Vi khuẩn A. tumefaciens ựược tìm thấy ở trên và xung quanh bề mặt rễ. Nhưng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm ựược vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân. điều này có thể dễ dàng ựược chứng minh bằng các thắ nghiệm. Trong ựiều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn ựược dẫn dụ ựến vết thương nhờ các tắn hiệu hoá học. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang Ti-plasmid sẽ ựáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng nhận diện ựược các hợp chất phenolic tiết ra từ vết thương như acetosyringone (AS).
Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng ựộ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của Ti-plasmid là mã hoá cho các thụ thể
(receptor) nhận biết các hợp chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone ựóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. ở
nồng ựộ cao (10-5 Ờ 10-4 M) hơn nó sẽ kắch hoạt các gen vir trên Ti-plasmid (Deacon và ctv, 2005). Các gen vir ựược kắch hoạt tốt nhất ở nhiệt ựộ 25- 270C. Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt ựộng ổn ựịnh ở nhiệt
ựộ 18-200C (Gelvin, 2003).
Hình 2.3: Quá trình tạo phức hợp sợi ựơn T-DNA
Sau khi ựược kắch hoạt, các gen vir sẽựiều khiển quá trình tạo T-DNA sợi ựơn trong tế bào vi khuẩn (hình II.3). Quá trình tạo T-DNA sợi ựơn ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 18
thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1 và virD2 thực hiện. Sau ựó protein virD2 gắn vào sợi ựơn T-DNA ựể tạo thành phức hợp T- DNA. Ngoài virD1, virD2 người ta còn cho rằng virC1 và virC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi ựơn. Phức hợp T-DNA-virD2 cùng với protein virE2 ựược chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp ựược mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế bào chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục ựưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001).
Trong nhân tế bào cây, T-DNA ựược kết nạp vào bộ gen của cây (hình II.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây ựã ựược ựề nghị. Theo mô hình này, ựầu tiên ựầu 3Ỗ của T-DNA nhận diện các ựoạn tương ựồng với DNA của cây và gắn vào. Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang ựầu 3Ỗ của T-DNA ựều ựược enzyme nucleaz thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với virD2 tìm các ựoạn vi tương ựồng (microhomology) trên DNA của cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực ựiện tử của ựầu 5Ỗ ựến gần ựầu 3Ỗ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây ựược hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp ựoạn T- DNA dẫn ựến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 19
Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt
ựộng tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Ziemienowicz, 2001)[24]. Các opines ựược tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào ựược vi khuẩn biến dưỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opine trên Ti-plasmid. Tùy theo kiểu opine mà ựược chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001)[24].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 20
Khả năng chuyển nạp ựoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật, chuyển nạp gen thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium ngày càng ựược ứng dụng rộng rãi ựể chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng do có nhiều ưu
ựiểm so với các phương pháp chuyển nạp gen khác: gen ựược chuyển nạp gắn vào hệ gen cây một cách ựơn giản, hiện tượng tái sắp xếp lại của các gen ắt xảy ra, có ắt bản bản sao của gen ựược biến nạp tạo thuận lợi trong việc phân tắch cũng như biểu hiện gen mới trong cây chuyển gen (Zhang và ctv, 1988), các gen chuyển nạp duy trì bền vững qua các thế hệ sau. Trước ựây, phương pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do tin rằng
Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hai lá mầm. Sau này, người ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhưng nó
Hình 2.5: Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv, 2000)[23].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 21
có thể nhiễm vào cây một lá mầm. (Ziemienowicz, 2001). Trước ựây ựối với cây 1 lá mầm như lúa, phương pháp chuyển nạp gen nhờ vào vi khuẩn
Agrobacterium rất khó thành công. Tuy nhiên gần ựây công trình nghiên cứu của Hiei và Komari (1996) ựã minh chứng ựược hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium vào cây 1 lá mầm (lúa) cũng cao như ựối với cây 2 lá mầm.
2.1.3. Tiềm năng ựóng góp của cây trồng biến ựổi gen
Lý do thuyết phục nhất ựối với công nghệ sinh học mà cụ thể là cây trồng biến ựổi gen ựó là khả năng ựóng góp của chúng trong các lĩnh vực sau: - Nâng cao sản lượng cây trồng và do vậy góp phần ựảm bảo an ninh lương thực, thức ăn gia súc và chất xơ trên toàn cầu.
- Bảo toàn sựựa dạng sinh học do ựây là một công nghệ ắt tiêu tốn ựất có khả năng ựem lại sản lượng cao hơn.
- Sử dụng một cách có hiệu quả hơn các yếu tốựầu vào ựáp ứng yêu cầu phát triển bền vững nông nghiệp và môi trường
- Tăng khả năng ổn ựịnh sản xuất làm giảm những thiệt hại phải gánh chịu trong các ựiều kiện khó khăn.
- Cải thiện các lợi ắch kinh tế và xã hội và loại bỏ tình trạng ựói nghèo ở
các nước ựang phát triển.
Kinh nghiệm trong 13 năm ựầu tiên từ 1996-2008, trong ựó tổng diện tắch trên 800 triệu ha cây trồng biến ựổi gen ựã ựược trồng tại 25 nước trên toàn cầu, ựã ựáp ứng sự mong mỏi của hàng triệu hộ nông dân lớn và nhỏở cả
các nước công nghiệp và ựang phát triển. Năm 2008, ựã có bằng chứng cho thấy cây trồng CNSH ựược trồng thương mại hóa tiếp tục ựem lại các lợi ắch
ựáng kể về mặt kinh tế, môi trường và xã hội cho các hộ nông dân lớn và nhỏ ở các nước ựang phát triển, diện tắch trồng cây biến ựổi gen trên toàn cầu tiếp tục tăng trên 10%, mức tăng hàng năm là hai con số. Số hộ nông dân thu lợi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 22
từ cây trồng CNSH ngày càng nhiều và ựạt 13,3 triệu người năm 2008, tăng so với 7 triệu của năm 2003. đáng chú ý là trong năm 2008, trên 90% hay 12,3 triệu người trồng này thu lợi từ cây trồng CNSH là các nông dân nghèo trồng bông Bt, chủ yếu ở 9 tỉnh của Trung Quốc và nông dân nghèo ở
Makhathini Flats, thuộc tỉnh KwaZulu Natal của Nam Phi.
2.1.4. Giá trị cây trồng biến ựổi gen trên toàn cầu
Trong tổng số lợi ắch về mặt kinh tế trị giá 44 tỷ USD thu ựược trong suốt quãng thời gian 1996 Ờ 2007, 44% là do gia tăng năng suất ựem lại và 56% là do việc giảm chi phắ sản xuất ựem lại (bao gồm 359.000 tấn thuốc trừ
sâu tiết kiệm ựược); sản lượng tăng thêm 141 triệu tấn, sẽ phải cần ựưa thêm vào sử dụng 43 triệu hecta trồng cây thông thường và do vậy ựây là một công nghệ tiết kiệm ựất.
Ở các nước ựang phát triển ựang chuyển ựổi và dựa vào nông nghiệp, cây trồng sinh học là ựộng lực của tăng trưởng kinh tế nông thôn, ựồng thời góp phần ựáng kể vào sự tăng trưởng kinh tế quốc gia.
Hơn một nửa (55%) dân số thế giới sống tại 25 quốc gia, nơi trồng 125 triệu hecta cây trồng sinh học năm 2008, tương ựương 8% của 1,5 tỷ hecta ựất trồng trọt trên toàn thế giới. Trong năm 2007, cây trồng sinh học ựã tiết kiệm 14,2 tỷ kg khắ CO2, tương ựương mức tiết kiệm sử dụng của 6,3 triệu xe ôtô.
Nhu cầu cấp thiết hiện nay là các hệ thống quảng lý nhanh chóng/ chi phắ hiệu quả cho cây trồng sinh học, hệ thống có trách nhiệm, không gây phiền hà và chi phắ không quá tốn kém ựối với các nước ựang phát triển. 25 nước ựã cho phép trồng cây công nghệ sinh học và 30 quốc gia khác ựã cho phép nhập khẩu các sản phẩm công nghệ sinh học sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, ựưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng công nghệ sinh học lên 55 nước.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 23
Trị giá toàn cầu của thị trường cây trồng sinh học trong năm 2008 là 7,5 tỷ USD với tổng giá trị tắch luỹựạt 50 tỷ USD từ năm 1996 ựến 2008.
2.1.5 Tình hình chung về phát triển cây trồng biến ựổi gen tại Việt Nam
2.1.5.1. Những chắnh sách và kế hoạch phát triển cây trồng biến ựổi gen ở
Việt Nam
-Quyết ựịnh 18/CP, 1994 về công nghệ sinh học, xếp CNSH vào hàng
ưu tiên cho nghiên cứu triển khai chỉ sau công nghệ thông tin -Chỉ thị 50 TW, 2005 của ban bắ thư Trung ương đảng -Kế hoạch hành ựộng quốc gia về CNSH năm 2005
-Các chương trình CNSH trong nông nghiệp, y tế, công nghiệp, thuỷ sản -Chương trình phát triển hệ thống quy chế quản lý an toàn sinh học sinh vật biến ựổi gen.
-Giai ựoạn 2006-2010 Ờ Thử nghiệm một số giống cây trồng biến ựổi gen trên ựồng ruộng
-Giai ựoạn 2011-2015 Ờ ựưa một số giống cây trồng biến ựổi gen vào sản xuất.
-đến 2020 diện tắch một số cây trồng biến ựổi gen (bông, ngô, ựậu tương) ựạt 30-50%.
2.1.5.2.Nghiên cứu tạo cây trồng biến ựổi gen ở Việt Nam
đứng trước những cơ hội và thách thức trước khi hội nhập kinh tế khu vực, các nhà khoa học nước ta ựã bắt kịp trào lưu cũng như kỹ thuật thao tác, xác lập ựược công nghệ mũi nhọn trong tạo giống cây trồng bằng biến ựổi tắnh di truyền theo hướng có lợi.
Qua nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học của Việt Nam ựã thực hiện biến ựổi gen thành công cho một số giống cây trồng. đó là chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và hoàn thiện hệ thống tái sinh giống khoai mì K140-2 có hàm lượng tinh bột cao, giàu protein, kháng sâu bệnh, kháng thuốc trừ cỏ (Bùi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 24
Lan Anh và cs 2008)[1]. Việc chuyển nạp gen và tạo dòng ựậu tương biến ựổi gen kháng sâu ựược TS Trần Thị Cúc Hòa tiến hành bằng phương pháp nốt lá mầm lây nhiễm với vi khuẩn thực hiện trên 4 giống ựậu tương trong ựó có 2 giống ựang trồng ở Việt Nam. Kết quả, trong 91 giống ựã xác ựịnh ựược các giống có tiềm năng sử dụng ựược trong chuyển nạp gen ựậu tương (gồm 5 giống ựậu tương ựang trồng ở Việt Nam và 3 giống nhập nội).
Cũng theo TS Trần Thị Cúc Hòa, ba giống lúa IR64, MTL250 (indica) và Taipei 309 (japonica) ựược chuyển nạp với các vectơ pCaCar và pFun3 mang gen psy và crtI ựiều khiển lộ trình tổng hợp isoprenoid ựể tạo ra một số
vi chất dinh dưỡng, bằng phương pháp sử dụng Agrobacterium và hệ thống chọn lọc mannose. Kết quả ựã tạo ra các dòng lúa biến ựổi gen chứa carotenoid, trong ựó hợp phần chủ yếu là (- carotene (tiền vitamin A) có hàm lượng cao, trong khi giống ựối chứng không biến ựổi gen hoàn toàn khộng có carotenoid. điều ựặc biệt là các dòng biến ựổi gen với véctơ pCaCar, hạt gạo biểu hiện cả (-carotene và các hợp chất vitamin E (tocopherols) vì ở nội nhũ
của hạt gạo non có sự hiện diện của geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất quan trọng trong tiến trình sinh tổng hợp (-carotene cũng như các hợp chất vitamin E. Ngoài ra trong một số dòng lúa biến ựổi gen còn thấy chất (-oryzanol, là chất chống oxyt hóa có vai trò còn quan trọng hơn cả
vitamin E gia tăng ựáng kể. Phương pháp chuyển gen ựược áp dụng ở nghiên cứu này còn cho phép tuyển chọn các dòng biến ựổi gen sạch, khắc phục mối lo ngại về an toàn sinh học ựối với cây biến ựổi gen.
Chuyển gen Bt kháng sâu vào cây ngô bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ựể tạo ra các dòng ngô có khả năng kháng sâu cao. Quy tụ thành công ba gen. kháng nấm ựạo ôn và ựưa gen kháng ruồi ựục thân GM2, GM4t, GM7 vào các giống lúa có tiềm năng năng suất cao. Chuyển gen Bt kháng sâu và gen liên quan ựến tắnh chống chịu mặn vào cây thuốc lá...
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệpẦẦẦ 25
Từ năm 2010 trở ựi, việc ứng dụng cây trồng chuyển gen vào sản xuất trên ựồng ruộng là cần thiết. Bởi lúc ựó, công nghệ sinh học sẽ là công nghệ
nền, giải quyết vấn ựề năng suất, chất lượng cây trồng, nhằm bảo ựảm an ninh lương thực quốc gia và hội nhập kinh tế khu vực. Vì vậy, các nhà khoa học kiến nghị Nhà nước sớm ban hành Luật An toàn sinh học. Tiếp tục ựầu tư dứt
ựiểm và hoàn thiện quy chế hoạt ựộng của các phòng thắ nghiệm trọng ựiểm quốc gia. Nâng cao chất lượng quy hoạch và ựào tạo cán bộ khoa học. Tăng cường hợp tác quốc tế trong lĩnh vực mới mẻ nhưng ựem lại hiệu quả kinh tế
cao này.
2.2. Chuyển gen trên cây hoa lily2.2.1. Giới thiệu về cây hoa lily 2.2.1. Giới thiệu về cây hoa lily
2.2.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên, Mỹ
và một số nước khác. Hoa lily ựã ựược nghiên cứu và thuần hóa gần 100 năm nay từ các loài hoang dại phân bố ở hầu hết các châu lục từ 100 ựến 600 vĩ bắc, ựặc biệt là những vùng có khắ hậu ôn ựới và lạnh, hoặc ở những vùng núi cao từ
1200m trở lên của các vùng nhiệt ựới như Trung Quốc, ấn độ, Indonexia, Việt Nam ...
Trong hệ thống phân loại thực vật, cây hoa lily ựược xếp vào nhóm cây một lá mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Liliidae), bộ hành (Liliales), họ
hành (Liliaceae), chi Lilium (Dương đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978)[7].
2.2.1.2 đặc tắnh sinh vật học cây hoa lily
Lily là cây thân thảo lâu năm, thân cao từ 50-200cm, thân dạng hành có vảy, phần dưới mặt ựất gồm thân vẩy, rễ và phần trên mặt ựất gồm lá, thân: * Thânvẩy là phần phình to của các vẩy củ tạo thành, trên ựĩa thân vẩy có vài chục vẩy hợp lại, phắa ngoài không có màng bao bọc nên gọi là thân