, S5, S6 tái sinh sau chọn lọc có mang gen chuyển.
Trên cơ sở các kết quả có ñược trên chúng tôi ñề xuất quy trình chuyển gen Gus, gen Bar và gen Cry cho hoa loa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn
A.tumefaciens như sau :
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 56
Hình 4.8. Sơ ñồ thể hiện quy trình chuyển gen cho hoa lily Sorbonne
Tiền nuôi cấy 3-5 ngày
MS+30g/lsaccharose+0.7mg/lBA+0.3mg/l 2.4D, pH=5.8
Lây nhiễm với vi khuẩn Ngâm mẫu vào dd vi khuẩn 5 phút
ðồng nuôi cấy 3 ngày
MS (không có NH4NO3) + 20mg/l AS + 20g/l saccharose + 10g/l glucose + 10mM/l MES + 0.25mg/l BA + 1g/l cassamino acid + 700mg/l L-asparagine monohydrate + 700mg/l L- glutamine + 7g/l agar. pH = 6
Rửa khuẩn
Vi khuẩn ñược rửa bằng nước cất vô trùng hoặc môi trường MS vô trùng có bổ xung Cefotacime với nồng ñộ 500mg/l. Mẫu ñược rửa 2 – 3 lần, sau ñó rửa bằng nước cất vô trùng (hoặc MS vô trùng) 1 lần nữa
Cấy mẫu vào môi trường diệt khuẩn
MS + 0.25mg/l BA + 20g/l saccharose + 7g/l agar +500mg/l Cefotacime. pH = 5.8
Xác ñịnh sự biểu hiện gen
Gus tạm thời bằng nhuộm
X-gluc
Cấy vào môi trường chọn lọc
MS + 60g/l saccharose + 10g/l glucose + 0.25 mg/l BA + 5mg/l PPT + 7g/l agar. pH = 5.8
Xác ñịnh kết quả chuyển gen Tiền chồi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 57
Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Qua những thí nghiệm nghiên cứu chúng tôi rút ra những kết luận sau:
* Hoàn toàn có thể chuyển gen vào cây hoa lily Sorbonne bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N Nồnồnggññộ ộ55mmgg//llííttPPPPTTllàànnggưưỡnỡnggcchhọnọnllọcọccchhooccááccmmẫuẫuttiiềnềncchhồiồilliillyy S Soorrbboonnnneecchhuuyyểnểnggeenniinnvviittrroo. . N Nồnồnggññộ ộ550000mmgg//llííttCCeeffoottaacciimmeellàànnồnồnggññộ ộddiiệtệtkkhhuuẩnẩncchhooccááccmmẫuẫuttiiềnền c chhồiồilliillyySSoorrbboonnnneecchhuuyyểnểnggeenniinnvviittrroo. . T
Thhờiờiggiiaannttiiềnềnnnuuôôiiccấyấymmẫuẫupphhùùhhợpợpllàà33nnggààyy. . P
Phhưươnơnggpphhááppllââyynnhhiiễễmmtthhíícchhhhợpợpllààccắtắtmmẫuẫussaauuñóñóttiiềnềnnnuuôôiiccấyấy33 n
nggààyy, ,rrồiồillââyynnhhiiễmễmvvớiớivviikkhhuuẩnẩnbbằnằnggccáácchhnnggââmmttrroonnggddịcịchhvviikkhhuuẩnẩn55pphhúútt. . P
Phhưươnơnggtthhứcứcnnuuôôiiccấyấyttrroonnggggiiaaiiñoñoạnạnññồnồnggnnuuôôiiccấyấypphhùùhhợợppllààññồnồngg n
nuuôôiiccấyấymmẫuẫu vvớớiivviikkhhuuẩnẩnttrrêênnmmôôiittrrưườnờnggññồnồnggnnuuôôiiccấyấyttrroonnggtthhờiờiggiiaann33 n
nggààyy. .
5.2 ðề nghị
* Tiếp tục ñánh giá sự biểu hiện của gen chuyển vào bằng các kỹ thuật lai Southern Blot, Western Blot và các biotest ñể khẳng ñịnh sự biểu hiện ổn
ñịnh của các gen chuyển vào.
* Có thể áp dụng quy trình nêu trên ñể chuyển gen cho cây hoa lily Sorbonne nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tiếp tục nghiên cứu chuyển các gen triển vọng khác có các ñặc tính mới cho hoa loa kèn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước
1.Bùi Lan Anh và cs, Xây dựng quy trình biến nạp gen bar – Gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen, 2008. Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 11, số 01 – 2008.
2.Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang.- Di truyền phân tử những nguyên tắc cơ
bản trong chọn giống cây trồng. TP.HCM: Nông nghiệp, 1999
3.Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm, 2000. Giáo trình Sinh lý thực vật.
4.Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004 “Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp”.
5.Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Quang Thạch, 1996. Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa lily Sorbonne in vitro, in vivo và một số
phơng pháp bảo quản hoa cắt. Báo cáo tốt nghiệp.
6.Cao Ngọc Thuý, Hoàng Minh Tấn, 1997. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt
ñộ thấp ñến sinh trởng phát triển và hiệu quả kinh tế của hoa lily Sorbonne trắng. Luận án thạc sĩ.
7.Dương ðức Tiến, Võ Văn Chi. Giáo trình phân loại thực vật.
8.Trương Thu Thủy và cs, 2004. “Xây dựng quy trình tái sinh cây Bông bằng cách tạo ña chồi”, Tạp chí khoa học công nghệ.
9. Nguyễn Văn Uyển. Xây dựng hệ thống tái sinh và ứng dụng trong nghiên cứu tạo cây cải ngọt chuyển gen kháng sâu. Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN 2005
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 59
Tài liệu tiếng Anh
10.Binns, A.N., Costantino, P. 1998. The Agrobacterium oncogenes. In: The
Rhizobiaceae (Ed. Spaink, H., Kondorosi, A., Hooykaas, P.J.J. ).126-129 11.Y. Dessaux 1998. The Ti Plasmid of Agrobacterium tumefaciens Harbors
an attM-Paralogous Gene, aiiB, Also Encoding N-Acyl Homoserine (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lactonase Activity. American Society for Microbiology. 546-548
12. Gamborg, O. L. and G. C. Phillips. Laboratory facilities, operation, and
management. In Gamborg, O. L. and G. C. Phillips, editors. eds. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods. Springer. Berlin. 1995.
925-927.
13. Bains W. 2003. Biotechnology from A to Z. Oxford University Press, Inc. New York, USA. 587-589
14. Birch RG. 1997. Plant Transformation: Problems and strategies for practical applications. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology 48: 297- 326.
15.Chrispeels MJ and Sadava DE. 2003. Plants, Genes, and Crop Biotechnology. 2nd ed. Jones and Bartlett Publishers, Massachusetts, USA
156-157
16.Cutler SJ and Cutler HG. 2000. Biologically Active Natural Products: Pharmaceuticals. CRC Press LLC, USA.432-434
17.Ingo Potrykus, Zeng-yu Wang. Transgenic Plants of Tall Fescue (Festuca
arundinacea Schreb.) Obtained by Direct Gene Transfer to Protoplast.Bio/Technology 1991 923-927
18.James F. Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith and Peter Waterhouse. DNA fingerprints and cryopreservation of potato cultivars
for improved quality assurance. Final report (Horticultural Research &
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 60
19.Gelvin, Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. American society for microbiology. 2003
246- 248
20. Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology. Cambridge University Press, UK. 87-89
21.Ratledge C and Kristiansen B. 2002. Basic Biotechnology. Cambridge University Press, UK. 76- 78
22. Walker JM and Rapley R. 2002. Molecular Biology and Biotechnology. 4th Edition. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK. 156-158
23.Zhu 2000, A T-DNA Insertion Knockout of the Bifunctional Lysine-
Ketoglutarate Reductase/Saccharopine Dehydrogenase Gene Elevates Lysine Levels in Arabidopsis Seeds. American Society of Plant Physiologists. 645- 647
24.Ziemienowicz A; Merkle T; Schoumacher F; Hohn B; Rossi L
Import of Agrobacterium T-DNA into plant nuclei: two distinct functions of VirD2 and VirE2 proteins.The Plant cell 2001;13(2):369-83. 2001. 723-725
25.Ziemienowicz, 2001. Calf thymus Hsc70 and Hsc40 can substitute for DnaK and DnaJ function in protein renaturation but not in bacteriophage DNA replication. Zurich Open Repository and Archive. 324-326
PHỤ LỤC
Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
Thành phần Nồng ñộ Nồng ñộ dung dịch mẹ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 61
Khoáng ña lượng 20X
NH4NO3 1650 33000 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KNO3 1900 38000
CaCl2.2H2O(pha riêng) 440 8800
MgSO4.7H2O 370 7400 KH2PO4 170 3400 Fe-EDTA 100X FeSO4.7H2O 27,85 2780 Na2-EDTA.2H2O 37,25 3725 Khoáng vi lượng 100X MnSO4.4H2O 22,300 2230,0 ZnSO4.7H2O 8,600 860,0 H3PO4 6,200 620,0 KI 0,830 83,0 Na2MoO4.2H2O 0,250 25,0 CuSO4.7H2O 0,025 2,5 CoCl2.6 H2O 0,025 2,5 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU
BALANCED ANOVA FOR VARIATE TL S?NG FILE TGLN 31/ 8/** 7:54 --- PAGE 1
VARIATE V003 TL S?NG S?NG
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 62 1 CôNG THUC 2 12.0050 6.00251 0.16 0.856 3 * RESIDUAL 9 339.669 37.7410 --- * TOTAL (CORRECTED) 11 351.674 31.9704 ---
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE BOOK1 31/ 8/** 7:54 --- PAGE 2
MEANS FOR EFFECT CôNG TH?$
--- NHAC LAI NOS TL SONG
1 4 61.1950 2 4 59.9700 3 4 62.4200 SE(N= 4) 3.01769 5%LSD 9DF 9.82650 ---
ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE BOOK1 31/ 8/** 7:54 --- PAGE 3
F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CôNG TH?| (N= 12) --- SD/MEAN |$ |
NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TL S?NG 12 61.195 5.6542 6.1434 2.30 0.8555
BALANCED ANOVA FOR VARIATE SOCHOI5 FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12 --- PAGE 1
VARIATE V004 SOCHOI5 CHOIB CHOIB
LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CONGTHU$ 3 3.63862 1.21287 45.60 0.000 2 * RESIDUAL 8 .212801 .266001E-01 --- * TOTAL (CORRECTED) 11 3.85142 .350130 ---
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp……… 63
TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SO LIEU 31/ 8/** 8:12 --- PAGE 2
MEANS FOR EFFECT CONGTHU$
---